李茂宇 張甦 沈?qū)W萍 薛建英

單核苷酸多態(tài)性微陣列技術(shù)在顱腦異常胎兒產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用

李茂宇 張甦 沈?qū)W萍 薛建英

目的 探討單核苷酸多態(tài)性微陣列（SNP-array）技術(shù)在顱腦異常胎兒產(chǎn)前診斷中的價(jià)值。 方法 采用 G 顯帶核型分析 6 例胎兒染色體核型，應(yīng)用 SNP-array 技術(shù)檢測 6 例胎兒全基因組拷貝數(shù)變異（CNVs），分析芯片檢出的所有 CNVs。 結(jié)果G 顯帶核型分析提示 3 例胎兒核型異常。SNP-array 技術(shù)檢測出 4 例胎兒存在基因片段異常，包括 Xp22.33p22.2 區(qū)域、7q35q36.3區(qū) 域 的 微缺失 和 18p11.32q23、Yq11.221q11.23、9p24.3p21.1 片 段 的 增加。 結(jié)論 胎兒的顱腦異?？?能與 基因 CNVs 相 關(guān)。SNP-array 可精確定位胎兒基因異常，為產(chǎn)前遺傳學(xué)診斷提供依據(jù)。

單核苷酸多態(tài)性微陣列 顱腦異常 拷貝數(shù)變異

【 Abstract 】 Objective To apply single nucleotide polymorphism array(SNP-array)in prenatal genetic screening for craniocerebral abnormality. Methods Karyotyping was performed by conventional G banding analysis in 6 fetuses,and genome-wide copy number variations(CNVs)were detected by SNP-array in these fetuses.Results The abnormal karyotypes were detected by G banding analysis in 3 fetuses.And abnormal gene fragments were identified by SNP-array in 4 fetuses, including the microdeletion in Xp22.33p22.2,7q35q36.3 and increased fragments in 18p11.32q23,Yq11.221q11.23, 9p24.3p21.1. Conclusion The craniocerebral abnormality of fetuses is associated with CNVs,which can be detected by SNP-array,indicating that SNP-array may be used for prenatal genetic diagnosis.

【 Key words 】 SNP-array Craniocerebral abnormality Copy number variations

單核苷酸多態(tài)性微陣列 （single nucleotide polymorphism array，SNP-array） 技術(shù)是一種較新的染色體檢測技術(shù)，具有較高的分辨率，可以檢出染色體微缺失、微重復(fù)和隱匿性易位[1]，近年來在產(chǎn)前診斷和生殖領(lǐng)域發(fā)揮了較大作用。一些孕婦經(jīng)超聲檢查發(fā)現(xiàn)胎兒顱腦異常，這些異常源于遺傳學(xué)因素還是其他因素值得探究。筆者對一些通過超聲檢查發(fā)現(xiàn)顱腦異常的胎兒進(jìn)行羊水G顯帶核型分析和 SNP-array 技術(shù)檢測，發(fā)現(xiàn)了一些常規(guī)檢測手段不能檢出的胎兒基因變異，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料和方法

1.1 臨床資料 2015 年 12 月 1 日至 2016 年 10 月 31日本院產(chǎn)前診斷中心通過超聲檢查發(fā)現(xiàn)可能存在胎兒顱腦異常，同時(shí)孕婦和家屬愿意接受羊水 G顯帶核型分析和 SNP-array 技術(shù)檢測的孕婦 6 例。孕婦平均年齡 29.6 歲，平均診斷孕周 23.7 周；超聲檢查結(jié)果見表1。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)和孕婦及家屬知情同意。

1.2 方法

1.2.1 G 顯帶核型分析 按照臨床常規(guī)方法行羊水細(xì)胞培養(yǎng)、中期染色體分裂相制備及G顯帶核型分析。染色體選擇 550 條帶以上的核型，依據(jù)《人類細(xì)胞遺傳學(xué)國際命名體制 2013 版》標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分析。

