杜麗東，牛亭惠，吳國泰，王志旺，邵 晶，任 遠(yuǎn)

(甘肅中醫(yī)藥大學(xué)甘肅省中藥藥理與毒理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730000)

·實(shí)驗(yàn)研究·

符合中醫(yī)體征的血虛便秘小鼠模型的建立與評價(jià)*

杜麗東，牛亭惠，吳國泰，王志旺，邵 晶，任 遠(yuǎn)

(甘肅中醫(yī)藥大學(xué)甘肅省中藥藥理與毒理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730000)

目的：建立血虛便秘小鼠模型，評價(jià)模型小鼠的體征并探討模型復(fù)制條件。方法：將64只SPF級KM小鼠隨機(jī)分為正常對照組、血虛組、便秘組和血虛便秘組，每組16只。血虛組皮下注射乙酰苯肼60 μg/g+腹腔注射環(huán)磷酰胺40 μg/g，便秘組灌胃復(fù)方地芬諾酯25 μg/g，血虛便秘組皮下注射乙酰苯肼60 μg/g +腹腔注射環(huán)磷酰胺40 μg/g+灌胃復(fù)方地芬諾酯25 μg/g，正常對照組皮下注射+腹腔注射+灌胃等量生理鹽水，造模連續(xù)28 d。觀察小鼠狀態(tài)，檢測體質(zhì)量、血常規(guī)、糞便性狀、小腸推進(jìn)率(SIPR)、首粒黑便排出時(shí)間(TFBF)、糞便含水量(FWC)和結(jié)腸含水量(CWC)；結(jié)腸組織進(jìn)行HE和AB-PAS染色，觀察組織形態(tài)學(xué)改變。結(jié)果：與正常對照組對比，血虛組隨造模時(shí)間延長，體質(zhì)量增長緩慢，WBC、RBC、HGB和HCT均顯著降低(P<0.05或P<0.01)，糞便質(zhì)軟、SIPR、TFBF、FWC和 CWC均無顯著性變化(P>0.05)；便秘組體質(zhì)量增長稍慢，WBC、RBC、HGB和HCT無顯著變化(P>0.05)；血虛便秘組體質(zhì)量增長緩慢，WBC、RBC、HGB和HCT均顯著降低(P<0.05或P<0.01)；便秘組和血虛便秘組小鼠糞便質(zhì)硬，SIPR顯著減慢、TFBF顯著延長、FWC和 CWC均顯著下降(P<0.05或P<0.01)；血虛組小鼠結(jié)腸組織形態(tài)和黏液分泌與正常對照組相似(P>0.05)，便秘和血虛便秘組小鼠結(jié)腸黏膜層和大腸腺萎縮，黏液分泌減少(P<0.05)。結(jié)論：乙酰苯肼、環(huán)磷酰胺聯(lián)合復(fù)方地芬諾酯能建立符合中醫(yī)體征的血虛便秘小鼠模型，造模方法可控、簡便、易行。

血虛便秘；小鼠；模型

便秘是一種臨床常見癥狀，血虛便秘是中醫(yī)臨床常見的證型?；颊叨啾憩F(xiàn)血虛陰虧、津枯血燥，面色萎黃或潮紅，脈細(xì)數(shù)，舌質(zhì)紅而少津或淡而津干，大便量少、質(zhì)干硬。便秘的產(chǎn)生原因有多種，或產(chǎn)后、術(shù)后失血過多，血虛腸燥；或熱病后津液耗傷而致腸液干枯；或平素大便秘結(jié)，長期服用通便藥導(dǎo)致腸液干枯；或老年人腸道功能減退、患有痔疾、婦女患月經(jīng)病[1]。中醫(yī)臨床對血虛便秘的研究取得了長足進(jìn)展，但血虛便秘動物模型的研究一直頗有爭議，建立符合中醫(yī)臨床指征的動物模型是開展血虛便秘基礎(chǔ)研究、開發(fā)有效治療藥物的基礎(chǔ)。本研究采用復(fù)合因素建立血虛便秘小鼠模型，并與血虛和便秘模型小鼠進(jìn)行對比，旨在建立一種簡單易行、條件可控、基本能體現(xiàn)血虛便秘體征特點(diǎn)的小鼠模型，為相關(guān)科學(xué)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 動 物

SPF級昆明種小鼠64只，雌雄各半，體質(zhì)量18～22 g，由甘肅中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，動物合格證號：SCXK(甘)2015-0002。 飼養(yǎng)于甘肅中醫(yī)藥大學(xué)科研實(shí)驗(yàn)中心SPF級實(shí)驗(yàn)室。

