朱文，王傳翠，張雨晴，蔣敬庭，王智剛

(蘇州大學(xué)附屬第三醫(yī)院a.呼吸內(nèi)科,b.腫瘤生物診療中心，江蘇省腫瘤免疫治療工程技術(shù)研究中心，蘇州大學(xué)細(xì)胞治療研究室，江蘇常州 213003)

·研究生園地·

LMTK3對(duì)人肺癌A549細(xì)胞生物學(xué)功能的影響*

朱文a，王傳翠a，張雨晴a，蔣敬庭b，王智剛a

(蘇州大學(xué)附屬第三醫(yī)院a.呼吸內(nèi)科,b.腫瘤生物診療中心，江蘇省腫瘤免疫治療工程技術(shù)研究中心，蘇州大學(xué)細(xì)胞治療研究室，江蘇常州 213003)

目的 探討Lemur酪氨酸激酶3(LMTK3)在人肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549中表達(dá)下調(diào)后對(duì)細(xì)胞生物學(xué)功能的影響。方法 采用shRNA(small hairpin RNA)技術(shù)干擾A549細(xì)胞中LMTK3的表達(dá)并用RT-PCR對(duì)其進(jìn)行鑒定，采用細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)、劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell實(shí)驗(yàn)及流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)LMTK3對(duì)肺癌細(xì)胞增殖、遷移、細(xì)胞周期及凋亡等生物學(xué)行為的影響。結(jié)果 通過(guò)shRNA技術(shù)成功構(gòu)建LMTK3表達(dá)下調(diào)的肺癌細(xì)胞系shLMTK3及對(duì)照組Scramble。細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在培養(yǎng)24、48、72 h后，shLMTK3組細(xì)胞的增殖水平(0.305±0.018，0.461±0.044，0.74±0.029)明顯低于Scramble組(0.354±0.011，0.551±0.027，0.881±0.028)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t分別為5.24，3.91，7.70,P均<0.01)；劃痕試驗(yàn)結(jié)果表明，劃痕24 h后的shLMTK3組細(xì)胞相對(duì)倍數(shù)(0.51±0.096)明顯低于Scramble組(1.00±0.029)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.81,P<0.01)；Transwell遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，shLMTK3組遷移到膜下的細(xì)胞數(shù)[(161±9.29)個(gè)]明顯低于Scramble組[(308.66±17.60)個(gè)]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=7.42,P<0.01)；細(xì)胞周期檢測(cè)結(jié)果顯示，抑制LMTK3的表達(dá)可將細(xì)胞阻滯于G1期(t=4.35，P<0.05)；細(xì)胞凋亡試驗(yàn)顯示，抑制LMTK3的表達(dá)對(duì)A549細(xì)胞的凋亡率無(wú)影響。結(jié)論 下調(diào)A549細(xì)胞中LMTK3的表達(dá)可明顯抑制細(xì)胞的增殖及遷移能力，提示肺癌細(xì)胞異常表達(dá)LMTK3參與調(diào)節(jié)其腫瘤生物學(xué)行為。

Lemur酪氨酸激酶3；A549；增殖；遷移；周期

Lemur酪氨酸激酶3(lemur tyrosine kinase 3，LMTK3)屬于絲-蘇-酪氨酸激酶家族，為酪氨酸激酶的一個(gè)亞型，是一種乳腺癌內(nèi)分泌治療的耐藥蛋白[1]。研究發(fā)現(xiàn)，LMTK3可以促進(jìn)乳腺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移，與乳腺癌的不良預(yù)后相關(guān)[2]。另有研究表明，LMTK3在胃癌、腸癌、肺癌等多種腫瘤患者的血清和組織中高表達(dá)，且可以作為非小細(xì)胞肺癌不良預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[3-6]。本實(shí)驗(yàn)旨在構(gòu)建針對(duì)人

