周穎，徐會(huì)濤，李偉，楊晉，錢(qián)暉

(1.連云港市第一人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇連云港 222001；2. 江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江 212013)

·臨床實(shí)驗(yàn)研究·

間質(zhì)干細(xì)胞通過(guò)調(diào)控miR-92b修復(fù)順鉑誘導(dǎo)的急性腎損傷*

周穎1，徐會(huì)濤1，李偉1，楊晉1，錢(qián)暉2

(1.連云港市第一人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇連云港 222001；2. 江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江 212013)

目的 探討骨髓間質(zhì)干細(xì)胞(BM-MSCs)修復(fù)順鉑誘導(dǎo)的急性腎損傷的分子機(jī)制。方法 以6 mg/kg順鉑的劑量經(jīng)腹腔注射大鼠體內(nèi)，24 h后經(jīng)尾靜脈輸注BM-MSCs(BM-MSCs組)或PBS (PBS組)，以未注射順鉑者作為正常對(duì)照組；HE染色及免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)BM-MSCs對(duì)腎損傷的修復(fù)情況；體外培養(yǎng)NRK-52E細(xì)胞并經(jīng)順鉑作用6 h后,繼續(xù)培養(yǎng)48 h(順鉑組)或與BM-MSCs共培養(yǎng)48 h(細(xì)胞組)，未用順鉑處理的NRK-52E細(xì)胞作為對(duì)照組; qRT-PCR檢測(cè)其miR-92b及其靶基因PTEN的表達(dá)水平，western blot檢測(cè)其p-Akt蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果 HE染色結(jié)果顯示，BM-MSCs組的腎小管蛋白質(zhì)管型明顯少于PBS組，腎小管結(jié)構(gòu)明顯改善；免疫組織化學(xué)染色結(jié)果表明，BM-MSCs組的增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù) [(131.0±14.4)個(gè)]明顯高于PBS組[(42.2±6.1)個(gè)], 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=11.28,P<0.01)；qRT-PCR結(jié)果表明，體內(nèi)試驗(yàn)中，與正常對(duì)照組miR-92b和PTEN基因的表達(dá)水平(1.11±0.78，1.01±0.21)相比，PBS組分別為4.64±1.06和0.61±0.2，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，BM-MSCs組分別為2.27±0.81和1.1±0.1，差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05);體外實(shí)驗(yàn)中,與陰性對(duì)照組miR-92b和PTEN基因的表達(dá)水平(1.12±0.77，1.02±0.13)相比，順鉑組分別為7.64±0.72和0.58±0.2，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)，細(xì)胞組分別為4.38±0.50和1.15±0.23，差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)；western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，與順鉑組p-Akt蛋白的表達(dá)水平(0.96±0.18)相比，細(xì)胞組p-Akt蛋白表達(dá)水平為2.11±0.11，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。結(jié)論 BM-MSCs能夠修復(fù)順鉑誘導(dǎo)的急性腎損傷, 可能通過(guò)下調(diào)miR-92b發(fā)揮作用。

miR-92b；急性腎損傷；骨髓間質(zhì)干細(xì)胞

研究表明，間質(zhì)干細(xì)胞能夠修復(fù)順鉑及缺血再灌注導(dǎo)致的急性腎損傷[1-2]，但其修復(fù)機(jī)制一直存在較大的爭(zhēng)議。有學(xué)者認(rèn)為間質(zhì)干細(xì)胞可分化為腎小管樣上皮細(xì)胞從而發(fā)揮修復(fù)功能[3]；另有學(xué)者認(rèn)為，間質(zhì)干細(xì)胞通過(guò)旁分泌的作用(如炎癥因子TNF-α、IL-1β等的減少，抗炎因子IL-10、bFGF等的上調(diào))對(duì)受損的腎臟進(jìn)行修復(fù)[4]。本課題組前期研究結(jié)果顯示，人臍帶間質(zhì)干細(xì)胞(hUC-MSCs)分泌的外泌體(exosome)可修復(fù)順鉑誘導(dǎo)的大鼠急性腎損傷[5]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立順鉑誘導(dǎo)的急性腎損傷模型，進(jìn)一步探討B(tài)M-MSCs是否通過(guò)調(diào)控miR-92b的表達(dá)從而發(fā)揮修復(fù)功能。

