高 寧， 劉 灑 灑， 包 汭 琪， 謝 同 舟， 紀 超 凡， 董 秀 萍， 林 心 萍

( 1.大連工業(yè)大學 食品學院， 遼寧 大連 116034；2.大連工業(yè)大學 國家海洋食品工程技術研究中心， 遼寧 大連 116034 )

營養(yǎng)脅迫調控彎曲隱球酵母轉化N-乙酰-D-葡萄糖胺生產油脂

高 寧1,2， 劉 灑 灑1,2， 包 汭 琪1,2， 謝 同 舟1,2， 紀 超 凡1,2， 董 秀 萍1,2， 林 心 萍1,2

( 1.大連工業(yè)大學 食品學院， 遼寧 大連 116034；2.大連工業(yè)大學 國家海洋食品工程技術研究中心， 遼寧 大連 116034 )

以一株可利用N-乙酰-D-葡萄糖胺(GlcNAc)為唯一碳源的菌株——彎曲隱球酵母(CryptococcuscurvatusATCC 20509)為研究對象，分別采用磷元素限制和硫元素限制，考察對其油脂積累的影響，并對脂肪酸組分進行了分析。結果表明，磷、硫元素均可調控該酵母在氮源豐富條件下的油脂積累，油脂含量和油脂得率隨碳磷摩爾比的增高而增高，隨碳硫摩爾比的增高呈先上升后下降的趨勢。脂肪酸組分分析表明，飽和脂肪酸含量隨著碳磷摩爾比的增加先下降后上升，隨著碳硫摩爾比的增加呈先上升后下降的趨勢。

彎曲隱球酵母；油脂；營養(yǎng)脅迫

0 引 言

隨著油脂需求量的日益增加，動植物油脂已經不足以滿足人類的需求，開發(fā)微生物油脂迫在眉睫[1-2]。近年來，采取了多種油脂合成的調控策略，其中氮元素限制(即高n(C)/n(N))是現有最常用的調控策略[3-4]。除氮源外，磷、硫和金屬元素等成分的改變也可對油脂合成產生影響[5-6]。Wu等[7]在氮源豐富的情況下，改變培養(yǎng)基中的n(C)/n(P)，微生物中油脂的含量顯著提高；而在培養(yǎng)基中加入低濃度的Na2SO4可促進油脂合成[8]。這些調控方式為自然界中富氮生物質的利用提供了靈活的策略。甲殼素是自然界中含量僅次于纖維素的一種多糖，是海洋中的第一大生物質。然而以甲殼素單體——N-乙酰-D-葡萄糖胺生產微生物油脂的報道較為少見[9-10]，原因在于N-乙酰-D-葡萄糖胺中氮含量高，不適合于常規(guī)的氮限制調控策略。

本實驗以前期篩選的一株可利用N-乙酰-D-葡萄糖胺為唯一碳源的彎曲隱球酵母為研究對象[10]，分別采用硫元素限制和磷元素限制兩種調控方式，探討其在富氮培養(yǎng)基中積累油脂的能力，并分析不同培養(yǎng)條件下的脂肪酸組成成分，以期為富氮生物質為原料的微生物油脂工業(yè)化生產提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 菌 種

彎曲隱球酵母CryptococcuscurvatusATCC 20509，美國ATCC菌種保藏中心。

1.1.2 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖 20，蛋白胨 10，酵母粉 10，pH 6.0。

限磷培養(yǎng)基(g/L)：GlcNCOOH 70，(NH4)2SO45.0，MgSO40.732，痕量元素溶液10 mL/L。以KH2PO4為磷元素的添加，質量濃度分別為3.6、0.5和0.01 g/L[7]。

限硫培養(yǎng)基(g/L)：GlcNCOOH 70，MgCl2·6H2O 1.5，Na2HPO41.0，KH2PO41.0，痕量元素溶液10 mL/L。以Na2SO4為硫元素的添加，質量濃度分別為2.0、0.5和0.01 g/L[8]。