LMTK3 mRNA的短發(fā)卡RNA(shRNA)表達(dá)載體，與慢病毒包裝輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染人胚293T細(xì)胞后，收集上清，感染人肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549并篩選出穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，觀察其對(duì)肺癌細(xì)胞增殖、遷移能力的影響，以期進(jìn)一步闡明LMTK3在肺癌發(fā)生、發(fā)展中的作用。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系、試劑及儀器 人胚腎細(xì)胞系293T、人肺腺癌細(xì)胞A549購(gòu)自美國(guó)典型微生物菌種保藏中心(ATCC)，均由本實(shí)驗(yàn)室保存，大腸埃希菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α、DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，慢病毒表達(dá)載體pSPAX2、pMD2G、pLVX-shRNA1、Plvx-LMTK3-shRNA均由Clontech公司構(gòu)建。青霉素、鏈霉素、CCK8(美國(guó)Sigma公司)；Trizol試劑(美國(guó)Invitrogen公司)；PrimeScriptRTreagent Kit、SYBR Premix Ex Taq(大連TaKaRa公司)；Transwell小室(美國(guó)Corning公司)；碘化丙啶(PI)染料(美國(guó)Sigma公司)，Annexin V-FITC(美國(guó)BD公司); NanoDrop超微量分光光度計(jì)(美國(guó)Thermo Thermo公司)。

1.2 LMTK3-shRNA慢病毒載體的構(gòu)建 293T細(xì)胞接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待細(xì)胞融合度達(dá)80%～90%時(shí)，用于轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。包裝前1 h更換為新鮮且無(wú)雙抗的DMEM高糖培養(yǎng)基。將LMTK3 shRNA的慢病毒表達(dá)載體pLVX-shRNA1(10 μg)與輔助質(zhì)粒psPAX2(10 μg)、pMD2G(10 μg)加入200 μL無(wú)血清且無(wú)雙抗的新鮮DMEM中渦旋振蕩混勻，隨后加入56 μL Fugene轉(zhuǎn)染試劑，立即渦旋振蕩混勻10 s，室溫靜置15 min，將混合物共轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染24～48 h后，收集病毒上清，以0.45 μm濾器過(guò)濾，于40 mL超速離心管中，4 ℃、72 000 r/min離心120 min，500 μL PBS重懸病毒沉淀，置于4 ℃保存。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)和細(xì)胞轉(zhuǎn)染 取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的人肺腺癌細(xì)胞A549用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基于5% CO2、37 ℃、飽和濕度條件下培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)分為shLMTK3組(轉(zhuǎn)染LMTK3干擾慢病毒載體的A549細(xì)胞)和Scramble組(感染空載體的A549細(xì)胞)。將A549細(xì)胞接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔接種5×105個(gè)細(xì)胞，在shLMTK3組和scramble組分別加入相應(yīng)的病毒上清(MOI=10)，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h后換液，48 h后加入2 μg/mL嘌呤霉素篩選穩(wěn)定干擾LMTK3表達(dá)的靶細(xì)胞，72 h后部分細(xì)胞開始死亡，每d 換液1次，持續(xù)至細(xì)胞融合度達(dá)70%時(shí)，用2.5 g/L胰蛋白酶消化并傳代，傳代后持續(xù)加2 μg/mL嘌呤毒素維持1周時(shí)間。

1.4 RNA提取及逆轉(zhuǎn)錄 分別收集shLMTK3組、Scramble組細(xì)胞約5×105個(gè)，加入1 mL Trizol試劑提取總RNA，并用NanoDrop超微量分光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度和純度，取吸光度(A260/280 nm)為1.8～2.0的樣本，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書操作將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，樣本置-20 ℃保存。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，并送上海生工公司合成，各引物序列見(jiàn)表1。qRT-PCR反應(yīng)體系：5 μL SYBR Green PCR Master Mix,10 μmol/L上、下游引物各0.2 μL，cDNA 4 μL，無(wú)菌ddH2O補(bǔ)足至10 μL。循環(huán)參數(shù)：95 ℃預(yù)變性5 min; 95 ℃ 10 s，60 ℃ 20 s,72 ℃ 20 s，共50個(gè)循環(huán)。使用StepOneTM軟件在72 ℃時(shí)采集熒光信號(hào)，并進(jìn)行熔解曲線分析，以GAPDH為內(nèi)參照，用2-ΔΔCt法計(jì)算LMTK3 mRNA的相對(duì)表達(dá)水平，公式：ΔCt=Ct目的基因-CtGAPDH;ΔΔCt =ΔCt待測(cè)組-ΔCt對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

