吳紅,江梅,聞芳,聶益軍

(1.江西省血液中心輸血研究室，南昌 330052；2.南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，南昌 330006)

·臨床實(shí)驗(yàn)研究·

戈謝病GBA基因突變致血小板輸注無效1例*

吳紅1,江梅2,聞芳2,聶益軍2

(1.江西省血液中心輸血研究室，南昌 330052；2.南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，南昌 330006)

目的 分析1例血小板輸注無效患者及其家系戈謝病葡萄糖腦苷脂酶(GBA)基因突變特征。方法 1例貧血及血小板減少的女性患者經(jīng)血小板輸注無效后，對其進(jìn)行骨髓細(xì)胞學(xué)、B超及基因測序檢測；采用干血斑法檢測其白細(xì)胞β-葡糖腦苷脂酶活性；提取該家系8個成員(包括先證者及其直系親屬)外周血基因組DNA進(jìn)行基因測序。結(jié)果 骨髓細(xì)胞學(xué)檢查示該例患者可見戈謝細(xì)胞(6.0%)，白細(xì)胞β-葡糖腦苷脂酶活性為3.78 nmol/(h·mgPro)，B超結(jié)果示脾腫大；基因測序分析發(fā)現(xiàn)其為GBA基因c.484A>G純合錯義突變；家系調(diào)查結(jié)果表明，先證者父母、子女及妹妹5人均為GBA基因雜合突變。結(jié)論 戈謝病患者可因脾功能亢進(jìn)而出現(xiàn)血小板輸注無效；GBA基因突變?yōu)樵摷蚁档闹饕虏∫蛩亍?/p>

血小板輸注無效；戈謝??；葡萄糖苷酯酶基因突變

戈謝病(Gaucher disease gaucherdisease)即葡糖腦苷脂酶病，是一種家族性糖脂代謝疾病，為常染色體隱性遺傳，其主要臨床表現(xiàn)為肝脾腫大、貧血及血小板減少[1]。目前國內(nèi)外對戈謝病分子機(jī)制的研究多集中在葡萄糖腦苷脂酶(GBA)基因突變上[2-3]。GBA基因突變的類型可因種族或地區(qū)的不同而呈現(xiàn)出不同的特點(diǎn)[4]。本研究通過對1例血小板輸注無效患者及其家系進(jìn)行調(diào)查，探討其GBA基因突變的特征。

1 材料與方法

1.1 臨床資料及家系調(diào)查 先證者，女性，38歲，有2～3年的貧血史，其他病史不詳。2016年11月在某縣級醫(yī)院檢查PLT為47×109/L，輸注機(jī)采血小板制品2 U，輸注后24 h其血小板回收率<16%(即輸注無效)。2016年12月1日遂前往南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院做進(jìn)一步檢查(血液檢查、骨髓細(xì)胞學(xué)、X光胸透及B超)。其影像學(xué)結(jié)果示：X光胸透檢查正常；B超顯示肝回聲均勻、致密；脾腫大(6.2 cm×25 cm)。且該患者呈進(jìn)行性脾腫大(3個月后脾大小為7.1 cm×26 cm)。由于經(jīng)費(fèi)等原因，先證者接受部分醫(yī)學(xué)檢測(如基因測序)，但拒絕進(jìn)行同位素骨掃描及醫(yī)學(xué)治療。詢問先證者的疾病家族史，并對該家系8名(包括先證者、其父母親、其弟及其妹、其配偶、其子及其女)人員進(jìn)行臨床資料的收集。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理學(xué)委員會批準(zhǔn)，患者及家系成員知情同意。

1.2 主要儀器與試劑 全自動血細(xì)胞分析儀及配套試劑(Sysmex XE2100，日本Sysmex公司)；全自動

生化儀(AU5400，美國貝克曼庫爾特公司)；酶聯(lián)儀(PHOMO，鄭州安圖生物公司)：全自動核酸提取儀(MagCoreHF16，上海吉盈公司)；熱循環(huán)儀PCR儀(美國ABI公司)；Agilent 2100 生物分析儀(美國安捷倫公司)；BES4000測序儀(北京博奧公司)；生化檢測試劑盒(上?？迫A公司)；DNA提取試劑盒(RBCBioscience，上海吉盈公司)。