1.2 藥品與儀器

復(fù)方地芬諾酯片，常州康普藥業(yè)有限公司產(chǎn)品，批號1603033；乙酰苯肼(APH), 上海源葉生物科技有限公司產(chǎn)品，批號20150701258；環(huán)磷酰胺(CPA)，山西普德藥業(yè)股份有限公司產(chǎn)品，批號04150405。AU5400型全自動生化分析儀、BX51-32H01型顯微鏡，均為日本Olympus公司產(chǎn)品。

1.3 分組與模型的建立

參照文獻(xiàn)[2-3]并在預(yù)實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，將小鼠按性別、體質(zhì)量隨機(jī)分正常對照組、血虛組、便秘組和血虛便秘組，每組16只；自由進(jìn)食飲水，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。血虛組小鼠造模第1，4，7，10 天 皮下注射APH 60 μg/g，第10-14天腹腔注射CTX 40 μg/g；便秘組小鼠灌胃復(fù)方地芬諾酯混懸液25 μg/g( 5 d為1個(gè)療程，療程間停藥2 d)；血虛便秘組小鼠造模第1，4，7，10天皮下注射 APH 60 μg/g，第10-14天腹腔注射 CTX 40 μg/g，同時(shí)灌胃復(fù)方地芬諾酯混懸液25 μg/g；正常對照組第1，4，7，10天皮下注射、第10-14天腹腔注射、同時(shí)灌胃等量生理鹽水；各組給藥容積10 μL/ g。造模連續(xù)28 d。

1.4 觀測指標(biāo)

1.4.1 一般狀況與體質(zhì)量

觀察各組小鼠活動狀態(tài)，毛色，口、鼻、唇、尾顏色，糞便形態(tài)。分別在造模前、造模第7，14，21，28天和造模結(jié)束第7天稱量體質(zhì)量。

1.4.2 血常規(guī)

分別在造模第28天和造模結(jié)束第7天，取各組小鼠8只，眼眶靜脈叢取血20 μL ，采用全自動血液分析儀檢測外周血中白細(xì)胞 (WBC) 計(jì)數(shù)、紅細(xì)胞 (RBC) 計(jì)數(shù)、血紅蛋白 (HGB) 含量和紅細(xì)胞壓積(HCT)。

1.4.3 首粒黑便排出時(shí)間(TFBF)和小腸推進(jìn)率 (SIPR)

在造模第28天和造模結(jié)束第7天，禁食、不禁水12 h，分別取各組小鼠8只，每只灌胃50 g/L炭末糊0.5 mL，單籠飼養(yǎng)并記錄各小鼠TFBF。造模第29天和造模結(jié)束后第8天禁食、不禁水12 h，取各組小鼠8只，每只灌胃50 g/L 炭末糊0.5 mL。25 min后頸椎脫臼處死，開腹，取出小腸，分離系膜，鋪直，測量小腸全長(幽門至回盲部距離)及推進(jìn)距離(幽門至炭末前沿的距離)，計(jì)算SIPR。 SIPR=推進(jìn)距離/小腸全長×100%。

1.4.4 糞便含水量(FWC)和結(jié)腸含水量(CWC)

取1.4.3項(xiàng)處死小鼠，取結(jié)腸殘留糞便，稱濕重，80 ℃恒溫干燥10 h，稱干重，計(jì)算FWC。FWC=(濕重-干重)/濕重×100%。取結(jié)腸組織約 2 cm(距盲腸2 cm處)，稱濕重，60 ℃恒溫干燥6 h，稱干重，計(jì)算CWC。CWC =(濕重-干重)/濕重×100%。

1.4.5 結(jié)腸組織形態(tài)

造模第29天，取結(jié)腸組織約1 cm(距離直腸2 cm處)， 40 g/L多聚甲醛固定，石蠟包埋，切片，HE染色，光鏡下觀察。

1.4.6 結(jié)腸黏液分泌

造模第29天，取結(jié)腸組織約1 cm (距直腸 3 cm處)，卡諾氏固定液(無水乙醇︰冰醋酸︰氯仿=6∶1∶3) 固定，石蠟包埋，切片，AB-PAS染色，光鏡下觀察。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 各組一般狀況對比

正常對照組小鼠反應(yīng)靈敏，皮毛密而有光澤，糞便形狀規(guī)則，質(zhì)稍軟，互不粘連。血虛組小鼠蜷縮，萎靡，皮毛膨松、易掉，耳、鼻、唇、尾蒼白，糞便較硬。便秘組小鼠皮毛光澤暗淡，排便減少，糞便干結(jié)、粘連。血虛便秘組小鼠蜷縮，萎靡，毛枯疏，光澤暗淡，耳、鼻、唇、尾蒼白，排便減少，糞便干結(jié)、粘連。