表1 RT-PCR引物序列及產(chǎn)物片段大小

1.6 CCK8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的shLMTK3組和Scramble組穩(wěn)定的細(xì)胞系，用2.5 g/L胰蛋白酶消化后，高糖DMEM培養(yǎng)基稀釋成2×104/mL，在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中每孔加入100 μL，實(shí)驗(yàn)設(shè)3個(gè)復(fù)孔，每組接種4塊96孔細(xì)胞培養(yǎng)板。于培養(yǎng)24、48、72 h后每孔加入10 μL CCK8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)3 h后用酶聯(lián)儀測(cè)定在450 nm處的吸光度(A450 nm)值，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，A450 nm值為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

1.7 劃痕實(shí)驗(yàn) 取shLMTK3組和Scramble組細(xì)胞(1×105個(gè))，2.5 g/L胰蛋白酶消化后接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，37 ℃、5% CO2過(guò)夜培養(yǎng)，形成均勻的單細(xì)胞層。使用無(wú)菌200 μL槍尖于單細(xì)胞層上垂直、均勻快速的劃過(guò)培養(yǎng)皿底部，保持劃痕寬度一致。PBS洗滌3次，洗去劃痕產(chǎn)生的細(xì)胞碎片，加入無(wú)血清培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2條件下常規(guī)培養(yǎng)。于0、24 h時(shí)觀察、拍照并測(cè)量劃痕寬度。

1.8 Transwell實(shí)驗(yàn) 用無(wú)血清培養(yǎng)基將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期shLMTK3組和Scramble組的細(xì)胞配制成單細(xì)胞懸液，按每孔5×105/mL的細(xì)胞密度接種100 μL于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中的Transwell小室的上室。下層小室內(nèi)加入600 μL含20%胎牛血清的DMEM，并確保無(wú)氣泡。于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h,取出Transwell小室，棄去孔中培養(yǎng)液， PBS洗滌2次，甲醛固定30 min，將小室風(fēng)干。0.1%結(jié)晶紫染色20 min，用濕潤(rùn)的棉簽輕輕擦掉上層未遷移細(xì)胞，PBS洗滌3次。倒置顯微鏡觀察，每組隨機(jī)選取3個(gè)視野，計(jì)數(shù)穿過(guò)膜的細(xì)胞數(shù)，計(jì)算平均值。

1.9 PI單染法測(cè)定細(xì)胞周期 細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h后，2.5 g/L胰蛋白酶消化并收集shLMTK3組和Scramble組細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗滌2次，重懸于預(yù)冷的70%乙醇(1×106/mL),4 ℃固定過(guò)夜。取100 μL細(xì)胞懸液(1×105個(gè)細(xì)胞)與500 μL PI染液充分混勻，4 ℃避光溫育30 min，上流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞周期。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.10 FITC雙染法測(cè)定細(xì)胞凋亡 細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h后，用不含EDTA的2.5 g/L胰蛋白酶消化并收集shLMTK3組和Scramble組細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗滌2次，重懸于1×binding buffer(1×106/mL)。取100 μL細(xì)胞懸液(1×105個(gè)細(xì)胞)與5 μL Annexin V-FITC和3 μL PI充分混勻，室溫避光溫育15 min。再加入400 μL 1×binding buffer,上流式細(xì)胞儀測(cè)定凋亡細(xì)胞百分比。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)LMTK3 mRNA表達(dá)水平 結(jié)果顯示，shLMTK3組LMTK3 mRNA的表達(dá)水平(1.00±0.078)低于Scramble組(0.18±0.023)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=10.05，P<0.01)。表明慢病毒轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞后可抑制LMTK3 mRNA

的表達(dá)。

2.2 LMTK3對(duì)A549細(xì)胞增殖能力的影響 結(jié)果顯示，在轉(zhuǎn)染24、48和72 h后shLMTK3組細(xì)胞的平均吸光度值分別低于Scramble組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t分別為5.24，3.91，7.70,P均<0.01)。表明下調(diào)A549細(xì)胞系中LMTK3的表達(dá)能夠明顯抑制細(xì)胞的增殖能力。見(jiàn)圖1。

注：兩組間比較，*，P<0.01。

圖1 各組穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系的細(xì)胞增殖能力比較

2.3 LMTK3對(duì)A549細(xì)胞遷移能力的影響

2.3.1 劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果 shLMTK3組細(xì)胞在劃痕24 h后的細(xì)胞遷移倍數(shù)(0.51±0.096)明顯低于scramble組(1.00±0.029)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.81,P<0.01)。提示LMTK3的表達(dá)下調(diào)后A549細(xì)胞的遷移能力下降。見(jiàn)圖2。