1.3 標(biāo)本采集及實(shí)驗(yàn)室檢測 采集該例患者入院時的空腹靜脈血標(biāo)本2 mL，EDTA-K2抗凝，用全自動血細(xì)胞分析儀及配套試劑檢測該患者血液學(xué)指標(biāo)。另取非抗凝全血5 mL，室溫靜置1～2 h，2 500 r/min離心10 min,分離血清，用全自動生化儀及相應(yīng)的生化檢測試劑盒檢測總膽紅素(T-Bil)、直接膽紅素(D-Bil)、血清鐵(serum iron)、總蛋白(TP)、清蛋白(Alb)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、維生素B12、葉酸等指標(biāo)。其余指標(biāo)均由南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科檢測。由臨床醫(yī)師采集骨髓標(biāo)本后，行瑞氏-吉姆薩染色，光學(xué)顯微鏡下觀察骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)并拍照。

1.4 干血斑法檢測白細(xì)胞β-葡糖腦苷脂酶活性 取患者新鮮全血(約50 μL)滴在濾紙上，獲得直徑約1 cm 血斑，于室溫靜置4 h直至干燥，置于密封塑料袋中送至廣州市婦女兒童醫(yī)療中心檢測白細(xì)胞β-葡糖腦苷脂酶活性并進(jìn)行結(jié)果判讀。

1.5 基因測序

1.5.1 DNA提取 采集該家系8名(包括先證者、其父母親、其弟及其妹、其配偶、其子及其女)人員空腹靜脈血2 mL，枸櫞酸鈉抗凝，置-80 ℃保存。采用MagCoreHF16全自動核酸提取儀及DNA提取試劑盒提取DNA，樣本置-20 ℃保存。

1.5.2 探針設(shè)計及高通量基因測序 采用SureDesign在線設(shè)計工具(美國安捷倫公司)進(jìn)行探針設(shè)計使，捕獲探針由美國安捷倫公司采用SureDesign在線設(shè)計工具設(shè)計并合成。取提取的DNA樣本，送至東莞博奧木華公司，用Ion PITMChip v3和BSE4000測序儀進(jìn)行高通量測序。采用TMAP(Torrent Mapping Alignment Program)將測序序列比對到人類參考基因組(HG19, NCBI release GRCh37)，并利用TVC(Torrent Variant Caller)分析突變，使用ANNOVAR軟件對突變進(jìn)行注釋，包括注釋突變的位置、突變的基因信息、質(zhì)量得分、氨基酸改變、SIFT和PolyPhen-2功能性預(yù)測、dbSNP數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/)和ExAC數(shù)據(jù)庫(http://exac.broadinstitute.org/)人群頻率等。共檢測17種遺傳病(包括進(jìn)行性假肥大性肌營養(yǎng)不良、甲型及乙型血友病、α,β地中海貧血、遺傳性耳聾、脊髓性肌肉萎縮癥、半乳糖血癥、苯丙酮尿癥、肝豆?fàn)詈俗冃?、先天性腎上腺皮質(zhì)增生癥、糖原累積?、蛐?、瓜氨酸血癥、戈謝病、白化病、粘多糖I型及Ⅱ型、多囊腎)，涉及26個基因(包括DMD、F8、F9、HBA1、HBA2、HBB、GJB2、SLC26A4、GJB3、SMN1、GALT、PAH、ATP7B、CYP21A2、GAA、ASS1、SLC25A13、GBA、GPR143、TYR、TYRP1、OCA2、SLC45A2、IDUA、IDS、PKHD1)。

1.5.3 第一代基因測序 對GBA基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行Sanger測序(由Thermo Fisher公司完成)，并將測序結(jié)果與GenBank文庫中的參考序列進(jìn)行BLAST比對分析。

2 結(jié)果

2.1 先證者家系遺傳特征 該家系3代共8名，其中男性4名，女性4名。該先證者為GBA基因的純合突變，其臨床表現(xiàn)為貧血及血小板減少。先證者的直系親屬均無明顯的臨床癥狀(如貧血及血小板減少)；先證者的父親和母親為親表兄妹關(guān)系(即近親結(jié)婚)。對先證者的家人進(jìn)行測序，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：先證者的父親、母親、兒子、女兒、妹妹均為GBA基因的雜合突變；其丈夫及弟弟則為健康者。家系結(jié)果見圖1。

注：，常染色體隱性基因男性攜帶者；，正常男性；，常染色體隱性基因女性攜帶者；，女性先證者；，近親結(jié)婚。

圖1 該先證者家系圖譜

2.2 血液學(xué)檢測結(jié)果 該例患者的紅細(xì)胞、血紅蛋白、血小板及白細(xì)胞β-葡糖腦苷脂酶活性均低于參考范圍；而總膽紅素、直接膽紅素、血沉、血清鐵蛋白、IgG、IgM及抗-DNA抗體均高于參考范圍。見表1。