1.2.2 SNP-array 技術(shù)檢測 采用德國 Qiagen 公司生產(chǎn)的 QIAamp DNA Mini Kit試劑盒提取羊水細(xì)胞的基因組 DNA，使用 TE 溶液洗脫 DNA。取 250ng DNA 進(jìn)行全基因組拷貝數(shù)變異（copy number variations，CNVs）檢測，采用美國 Affymetrix 公司提供的 CytoScanR750K芯片，包含 200 000 個(gè) SNP 探針和 550 000 個(gè) CNV 探針，采用 Chromosome Analysis Suite（ChAs）軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)結(jié)果的分析。

表1 6例胎兒顱腦異?；颊叩囊话闱闆r及超聲檢查結(jié)果

2 結(jié)果

2.1 G 顯帶核型分析結(jié)果 例 1 羊水染色體核型 46，X，i（X）（q10）（圖 1a），例 2 為 47，XY，+18（圖 1b），例 4為 46，XX，7q+（圖 1c），例 3、例 5 和例 6 核型正常，分別為 46，XY、46，XX 和 46，XY。

2.2 SNP-array 技術(shù)檢測結(jié)果 見表 2。

3 討論

本研究6例顱腦異常胎兒中前3例表現(xiàn)為小腦蚓部發(fā)育不良。例 1 的染色體核型為 46，X，i（X）（q10），表示其有 1 個(gè)等臂的 X 染色體。SNP-array 技術(shù)檢測該患者存在 Xp 的微缺失和 Yq 片段的多出。在 Xp22.33p22.2區(qū)的缺失區(qū)域包含 SHOX、STS 等 59 個(gè) OMIM 基因，涉及 Leri-Weill dyschondrostsosis（LWD）綜合征及 X 連鎖-魚鱗病，其臨床表現(xiàn)為軟骨發(fā)育不全、身材矮小、智力障礙、魚鱗癥[2-3]，一些 Turner 綜合征的患者也存在此區(qū)域基因的缺失[4]。Xp 末端缺失除出現(xiàn)上述癥狀外，還有皮質(zhì)異位、Dandy-Walker 綜合征[5]。Dandy-Walker 綜合征是一組后顱窩、小腦蚓部發(fā)育缺陷的畸形，同時(shí)具有遺傳異質(zhì)性及病因異質(zhì)性[6-7]。病因包括常染色體隱性遺傳、X 連鎖顯性疾病、多種染色體異常、環(huán)境異常等，并可伴隨多發(fā)畸形。

例 2 經(jīng) G 顯帶核型分析和 SNP-array 技術(shù)檢測均證實(shí)為 18 三體。18 三體是繼 21 三體后最為常見的染色體非整倍體，即 Edwards 綜合征[8]。Edwards 綜合征主要表現(xiàn)為生長發(fā)育遲緩、骨骼肌、皮下脂肪發(fā)育不良，枕部突出，前額窄和特殊指型，常伴有智力低下和部分顱內(nèi)異常[9]。該患者為第 18 號染色體短臂的整段重復(fù)，較為典型的 18-三體綜合征，不適合繼續(xù)妊娠。

圖1 染色體核型圖（a：例 1；b：例 2；c：例 4）

表2 6 例顱腦異常胎兒羊水 G 顯帶核型分析和 SNP-array 技術(shù)檢測結(jié)果

例 3 的核型正常，SNP-array 技術(shù)檢測存在 Yq11.23區(qū)重復(fù)，例 1 也有 Yq11.221q11.23 片段額外增加。兩者均存在多余的 Yq11.23 片段。此片段內(nèi)含 DAZ3、DAZ2等 5 個(gè) OMIM 基因，目前已有報(bào)道認(rèn)為該區(qū)域的缺失與男性少精弱精相關(guān)[10-11]，而該區(qū)域的重復(fù)未見明確致病性報(bào)道。鑒于此2例患者均存在小腦蚓部發(fā)育不良，又同時(shí)發(fā)生染色體 Yq11.23 片段增加，很可能該片段的增加或重復(fù)是小腦蚓部發(fā)育不良的遺傳學(xué)因素。