注：A, Scramble組劃痕0 h;B, Scramble組劃痕24 h;C, shLMTK3組劃痕0 h;D,shLMTK3組劃痕24 h;黑線示細(xì)胞相對(duì)遷移距離，比例尺=100 μm。

圖2 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果(×100)

2.3.2 Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果 shLMTK3組細(xì)胞在培

養(yǎng)24 h遷移到膜下的細(xì)胞數(shù)[(161±9.29)個(gè)]明顯低于scramble組[(308.66±17.60)個(gè)]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=7.42,P<0.01)。表明下調(diào)LMTK3的表達(dá)后對(duì)肺癌細(xì)胞體外遷移能力具有抑制作用。見(jiàn)圖3。

圖3 細(xì)胞遷移能力Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果(×100)

2.4 LMTK3對(duì)細(xì)胞周期與凋亡的影響

2.4.1 細(xì)胞周期結(jié)果 shLMTK3組細(xì)胞G1期所占百分比(65.33±1.05)%高于scramble組(56.64±1.70)%，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.35，P<0.05)，表明下調(diào)LMTK3的表達(dá)可將A549細(xì)胞阻滯于G1期。見(jiàn)圖4。

圖4 各組穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系的周期分布

2.4.2 細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果 shLMTK3組和scramble組的凋亡率分別為(5.05±0.09)%、(5.31%±0.05)%，兩組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.61,P>0.05)。表明下調(diào)LMTK3的表達(dá)后，對(duì)A549細(xì)胞的凋亡沒(méi)有明顯地影響。

3 討論

通過(guò)siRNA篩選，Giamas等[1]發(fā)現(xiàn)LMTK3能夠調(diào)節(jié)ERα的穩(wěn)定性和活性，LMTK3蛋白的高表達(dá)與更具有侵襲性乳腺癌的表型以及內(nèi)分泌治療的耐藥性顯著相關(guān)[7]。Stebbing等[8]發(fā)現(xiàn)在小鼠他莫西芬耐藥的乳腺癌模型中抑制LMTK3的表達(dá)可以使腫瘤體積縮小，從而使小鼠耐藥模型重新獲得對(duì)他莫西芬的敏感性。另有研究發(fā)現(xiàn)，LMTK3高表達(dá)且ERα陽(yáng)性的乳腺癌患者無(wú)病生存期及總生存期相較于LMTK3低表達(dá)的患者更短，LMTK3可作為接受內(nèi)分泌治療的ERα陽(yáng)性乳腺癌患者不良預(yù)后的獨(dú)立的預(yù)測(cè)因子[2]。另外， Shi等[5]發(fā)現(xiàn)腸癌患者血清sLMTK3含量高于健康人對(duì)照組，且與腸癌組織學(xué)類型、腫瘤侵潤(rùn)深度和TNM分期相關(guān)。其還發(fā)現(xiàn)LMTK3在肺癌患者血清中呈高表達(dá)，且與患者年齡、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及低生存率明顯相關(guān)。其進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)肺癌組織及癌旁組織胞核和胞漿中均有LMTK3蛋白的表達(dá)，但LMTK3蛋白在癌組織中表達(dá)的陽(yáng)性率、表達(dá)強(qiáng)度明顯高于癌旁組織。肺癌組織中LMTK3蛋白高表達(dá)患者血清中sLMTK3表達(dá)水平同樣升高。LMTK3可能成為肺癌診斷新的標(biāo)志物及肺癌獨(dú)立預(yù)后指標(biāo)[3-6]。然而，目前尚未見(jiàn)LMTK3在肺癌作用機(jī)制中的研究，本研究擬在細(xì)胞水平研究抑制LMTK3的表達(dá)對(duì)于肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549增殖、遷移、周期和凋亡的影響。