1 材料與方法

1.1 主要材料 雌性SD大鼠，體重200±20 g，購(gòu)自上海斯萊克動(dòng)物中心；腎小管上皮細(xì)胞系NRK-52E購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)；順鉑(山東齊魯制藥公司)，低糖DMEM及胰蛋白酶(美國(guó)Gibco公司)，胎牛血清(上海依科賽公司)，堿性磷酸酶試劑盒(南京碧云天公司)，成脂誘導(dǎo)液(A+B,美國(guó)Cyagen公司)，油紅O染液(美國(guó)Sigma公司)，Trizol試劑(美國(guó)Invitrogen公司)，RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、miScript SYBR Green PCR試劑盒(美國(guó)Qiagen公司)，逆轉(zhuǎn)錄及SYBR Green PCR試劑盒(杭州博日公司)，Transwell嵌合板(8 μm)、細(xì)胞培養(yǎng)瓶及培養(yǎng)板(美國(guó)Corning公司)，兔抗大鼠Akt、兔抗大鼠p-Akt單克隆抗體，HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗(美國(guó)Bioworld公司)，免疫組織化學(xué)染色試劑盒、DAB顯色試劑盒 (武漢博士德公司)；超凈工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備廠)，CO2培養(yǎng)箱(美國(guó)Format Scientific公司)，NanoDrop 2000 超微量分光光度計(jì)(Thermo公司)，熒光定量PCR(美國(guó)ABI公司)，凝膠成像分析系統(tǒng)(美國(guó)Syngene公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 參照文獻(xiàn)[6]分離培養(yǎng)SD大鼠的BM-MSCs，加入含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 mg/mL鏈霉素的低糖DMEM培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的條件下常規(guī)培養(yǎng)。每隔3 d更換新鮮培養(yǎng)基，待細(xì)胞融合度達(dá)90%時(shí)，用2.5 g/L胰蛋白酶消化，以1∶3比例傳代培養(yǎng)。