例 4 經(jīng) G 顯帶核型分析為 46，XX，7q+，但 SNP-array 技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)染色體 7q35q36.3 區(qū)發(fā)生 14.9Mb 片段缺失，在染色體 9p24.3p21.1 區(qū)發(fā)生 32.8Mb 片段重復(fù) 。 7q35q36.3 片 段 內(nèi) 含 TPK1、CNTNAP2 等 59 個(gè)OMIM 基因，其缺失與前腦無裂畸形、小頭畸形、異常面容、嚴(yán)重智力障礙、癲癇、身材矮小、陰莖陰囊移位、尺骨缺如相關(guān)[12]，也有部分運(yùn)動遲緩、智力低下和顏面部異常[13]。9p24.3p21.1 片段重復(fù)與中樞神經(jīng)系統(tǒng)與骨骼系統(tǒng)發(fā)育不良、精神運(yùn)動發(fā)育遲滯相關(guān)[14-15]。患者的草莓頭、外生殖器特征不明顯均與上述 7q35q36.3 片段缺失的表型相符合。

例 5 和例 6 的 G 顯帶核型分析和 SNP-array 技術(shù)檢測均未見染色體異常。胼胝體發(fā)育不全也有部分患者存在染色體顯性或隱性異常，以及X連鎖等遺傳模式，極少部分腦積水患者存在遺傳學(xué)因素[16]?？梢哉J(rèn)為這 2例的表型非遺傳學(xué)因素造成，可能與妊娠期病毒感染、用藥、射線、毒物接觸史或者其他未知因素有關(guān)。

從以上分析可以看到，3例存在小腦蚓部發(fā)育不良者染色體核型有 18三體，有等臂染色體，也有核型正常，但其在基因角度均發(fā)現(xiàn)染色體 CNVs。1 例草莓頭合并生殖器異常者經(jīng)過 SNP-array 技術(shù)檢測也證實(shí)了存在基因的異常。1例胼胝體發(fā)育不全和1例腦積水伴羊水過多者在染色體核型的基因芯片均未見異常。筆者認(rèn)為小腦蚓部缺失或發(fā)育不良可能與 Xp22.33p22.2 區(qū)缺失、Yq11.23 片段的增加以及 18 三體等有關(guān)。7q35q36.3片段缺失可能是草莓頭、外生殖器異常的遺傳學(xué)因素。胝體發(fā)育不全和腦積水可能與遺傳因素不相關(guān)，但仍需大樣本進(jìn)一步研究來證實(shí)。

G顯帶核型分析可以檢測整條染色體和大的片段，但其分辨率較低，無法識別較小的染色體片段。SNP-array 技術(shù)可以檢測出較為微小的染色體缺失或重復(fù)，對致病區(qū)域和致病基因精確定位，并明確受累基因片段的大小。在產(chǎn)前診斷，隨著超聲分辨率的提高和超聲醫(yī)生經(jīng)驗(yàn)的累積，越來越多的胎兒異常得以在孕期及時(shí)發(fā)現(xiàn)，并且檢出的孕周逐漸提前。對于一些少見的超聲異常、多發(fā)性異常，存在家族性遺傳病史者，以及一些染色體核型的變化，孕期采取何種診療方案通常較為棘手。SNP-array 技術(shù)可在中孕期即對疑似異常的胎兒經(jīng)羊水分析胎兒的基因變化，明確胎兒是否存在遺傳學(xué)變異，指導(dǎo)和幫助醫(yī)生和孕婦的進(jìn)一步選擇。

[1] Macé A,Tuke M A,Beckmann J S,et al.New quality measure for SNP array based CNV detection[J].Bioinformatics(Oxford, England),2016,32(21):3298-3305.doi:https://doi.org/10.1093/ bioinformatics/btw477.

[2] Esplin E D,Li B,Slavotinek A,et al.Nine patients with Xp22.31 microduplication,cognitive deficits,seizures,and talipes anomalies[J].Am J Med Genet A,2014,164A(8):2097-2103.doi:10. 1002/ajmg.a.36598.