2.3 骨髓細(xì)胞學(xué)結(jié)果 骨髓涂片(瑞氏-吉姆薩染色)示：粒、紅系增生活躍，粒、紅比為1.7∶1；戈榭細(xì)胞約占6.0%，此類細(xì)胞體積較大，形態(tài)不規(guī)則，多呈圓形、卵圓形，含有1個或數(shù)個偏位的細(xì)胞核，核染色質(zhì)粗糙，胞漿量多，呈淡藍(lán)色，漿內(nèi)充滿交織成網(wǎng)狀或洋蔥皮樣的條紋結(jié)構(gòu)。見圖2。

表1 該例患者血液學(xué)檢測結(jié)果

注：箭頭為戈謝細(xì)胞(瑞氏-吉姆薩染色)。

圖2 骨髓細(xì)胞學(xué)檢測結(jié)果(×1 000)

2.4 基因測序結(jié)果 先證者攜帶1個臨床意義未明突變:GBA基因c.484A>G 純合錯義突變，家系分析發(fā)現(xiàn)其父親、母親、兒子、女兒及妹妹均為GBA基因c.484A>G 雜合錯義突變，而其丈夫、弟弟則為健康人群(GBA基因野生型)。測序結(jié)果見圖3。

3 討論

戈謝病是一種溶酶體貯積病(常染色體隱性遺傳病)，由于戈謝細(xì)胞在脾臟中積累引起脾腫大,造成脾功能亢進(jìn)，導(dǎo)致血小板輸注無效[5-7]。本研究中的患者出現(xiàn)脾腫大，且紅細(xì)胞及血小板同時減少、骨髓細(xì)胞增生活躍，因此該患者為脾功能亢進(jìn)癥，致血小板輸注無效?；谠摶颊吖撬柚袡z出戈謝細(xì)胞(圖2)、白細(xì)胞β-葡糖腦苷脂酶活性降低(表1)及其臨床癥狀，綜合診斷該成年女性患者為戈謝病Ⅰ型。研究表明，約70%以上的戈謝?、裥突颊叽嬖诠趋罁p害及生長遲緩等癥狀[8]，但該患者拒絕接受骨密度或骨掃描的檢查，因此未能確定其是否存在骨骼病變。

注：A,GBA基因：c.484A>G 純合錯義突變;B，GBA基因： c.484A>G 雜合錯義突變；C，GBA基因野生型;箭頭示突變位點(diǎn)。

圖3 該家系GBA基因測序結(jié)果

GBA是一種可溶性的糖脂類物質(zhì)，GBA基因突變造成單核-巨噬細(xì)胞內(nèi)的葡萄糖腦苷脂不能被水解從而形成典型的戈謝細(xì)胞[9]。目前已發(fā)現(xiàn)超過350種GBA基因突變類型(包括錯義突變，無義突變，移碼突變的插入或缺失突變，剪接突變及復(fù)雜等位基因突變)，其中2種GBA基因錯義突變類型p.L444P(c.1448T>C)和 p.N370S(c.1226A>G)是戈謝病患者最常見的基因突變類型[10-11]。GBA基因突變可在不同的種族人群中出現(xiàn)不同的特征，如在猶太人群中以4種GBA基因突變類型(N370S，L444P，84insG和IVS2+1G>A)為主(占90%)，而在高加索人群中以6種GBA基因突變類型(N370S，L444P，RecNciI，RecTL，D409H和IVS2+1G>A)為主(占60%～70%)[10-11]。本研究中發(fā)現(xiàn)的GBA突變： c.484A>G 純合錯義突變可導(dǎo)致其編碼的肽鏈第 162 號甲硫氨酸的密碼子變成纈氨酸(p.M162V)，該突變?nèi)巳侯l率極低。

為進(jìn)一步了解該GBA基因突變的產(chǎn)生原因，本研究對先證者進(jìn)行GBA基因家系調(diào)查。結(jié)果表明，先證者的父親、母親、兒子、女兒、妹妹均為GBA基因的雜合突變；其丈夫及弟弟則為健康者。因?yàn)橄茸C者的父親和母親為親表兄妹關(guān)系，所以推測該GBA基因突變可能源自其父母的某位共同祖先。根據(jù)該先證者的臨床表現(xiàn)，可推定該GBA基因突變(c.484A> G)為輕度和非神經(jīng)元病變的性質(zhì)，與戈謝?、裥拖嚓P(guān)，此純合突變在亞洲人群中極為罕見。本次對戈謝?、裥图癎BA基因突變的研究尚存在不足之處，主要包括(1)未能對該患者進(jìn)行更多的醫(yī)學(xué)檢測(如骨密度或骨掃描)；(2)由于該患者拒絕臨床治療，未能觀察其治療后的相關(guān)指針；(3)未能對GBA突變基因在細(xì)胞水平下進(jìn)一步驗(yàn)證。

[1]考杉斯基.威廉姆斯血液學(xué)[M].第8版.陳竺等譯.北京:人民衛(wèi)生出版社, 2011: 988-994.