1.3 成骨、成脂誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn) 取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的第3代BM-MSCs，經(jīng)2.5 g/L胰蛋白酶消化，用含10%胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)基重懸計(jì)數(shù)，以5×104個(gè)細(xì)胞密度接種于35 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3.1 成骨誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn) 取上述細(xì)胞，常規(guī)培養(yǎng)24 h后加入成骨誘導(dǎo)液(取0.1 μmol/L地塞米松、50 mg/L 維生素C、10 μmol/L β-磷酸甘油，溶入含10%FBS的L-DMEM)2 mL，每3 d換液1次，誘導(dǎo)14 d后用4%多聚甲醛固定，加入堿性磷酸酶試劑2 mL染色，PBS洗滌2次，光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照。以胞漿內(nèi)出現(xiàn)藍(lán)色沉淀的細(xì)胞為陽(yáng)性細(xì)胞。以?xún)H加入L-DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)胞作為陰性對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.2 成脂誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn) 取上述細(xì)胞，待細(xì)胞融合度達(dá)100%時(shí)，加入2 mL成脂誘導(dǎo)液A，培養(yǎng)3 d后更換成2 mL成脂誘導(dǎo)液B，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后更換為成脂誘導(dǎo)液A，反復(fù)循環(huán)培養(yǎng)至21 d。4%多聚甲醛固定30 min，加入油紅O試劑2 mL染色，PBS洗滌2次，光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照。以出現(xiàn)紅色脂滴的細(xì)胞為陽(yáng)性細(xì)胞。以?xún)H加入L-DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)胞作為陰性對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 急性腎損傷模型的構(gòu)建 參照文獻(xiàn)[6]構(gòu)建大鼠急性腎損傷模型，以6 mg/kg劑量的順鉑經(jīng)腹腔注射到腎損傷模型SD大鼠體內(nèi)，24 h后經(jīng)尾靜脈注射2×106個(gè)BM-MSCs(BM-MSCs組)或PBS(PBS組), 輸注細(xì)胞4 d后取出腎組織，4%多聚甲醛固定。以未注射順鉑的大鼠作為正常對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 病理切片及蘇木素-伊紅(HE)染色 取上述經(jīng)4%多聚甲醛固定的正常對(duì)照組、PBS組及細(xì)胞組的腎臟組織標(biāo)本，制備石蠟組織切片，經(jīng)二甲苯脫蠟30 min，分別用100%乙醇、95%乙醇和70%乙醇脫水各2 min，ddH2O洗滌2～3 min；蘇木素染色15 min，自來(lái)水沖洗2 min，經(jīng)1%鹽酸乙醇分化2～3 s，自來(lái)水沖洗10～20 min，蒸餾水沖洗2～3 s，1%伊紅染液染色4～5 min，自來(lái)水沖洗2～3 min，經(jīng)70%乙醇2 min、95%乙醇30 s和100%乙醇15 s脫水、透明，自來(lái)水沖洗2～3 min，二甲苯脫蠟30 min；中性樹(shù)膠封固，涼干后光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 免疫組織化學(xué)染色 取1.5中的各組經(jīng)系列乙醇脫水的石蠟組織切片，ddH2O洗滌2～3 min，將切片浸入50 mL 3% H2O2中以滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，室溫溫育10 min，蒸餾水洗滌3次；切片置于枸櫞酸鹽緩沖液中，加熱至沸騰10 min，自然冷卻后PBS洗滌2次；加入5% BSA封閉液室溫封閉20 min，棄去封閉液；加入小鼠抗大鼠PCNA單克隆抗體(1∶100稀釋)，置于濕盒中37 ℃溫育80 min，PBS洗滌2 min，重復(fù)3次，滴加生物素化山羊抗小鼠IgG，37 ℃溫育20 min，PBS洗滌2 min，重復(fù)3次；加入鏈霉親和素-生物素復(fù)合物(SABC)100 μL, 37 ℃溫育20 min，PBS洗滌5 min，重復(fù)4次；DAB顯色，蒸餾水終止反應(yīng)，蘇木素復(fù)染15 s；80%乙醇、95%乙醇和100%乙醇脫水各2 min，二甲苯透明2次，每次5 min，中性樹(shù)脂封片，光學(xué)顯微鏡下觀察，隨機(jī)計(jì)數(shù)6個(gè)低倍鏡視野下的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)(染色呈棕褐色)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 體外實(shí)驗(yàn) 取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的腎小管上皮細(xì)胞NRK-52E，經(jīng)2.5 g/L胰蛋白酶消化，并用含10%胎牛血清低糖DMEM培養(yǎng)基重懸并計(jì)數(shù)，以5×104個(gè)的細(xì)胞密度接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞融合度達(dá)60%時(shí)，加入7.5 μmol/L順鉑溫育6 h；同時(shí)BM-MSCs以2×105/孔的細(xì)胞密度接種于Transwell小室中，貼壁6 h后將小室移至7.5 μmol/L順鉑+NRK-52E細(xì)胞的上層(細(xì)胞組)，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。以上述7.5 μmol/L順鉑溫育6 h的NRK-52E細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)48 h為順鉑組，陰性對(duì)照組為用含10%胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)的NRK-52E細(xì)胞。上述各組均置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.8 RNA提取及逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng) 用Trizol試劑提取體內(nèi)試驗(yàn)中正常對(duì)照組、PBS組與BM-MSCs組。及體外試驗(yàn)中陰性對(duì)照組、順鉑組與細(xì)胞組的總RNA，采用miRNA專(zhuān)用RNA提取試劑盒提取上述各組的總RNA, NanoDrop 2000 超微量分光光度計(jì)檢測(cè)RNA的濃度及純度，取吸光度(A260/280 nm)在1.8～2.0的標(biāo)本，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及miScript Ⅱ逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說(shuō)明書(shū)將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，樣本置于-20 ℃保存。