[3] 黃際衛(wèi),唐寧,李伍高,等.1 個(gè) X- 連鎖魚鱗病家系的基因突變鑒定與產(chǎn)前診斷[J].中國當(dāng)代兒科雜志,2016,18(11):83-87.

[4] Seo G H,Kang E,Cho J H,et al.Turner syndrome presented with tall stature due to overdosage of the SHOXgene[J].Ann Pediatr Endocrinol Metab,2015,20(2):110-113.doi:10.6065/apem. 2015.20.2.110.

[5] Van Steensel M A,Vreeburg M,Engelen J,et al.Contiguous gene syndrome due to a maternally inherited 8.41 Mb distal deletion of chromosome band Xp22.3 in a boy with short stature,ichthyosis,epilepsy,mental retardation,cerebral cortical heterotopias and Dandy-Walker malformation[J].Am J Med Genet A,2008, 146A(22):2944-2949.doi:10.1002/ajmg.a.32473.

[6] Cueva-Nú?ez J E,Lozano-Bustillo A,Irias- álvarez M S,et al. Dandy-Walker variant:case report[J].Rev Chil Pediatr,2016,87(5):406-410.doi:10.1016/j.rchipe.2016.01.011.

[7] Reeder M R,Botto L D,Keppler-Noreuil K M,et al.Risk factors for Dandy-Walker malformation:a population-based assessment[J].Am J Med Genet A,2015,167A(9):2009-2016.doi:10.1002/ ajmg.a.37124.

[8] Roberts W,Zurada A,Zurada-ZieliSka A,et al.Anatomy of tris-omy 18[J].Clinical anatomy(New York,N.Y.),2016,29(5): 628-632.

[9] Crawford D,Dearmun A.Edwards'syndrome[J].Nursing children and young people,2016,28(10):17.

[10] Alimardanian L,Saliminejad K,Razi S,et al.Analysis of partial azoospermia factor c deletion and DAZ copy number in azoospermia and severe oligozoospermia[J].Andrologia,2016,48(9): 890-894.doi:10.1111/and.12527.

[11] 仕治達(dá),陶國振,孫林,等.Y染色體微缺失影響男性不育的研究進(jìn)展[J].中國性科學(xué),2014,23(7):79-82.

[12] Shim S H,Shim J S,Min K,et al.Siblings with opposite chromosome constitutions,dup(2q)/del(7q)and del(2q)/dup(7q)[J]. Gene,2014,534(1):100-106.doi:10.1016/j.gene.2013.09.093.

[13] Ruiz-Botero F,Pachajoa H.Deletion 21q22.3 and duplication 7q35q36.3 in a Colombian girl:a case report[J].Journal of me-

Application of single nucleotide polymorphism array in prenatal diagnosis of craniocerebral abnormality

LI Maoyu,ZHAGN Su,SHEN Xueping,et al.
Prenatal Diagnosis Center,Huzhou Maternity and Child Care Hospital,Huzhou 313000,China

l case reports,2016,10:204.

10.1186/s13256-016-0988-2.

2017-01-10）

（本文編輯：陳麗）

doi:10.12056/j.issn.1006-2785.2017.39.11.2017-75

313000 湖州市婦幼保健院產(chǎn)前診斷中心

李茂宇，E-mail：583429226@qq.com

[14] Amasdl S,Natiq A,Elalaoui S C,et al.Insulin-like growth factor type 1 deficiency in a Moroccan patient with de novo inverted duplication 9p24p12 and developmental delay:a case report [J].J Med Case Rep,2016,10(1):122.doi:10.1186/s13256-016-0830-x.

[15] Guilherme R S,Meloni VA,Perez A B,et al.Duplication 9p and their implication to phenotype[J].BMC medical genetics,2014, 15:142.doi:10.1186/s12881-014-0142-1.

[16] Marsh A P,Lukic V,Pope K,et al.Complete callosal agenesis, pontocerebellar hypoplasia,and axonalneuropathy due to AMPD2 loss[J].Neurol Genet,2015,1(2):e16.doi:10.1212/NXG. 0000000000000014.eCollection 2015 Aug.