2.2 各組小鼠體質(zhì)量對比

造模前各組小鼠體質(zhì)量對比，差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與正常對照組對比，隨著造模時(shí)間延長，便秘組小鼠體質(zhì)量增長雖減慢，但差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；血虛組和血虛便秘組小鼠分別從造模第14 天、第7天起至造模結(jié)束第7天體質(zhì)量增長顯著減慢，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。見表1。

組 別造模造模前造模第7天造模第14天造模第21天造模第28天造模結(jié)束第7天正常對照組18.8±1.321.4±1.522.5±1.524.1±1.525.2±1.925.7±1.5便秘組18.7±1.819.8±1.521.9±1.922.9±2.024.1±2.225.0±2.2血虛組19.1±2.119.9±2.120.5±2.0**22.3±2.122.6±2.0**23.0±1.9**血虛便秘組18.6±1.119.4±0.8*20.2±0.8**21.8±0.5**22.2±0.9**22.4±0.4**

注：與正常對照組對比，*P<0.05，**P<0.01。

2.3 各組小鼠WBC、HGB、RBC和HCT對比

與正常對照組對比，造模第28天和造模結(jié)束第7天，便秘組小鼠外周血WBC、RBC、HGB、HCT均無顯著變化(P>0.05)；血虛組和血虛便秘組小鼠外周血WBC、RBC、HGB、HCT均降低，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P<0.05或P<0.01)。見表2。

組 別造模第28天WBC/(×109個(gè)·L-1)HGB/(g·L-1)RBC/(×1012個(gè)·L-1)HCT/%正常對照組11.4±3.7146.8±22.58.6±1.434.4±7.4便秘組11.9±2.2150.2±22.08.7±1.334.7±8.4血虛組8.8±2.9*104.4±20.3**6.3±1.2**血虛便秘組6.5±2.6**102.5±15.0**6.1±1.2**26.5±7.3*

組 別造模結(jié)束第7天WBC/(×109個(gè)·L-1)HGB/(g·L-1)RBC/(×1012個(gè)·L-1)HCT/%正常對照組10.6±4.5151.7±10.57.9±0.832.2±2.5便秘組9.4±2.5135.5±27.07.4±1.329.7±4.7血虛組5.8±0.9*117.5±13.1*6.5±0.7*27.89±3.5*血虛便秘組5.5±1.4**116.0±24.6**6.3±1.3*25.7±4.4*

注：與正常對照組對比，*P<0.05，**P<0.01。

2.4 各組小鼠TFBF和SIPR對比

與正常對照組對比，造模第28天和造模結(jié)束第7天，便秘組和血虛便秘組小鼠TFBF延長、SIPR降低，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05); 血虛組小鼠TFBF有延長趨勢、SIPR有減慢趨勢，但差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

組 別造模第28天TFBF/minSIPR/%造模結(jié)束第7天TFBF/minSIPR/%正常對照組124.6±39.369.6±7.4113.3±30.070.1±7.7便秘組187.0±40.7**62.8±6.3*173.1±32.9**62.2±7.9*血虛組148.2±37.266.5±8.3139.3±42.769.1±6.1血虛便秘組184.9±26.2**61.8±8.4*186.8±47.1**61.7±7.4*

注：與正常對照組對比，*P<0.05，**P<0.01。

2.5 各組小鼠FWC和CWC對比

與正常對照組對比，便秘組和血虛便秘組小鼠FWC和CWC降低，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)；血虛組小鼠FWC和CWC有降低趨勢，但差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)果見表4。

組 別造模第28天FWC/%CWC/%造模結(jié)束第7天FWC/%CWC/%正常對照組64.6±8.078.1±3.869.4±5.776.8±7.0便秘組50.5±7.5**73.1±4.5*49.8±8.7**70.0±4.7*血虛組58.4±7.977.7±2.864.6±6.173.8±5.2血虛便秘組47.1±8.5**74.8±2.4*46.7±12.0**69.4±9.0*

注：與正常對照組對比，*P<0.05，**P<0.01。

2.6 各組小鼠結(jié)腸組織形態(tài)對比

正常小鼠結(jié)腸黏膜上皮層、固有層、黏膜肌層、黏膜下層、肌層、漿膜層均未見明顯病理改變，結(jié)腸黏膜上皮完整，排列整齊。便秘組和血虛便秘組小鼠結(jié)腸黏膜層萎縮，黏膜固有層大腸腺明顯萎縮，黏膜下層、肌層和漿膜層未見異常病理改變。血虛組各層未見明顯異常病理改變。見圖1。

圖1 造模對小鼠結(jié)腸組織形態(tài)的影響(HE 染色，×10)