1.9 qRT-RCR檢測(cè) 內(nèi)參照U6和miR-92b引物由Qiagen公司設(shè)計(jì)并合成。采用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)PTEN及β-Actin引物，引物由上海生工公司合成。PTEN上游引物序列(F)：5′-AAGGACGGACTGGTGTAATG-3′，下游引物序列(R)：5′-AGTGCCACTGGTCTGTAATC-3′；β-Actin上游引物序列(F)：5′-CACGAAACTACCTTCAACTTC-3′,下游引物序列(R)：5′-CATACTCCTGCTTGCTGATC-3′。miR-92b及U6反應(yīng)體系均為10 μL，包括2× QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix 5 μL；10×miScript Universal 引物1 μL；10×miScript 引物 1 μL；無(wú)RNA酶水 2 μL; cDNA 1 μL。反應(yīng)條件：95 ℃ 15 min；94 ℃ 15 s，55 ℃ 30 s，63 ℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)。75～85 ℃采集熒光，用StepOneTM軟件采集熒光信號(hào)并進(jìn)行熔解曲線分析。PTEN反應(yīng)體系為20 μL,包括ddH2O 8 μL，10 μmol/L上、下游引物各0.5 μL，2×SYBG Mix 10 μL，cDNA模板1 μL。反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s,60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共35個(gè)循環(huán),75～85 ℃時(shí)收集熒光。使用StepOneTM軟件采集熒光信號(hào)并進(jìn)行熔解曲線分析，miR-92b和PTEN基因相對(duì)表達(dá)水平以2-ΔΔCt法計(jì)算，公式：△△Ct =[(實(shí)驗(yàn)組Ct目的基因-實(shí)驗(yàn)組Ct內(nèi)參基因)-(對(duì)照組Ct目的基因-對(duì)照組Ct內(nèi)參基因)]。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.10 蛋白質(zhì)提取 收集體內(nèi)試驗(yàn)中正常對(duì)照組、PBS組與BM-MSCs組的腎組織標(biāo)本，加入適量細(xì)胞裂解液RIPA與1%苯甲基磺酰氟(PMSF)混合液，冰上研磨腎組織并轉(zhuǎn)移至1.5 mL EP管中。體外試驗(yàn)時(shí)收集對(duì)照組、順鉑組與細(xì)胞組的NRK-52E細(xì)胞(1×106個(gè))，PBS洗滌2次轉(zhuǎn)移至1.5 mL EP管中，800×g離心5 min去除上清，加入適量細(xì)胞裂解液RIPA及1%PMSF混合液。將上述標(biāo)本充分混勻后置冰上，每隔10 min劇烈震蕩30 s, 重復(fù)3次后4 ℃、12 000×g離心15 min, 將上清液轉(zhuǎn)移至另一1.5 mL EP管中。按照BCA法試劑盒操作說(shuō)明書(shū)測(cè)定樣品蛋白質(zhì)濃度。加入1/4體積的5×蛋白質(zhì)上樣緩沖液，100 ℃煮沸5 min, 樣本置于-80 ℃保存。

1.11 western blot 配制10% SDS-PGAE，將變性后的蛋白質(zhì)裂解液按150 μg的蛋白質(zhì)量進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳。電泳結(jié)束后再以350 mA恒流條件下電轉(zhuǎn)移2 h,將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。將膜置于50 g/L脫脂牛奶中(TBST配制)室溫封閉1 h；加入兔抗大鼠Akt抗體 (1∶500稀釋)、兔抗大鼠p-Akt 抗體(1∶500稀釋)，4 ℃過(guò)夜，次日以TBST洗滌3次，每次10 min，加入HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗(1∶2 000稀釋)，37 ℃溫育1 h，TBST洗滌3次，每次10 min。化學(xué)發(fā)光法(ECL)顯色, 凝膠成像分析系統(tǒng)曝光分析。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 骨髓MSCs成骨成脂分化能力分析結(jié)果 成骨誘導(dǎo)14 d后，BM-MSCs胞漿內(nèi)呈現(xiàn)藍(lán)紫色；成脂誘導(dǎo)21 d后，細(xì)胞中可見(jiàn)大量的油紅O染色陽(yáng)性的紅色脂肪滴。見(jiàn)圖1。

2.2 各組HE染色結(jié)果 正常對(duì)照組的腎小管結(jié)構(gòu)完整，沒(méi)有炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)及蛋白質(zhì)管型。PBS組腎小管結(jié)構(gòu)不完整，出現(xiàn)大量炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)，并且出現(xiàn)明顯的蛋白質(zhì)管型。而B(niǎo)M-MSCs組腎小管結(jié)構(gòu)得到明顯改善，炎癥細(xì)胞及蛋白質(zhì)管型減少。見(jiàn)圖2。

注：A，成骨對(duì)照組；B，成骨誘導(dǎo)組；C，成脂對(duì)照組；D，成脂誘導(dǎo)組。

圖1 成骨、成脂誘導(dǎo)BM-MSCs形態(tài)(×200)

注：A，正常對(duì)照組；B，PBS組；C，BM-MSCs組。

圖2 各組HE染色分析結(jié)果(×200)