[2]Amico G, Grossi S, Vijzelaar R,etal. MLPA-based approach for initial and simultaneous detection of GBA deletions and recombinant alleles in patients affected by Gaucher Disease[J]. Mol Gene Metab, 2016, 119(4):329-337.

[3]陳健, 孟巖, 石秀玉,等. 戈謝病Ⅲ型同胞患兒臨床及GBA基因突變分析[J]. 臨床兒科雜志, 2015, 33(5):462-465.

[4]Stirnemann J, Belmatoug N, Camou F,etal. A review of gaucherdisease pathophysiology, clinical presentation and treatments[J]. Int J Mol Sci, 2017, 18(2):441-470.

[5]胡蜀紅, 陳琛, 朱文君,等. 成年女性Ⅰ型戈謝病1例并文獻(xiàn)復(fù)習(xí)[J]. 內(nèi)科急危重癥雜志, 2015, 21(6):470-472.

[6]Rosenbloom BE, Weinreb NJ. Gaucher disease: a comprehensive review[J]. Crit Rev Oncogenesis, 2013, 18(3):163-175.

[7]崔婷婷, 孫志霞, 李殿秋,等. 脾戈謝病超聲表現(xiàn)1例[J]. 中國醫(yī)學(xué)影像技術(shù), 2016, 32(4):508.

[8]Mistry PK, Belmatoug N, Vom Dahl S,etal. Understanding the natural history of Gaucher disease[J]. Am J Hemato, 2015, 90 (S1):S6-S11.

[9]劉林玉, 杜司晨, 張進(jìn),等. 戈謝氏病致病機(jī)制及治療方法[J]. 遺傳, 2015, 37(6):510-516.

[10]Hoitsema K, Amato D, Khan A,etal. Identification of novel splice site mutation IVS9+1(G > A) and novel complex allele G355R/R359X in Type 1 Gaucher patients heterozygous for mutation N370S[J]. Meta Gene, 2016, 9(C):47-51.

[11]Matto?ová S, Chandoga J, Hlavatá A,etal. Spectrum ofGBAmutations in patients with Gaucher disease from Slovakia: identification of five novel mutations[J]. IMAJ, 2015, 17(3):166-170.

(本文編輯：許曉蒙)

Platelet transfusion refractoriness caused byGBAgene mutation in one patient with Gaucher disease

WUHong1,JIANGMei2,WENFang2,NIEYi-jun2

(1.DepartmentofBloodTransfusion,JiangxiProvinceBloodCenter,Nanchang330052,Jiangxi; 2.DepartmentofClinicalLaboratory,theFirstAffliatedHospitalofNanchangUniversity,Nanchang330006,Jiangxi,China)

Objective To analyze the mutation characteristics ofGBAgene in one patient with Gaucher disease and platelet transfusion refractoriness. Methods A female patient with anemia and thrombocytopenia showed platelet transfusion refractoriness, and then the proband and her family were performed bone marrow smear, β-glucocerebrosidase activity in leukocytes (dried blood spot assay), B-ultrasonography and gene sequencing examination and pedigree investigation. Results Pedigree investigation showed that the heterozygous mutation ofGBAgene existed in the father, mother, son, daughter and sister of the proband. Bone marrow cytomorphologic examination showed that Gaucher cells accounted for 6.0% in the female patient. The β-glucocerebrosidase activity in leukocytes was 3.78 nmol/(h·mg Pro). B-ultrasonography showed slightly splenomegaly. Gene sequencing found that the homozygous mutation ofGBAgene, c.484A>G, existed in the female patient. Conclusion The patients with Gaucher disease may appear platelet transfusion refractoriness due to hypersplenism. The mutation ofGBAgene is the main pathogenic factor of the family with Gaucher disease.

platelet transfusion refractoriness; Gaucher disease;GBAgene mutation

10.13602/j.cnki.jcls.2017.05.03

國家自然科學(xué)基金(81660144)。

吳紅，1975年生，女，副主任技師，博士，主要從事輸血相關(guān)技術(shù)。

聶益軍，副主任技師，E-mail:wuhongnie@163.com。

R331

A

2017-03-01)