本研究通過(guò)shRNA技術(shù)下調(diào)肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549細(xì)胞中LMTK3的表達(dá)，并通過(guò)功能實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，LMTK3的表達(dá)下調(diào)后可明顯抑制細(xì)胞增殖、遷移能力。細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)顯示在培養(yǎng)24、48、72 h時(shí)shLMTK3組細(xì)胞的相對(duì)增殖速率明顯低于轉(zhuǎn)染對(duì)照組；劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示劃痕24 h后，shLMTK3組細(xì)胞的相對(duì)遷移距離明顯小于轉(zhuǎn)染對(duì)照組；Transwell遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示shLMTK3組遷移細(xì)胞數(shù)量相對(duì)于轉(zhuǎn)染對(duì)照組明顯減少；細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，shLMTK3組G1期細(xì)胞增多，細(xì)胞停滯在G1期，表明LMTK3具有促進(jìn)G1/S周期進(jìn)展和細(xì)胞增殖的作用。此外，下調(diào)LMTK3的表達(dá)后對(duì) A549細(xì)胞的凋亡率無(wú)明顯影響，表明LMTK3可能對(duì)A549細(xì)胞的存活無(wú)影響。綜合以上結(jié)果，我們認(rèn)為L(zhǎng)MTK3參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞A549的增殖和遷移。雖然本研究在細(xì)胞學(xué)水平驗(yàn)證了LMTK3的異常表達(dá)可以促進(jìn)肺癌細(xì)胞增殖和遷移，在肺癌中具有惡性生物學(xué)特性，但其作用機(jī)制目前仍不明確，我們將進(jìn)一步闡明其分子作用機(jī)制，為肺癌的診斷及靶向治療提供新的手段。

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(本文編輯：許曉蒙)

Effects of lemur tyrosine kinase 3 on the cytobiological function of human lung cancer A549 cells

ZHUWena,WANGChuan-cuia,ZHANGYu-qinga,JIANGJing-tingb,WANGZhi-ganga

(a.DepartmentofRespiratory,b.DepartmentofTumorBiologicalTreatmentCenter,JiangsuEngineeringResearchCenterforTumorImmunotherapy,InstituteofCellTherapy,theThirdAffiliatedHospitalofSoochowUniversity,Changzhou213003,Jiangsu,China)

Objective To investigate the effects of down-regulation of lemur tyrosine kinase 3 (LMTK3) on the cytobiological behaviors of human lung cancer A549 cells. Methods The expression of LMTK3 in A549 cells was interfered with small hair RNA (shRNA), and the expression level of LMTK3 was determined by RT-PCR. The effects of LMTK3 on the proliferation, migration, cell cycle and apoptosis of A549 cells were determined by the CCK-8 assay, scratch assay, Transwell assay and flow cytometry, respectively. Results The shLMTK3 cells with stably low expression of LMTK3 and control cells (Scramble) with normal expression of LMTK3 were successfully obtained. The relative proliferation rates of shLMTK3 cells cultured for 24, 48 and 72 hours were significantly lower than those in the control cells (0.305±0.018 vs 0.354±0.011,t=5.24,P<0.01; 0.461±0.044 vs 0.551±0.027,t=3.91,P<0.01; 0.74±0.029 vs 0.881±0.028,t=7.70,P<0.01). The relative migration rate of shLMTK3 cells 24 hours after scratching was significantly lower than that of control cells (0.51±0.096 vs 1.00±0.029,t=4.81,P<0.01). Transwell assay showed that the number of migration cells in shLMTK3 group was significantly less than that in Scramble group (161±9.29 vs 308.66±17.60,t=7.42,P<0.05). The results of flow cytometry showed that shLMTK3 cells were blocked at G1phase (t=4.35,P<0.05), and that the inhibition of LMTK3 had no influence on the apoptosis of A549 cells. Conclusion Down-regulation of LMTK3 expression in human lung cancer A549 cells may inhibit the proliferation and migration of A549 cells significantly, indicating that the abnormal expression of LMTK3 in lung carcinoma cells may regulate the biological behaviors and progression of tumors.

lemur tyrosine kinase 3; A549 cell; proliferation; migration; cell cycle

10.13602/j.cnki.jcls.2017.05.15

國(guó)家自然科學(xué)基金(31570877);常州市衛(wèi)生局重大招標(biāo)科技項(xiàng)目(ZD201402)。

朱文，1992年生，女，碩士研究生，研究方向：肺部腫瘤的基礎(chǔ)與臨床研究。

王智剛，教授，碩士研究生導(dǎo)師，E-mail:1410456717@qq.com。

R735.2

A

2017-03-02)