2.3 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果 3組間PCNA陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞數(shù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=154.6,P<0.01);組間兩兩比較結(jié)果表明，PBS組PCNA陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞數(shù) [(42.2±6.1)個(gè)]明顯高于正常對(duì)照組[(4.0±1.6)個(gè)](t=8.41,P<0.01)；而B(niǎo)M-MSCs組PCNA陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞數(shù)[(131.0±14.4)個(gè)]較PBS組明顯增多(t=11.28,P<0.01)。見(jiàn)圖3。

注：A，正常對(duì)照組；B，PBS組；C，BM-MSCs組。

圖3 免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)PCNA結(jié)果(×200)

2.4 qRT-RCR檢測(cè)各組miR-92b及PTEN表達(dá)水平 與正常對(duì)照組或陰性對(duì)照組相比，PBS組及BM-MSCs組或順鉑組及細(xì)胞組miR-92b的表達(dá)水平均明顯升高；而與PBS組或順鉑組相比，BM-MSCs及細(xì)胞組PTEN基因表達(dá)水平亦明顯升高。見(jiàn)表1。

2.5 western blot檢測(cè)p-Akt表達(dá)水平 與對(duì)照組(1.02±0.21)相比，順鉑組p-Akt蛋白表達(dá)水平(0.96±0.18)未見(jiàn)明顯變化;而細(xì)胞組p-Akt的表達(dá)水平為2.11±0.11，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=5.51,P<0.01)。

表1 miR-92b及PTEN基因的相對(duì)表達(dá)量

注：*，與正常對(duì)照組或陰性對(duì)照組相比，P<0.01；#，與PBS組或順鉑組相比，P<0.01。

3 討論

研究表明,間質(zhì)干細(xì)胞對(duì)損傷的腎組織起到保護(hù)和促進(jìn)修復(fù)作用，但其作用機(jī)制并不十分明確[7]。本研究發(fā)現(xiàn)BM-MSCs能夠修復(fù)順鉑誘導(dǎo)的急性腎損傷。HE染色結(jié)果表明移植BM-MSCs的腎臟組織結(jié)構(gòu)明顯改善，炎癥細(xì)胞及蛋白質(zhì)管型減少，腎小管結(jié)構(gòu)趨于完整。免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，未經(jīng)順鉑損傷的正常腎組織中只有極少量的腎小管上皮細(xì)胞PCNA呈陽(yáng)性，顯示棕褐色的胞核。PBS組的腎組織中可見(jiàn)部分PCNA陽(yáng)性腎小管上皮細(xì)胞，表明損傷的腎組織有一定的自我修復(fù)能力，而移植BM-MSCs的細(xì)胞組可見(jiàn)大量PCNA陽(yáng)性腎小管上皮細(xì)胞，且陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯高于PBS組，表明BM-MSCs能夠促進(jìn)腎小管上皮細(xì)胞的增殖，從而對(duì)損傷的腎組織進(jìn)行修復(fù)。以上結(jié)果說(shuō)明BM-MSCs對(duì)順鉑誘導(dǎo)的急性腎損傷具有修復(fù)作用。

miRNA在組織損傷修復(fù)中扮演著極為重要的角色。為了進(jìn)一步探討B(tài)M-MSCs發(fā)揮作用的可能機(jī)制。我們檢測(cè)了順鉑損傷的腎組織或NRK-52E細(xì)胞中miR-92b的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)與未經(jīng)順鉑損傷的腎組織或細(xì)胞相比，其表達(dá)水平明顯升高，而經(jīng)移植BM-MSCs的腎組織或與BM-MSCs共培養(yǎng)的NRK-52E細(xì)胞miR-92b的表達(dá)水平明顯降低，說(shuō)明BM-MSCs可以抑制miR-92b的表達(dá)。PTEN作為miR-92b的靶基因，在順鉑損傷的腎組織或細(xì)胞中的表達(dá)量增加，PTEN的表達(dá)被部分抑制，PTEN的下游通路蛋白—p-Akt蛋白的表達(dá)未見(jiàn)明顯改變。BM-MSCs能夠降低miR-92b的表達(dá)水平，從而促進(jìn)PTEN基因的表達(dá)，進(jìn)而活化p-Akt蛋白，促進(jìn)細(xì)胞增殖。目前僅有少量報(bào)道m(xù)iR-92b通過(guò)調(diào)控PTEN/Akt信號(hào)通路，從而調(diào)節(jié)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞及非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的增殖與凋亡[8]，表明miR-92b能抑制腫瘤細(xì)胞增殖，促進(jìn)凋亡；當(dāng)miR-92b的表達(dá)水平升高時(shí)，促進(jìn)細(xì)胞增殖并減少其凋亡，與本實(shí)驗(yàn)中miR-92b的作用較為一致。本研究不足之處在于僅證實(shí)順鉑誘導(dǎo)的腎損傷過(guò)程中miR-92b表達(dá)水平升高，可能促使腎損傷的進(jìn)展，BM-MSCs能夠降低miR-92b的表達(dá)水平從而達(dá)到修復(fù)腎損傷的目的，尚未證實(shí)miR-92b能否導(dǎo)致腎損傷的發(fā)生。為了明確miR-92b在腎損傷中的作用機(jī)制，今后需將miR-92b-mimics轉(zhuǎn)染NRK-52E細(xì)胞并用miR-92b 抑制劑轉(zhuǎn)染順鉑損傷的NRK-52E細(xì)胞，進(jìn)一步深入分析miR-92b在急性腎損傷中的作用，以明確BM-MSCs發(fā)揮損傷修復(fù)的分子機(jī)制。