2.7 各組小鼠結(jié)腸黏液分泌對比

正常小鼠結(jié)腸黏膜層上皮細(xì)胞和杯狀細(xì)胞形態(tài)飽滿、圓潤，黏液分泌豐富，黏膜表面覆蓋混合性黏液。血虛組小鼠黏液分泌接近正常小鼠。便秘組和血虛便秘組小鼠黏膜層上皮細(xì)胞和杯狀細(xì)胞出現(xiàn)不同程度萎縮，黏膜表面黏液覆蓋減少。見圖2。

圖2 造模對小鼠結(jié)腸黏液分泌的影響(AB-PAS 染色，×20)

3 討 論

目前，與病因病機(jī)相符合且能體現(xiàn)“證”的主要癥狀的血虛便秘模型的研究較少，且缺乏判斷模型成功的金標(biāo)準(zhǔn)。文獻(xiàn)報(bào)道的血虛便秘小鼠模型有皮下注射鹽酸嗎啡+剪尾放血[4]，灌胃鹽酸洛哌丁胺+剪尾放血[5]，模型的判斷標(biāo)準(zhǔn)為：動物出現(xiàn)血虛表現(xiàn)，如精神萎靡，蜷臥，少動，嗜睡，毛聳無華，眼睛淡白無神，鼻唇色淡，活動減少；血常規(guī)中WBC、RBC、HTC和PLT降低；出現(xiàn)糞便數(shù)量減少，便干，整腸傳輸時(shí)間延長等便秘癥狀。放血符合血虛便秘病因病機(jī)中“血的持久過度損耗，滋潤和營養(yǎng)減弱”，但存在小鼠放血量難以精確控制、易致尾部血管變構(gòu)、部分動物恢復(fù)過快而不出現(xiàn)血虛癥狀等缺點(diǎn)。本研究采用目前常用的化學(xué)因素APH和CPA致血虛方法聯(lián)合止瀉藥復(fù)方地芬諾酯建立血虛便秘模型，并與血虛和便秘模型小鼠進(jìn)行對比，旨在確立一種簡便、可控的符合中醫(yī)臨床病證結(jié)合的血虛便秘小鼠模型。

本研究結(jié)果顯示：與正常對照組對比，血虛組小鼠血虛但不便秘，隨造模時(shí)間延長，體質(zhì)量增長緩慢，血中WBC、RBC、HGB和HCT均顯著降低，糞便質(zhì)軟，SIPR、TFBF、FWC和 CWC均無顯著性變化(研究周期內(nèi)，單種血虛未出現(xiàn)便秘癥狀，可能是由血虛導(dǎo)致便秘需要更長的時(shí)間)。便秘組小鼠便秘但血不虛：小鼠體質(zhì)量增長正常，血中WBC、RBC、HGB和HCT無顯著變化。血虛便秘組小鼠血虛兼便秘：小鼠體質(zhì)量增長緩慢，血中WBC、RBC、HGB和HCT均顯著降低。便秘組和血虛便秘組小鼠糞便質(zhì)硬，TFBF顯著延長，SIPR顯著減慢，F(xiàn)WC和 CWC均顯著下降，結(jié)腸黏膜層和大腸腺萎縮，黏液分泌減少。造模結(jié)束7 d，血液和便秘的相關(guān)檢測顯示與造模結(jié)束時(shí)一致，提示該模型比較穩(wěn)定。以上結(jié)果與李國峰等[4-6]的研究結(jié)果一致。

本研究建立的血虛便秘小鼠模型操作簡單，造模條件量化、可控、造模周期相對較短、模型基本穩(wěn)定，但該模型屬于血虛和便秘的兼證，未能體現(xiàn)血虛與便秘的因果關(guān)系。在目前沒有更好的血虛便秘動物模型的情況下，可作為開展血虛便秘基礎(chǔ)研究和開發(fā)有效治療藥物評價(jià)的動物模型。

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(編輯 陶 珠)

1001-6910(2017)03-0075-04

R256.35

B

10.3969/j.issn.1001-6910.2017.03.34

任遠(yuǎn)，教授，博士研究生導(dǎo)師，Leyuan816@163.com

甘肅省中藥藥理與毒理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放基金項(xiàng)目(ZDSYS-KJ-2015-009，ZDSYS-ZZ-2015-002，ZDSYS-KJ-2015-008)；隴原青年創(chuàng)新人才扶持計(jì)劃項(xiàng)目(甘組電明字〔2015〕34號)；甘肅省中藥現(xiàn)代制藥工程研究院基金項(xiàng)目(YWW-2015050)

2016-12-09；

2017-02-20