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(本文編輯：許曉蒙)

Mesenchymal stem cells repair cisplatin-induced acute kidney injury via regulating miR-92b

ZHOUYing1,XUHui-tao1,LIWei1,YANGJin1,QIANHui2

(1.DepartmentofClinicalLaboratory,theFirstPeople′sHospitalofLianyungang,Lianyungang222001,Jiangsu; 2.SchoolofMedicine,JiangsuUniversity,Zhenjiang212003,Jiangsu,China)

Objective To investigate the molecular mechanism of bone marrow mesenchymal stem cells (BM-MSCs) in repairing cisplatin-induced acute renal injury. Methods The rats were injected 6 mg/kg of cisplatin intraperitoneally, and bone marrow mesenchymal stem cells (BM-MSCs group) or PBS (PBS group) were injected respectively via tail vein after 24 hours. The rats without injecting cisplatin were selected as a normal control group. The repair effect of BM-MSCs on renal injury was observed by HE staining and immunohistochemistry. In addition, NRK-52E cells were cultured in vitro and treated with cisplatin for 6 hours. Then, NRK-52E cells were continued to culture for 48 hours or co-cultured with BM-MSCs for 48 hours, and NRK-52E cells untreated with cisplatin were used as a control. The expression levels of miR-92b and its target genePTENwere detected by qRT-PCR, and the expression level of p-Akt by western blot. Results HE staining showed that the tubular protein casts in BM-MSCs group were significantly less than that in PBS group, and that the renal tubular structure was significantly improved in BM-MSCs group. Immunohistochemical staining indicated that the number of cells expressing proliferating cell nuclear antigen (PCNA) in BM-MSCs group (131.0±14.4) was significantly higher than that in PBS group (42.2±6.1,t=11.28,P<0.01). qRT-PCR results showed that in the vivo experiment, compared with the expression level of miR-92b andPTENin the normal control group (1.11±0.78，1.01±0.21), PBS group were (4.64±1.06) and (0.61±0.2),respectively (allP<0.05); BM-MSCs group were (2.27±0.81) and (1.1±0.1),respectively(allP<0.05). In vitro experiment, compared with the expression level of miR-92b andPTENin the negative control group (1.12±0.77，1.02±0.13), cisplatin group were (7.64±0.72) and (0.58±0.2),respectively (allP<0.05), cell group were (4.38±0.50) and (1.15±0.23),respectively(allP<0.05). Western blot results showed that compared with the expression level of p-Akt in cisplatin group (0.96±0.18), p-Akt expression in cell group was (2.11±0.11,P<0.01).Conclusion BM-MSCs may repair the cisplatin-induced acute renal injury via down-regulating the expression level of miR-92b.

miR-92b; acute kidney injury; bone marrow mesenchymal stem cell

10.13602/j.cnki.jcls.2017.05.01

國(guó)家自然科學(xué)基金(81272481)；江蘇高校優(yōu)秀科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)(蘇教科(2013)10號(hào))；江蘇省“333工程”科研項(xiàng)目(BRA2015399)；連云港市“科教興衛(wèi)工程”青年科技項(xiàng)目(QN1404)。

周穎，1987年生，女，碩士，從事干細(xì)胞與損傷修復(fù)研究。

錢(qián)暉，教授, 博士研究生導(dǎo)師，E-mail:lstmmmlst@163.com。

R332

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2017-02-04)