痕量元素溶液配方(g/L)：CaCl2·2H2O 4.0， 水合檸檬酸 0.52， FeSO4·7H2O 0.55， MnSO4·H2O 0.076， ZnSO4·7H2O 0.10， 100 μL 18 mol/L H2SO4。

1.2 方 法

1.2.1 種子液制備

將活化的酵母菌接種于50 mL種子液，200 r/min，28 ℃培養(yǎng)25 h。7 800g離心8 min，0.9%無菌生理鹽水清洗2次，再用50 mL的0.9%無菌生理鹽水重懸。種子液以OD600=0.35取5 mL 接種于45 mL培養(yǎng)基，200 r/min，28 ℃培養(yǎng)，每24 h調pH至5.3～5.6，搖瓶培養(yǎng)121 h。

1.2.2 菌體生物量的測定

發(fā)酵液于7 800g離心8 min，105 ℃下菌體烘干至恒重，測定菌體生物量。

1.2.3 殘?zhí)堑臏y定

采用Imoto的方法測定培養(yǎng)基中N-乙酰-D-葡萄糖胺剩余量。以N-乙酰-D-葡萄糖胺質量濃度為橫坐標、吸光度為縱坐標，繪制標準曲線。公式為y=4.414x+0.003(R2=0.995)。

1.2.4 微生物脂質體生物成像分析

微生物積累油脂后其胞內存在的脂肪體 (lipid body) 可在光學顯微鏡下觀測到，取發(fā)酵液于40倍物鏡進行鏡檢并拍照。

1.2.5 油脂的提取

采用酸熱法[11]，以每升發(fā)酵液中含油脂的克數(g/L)表示油脂量；油脂含量為油脂量占生物量的質量分數；油脂得率為每克糖所生成的油脂質量。

1.2.6 菌油脂肪酸組分分析

脂肪酸甲酯化處理：取油脂約0.1 g，加入2 mL 0.5 mol/L KOH-CH3OH，60 ℃水浴2 h。冷卻后用6 mol/L鹽酸調pH小于1.0，10 mL正己烷萃取，氮吹至恒重，再加1 mL正己烷和2 mL 甲基化試劑，70 ℃水浴1 h，冷卻后取出正己烷層水洗至中性，加入無水硫酸鈉干燥過夜。

采用安捷倫6890N GC-5973 MSD氣質聯用儀分析。HP-5-MS毛細管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，載氣為氦氣。分析條件：初始溫度50 ℃，保持1 min；以50 ℃/min升至170 ℃；以4 ℃/min 升至300 ℃；以40 ℃/min升到320 ℃，保持3.6 min。選取Scan模式，分析采用EI源(70 eV)，溶劑延遲4 min，掃描范圍50～550m/z。

2 結果與討論

2.1 磷元素限制調控對彎曲隱球酵母產油的影響

2.1.1 不同濃度的磷酸鹽對彎曲隱球酵母生長及油脂量的影響

設置3種n(C)/n(P)的培養(yǎng)基，于培養(yǎng)基中加入不同量的KH2PO4，形成n(C)/n(P)為96、689、34 451三種培養(yǎng)環(huán)境，n(C)/n(P)=96為對照組。由表1可見，培養(yǎng)121 h后，隨著n(C)/n(P) 的增大，生物量呈逐漸下降的趨勢，其中對照組的生物量為22.9 g/L，說明在該環(huán)境中菌體營養(yǎng)豐富，生物量增長較快，然而油脂含量僅為10.4%，油脂生產量只有2.4 g/L，油脂得率為0.039 g/g，糖轉化為油脂的效率低，說明碳源絕大部分應用于菌體合成，未用于油脂合成；實驗組n(C)/n(P)=689和n(C)/n(P)=34 451組的生物量分別為10.6和8.0 g/L，較n(C)/n(P)=96組均較低，說明菌體可能由于缺乏磷元素處于生長不良的狀態(tài)。實驗組n(C)/n(P)=689中，雖然殘?zhí)鞘Ｓ噍^多，但在相同的時間內，菌體油脂含量達到24.7%，油脂量也較對照組有所增長。實驗組n(C)/n(P)=34 451中的菌體油脂含量增加到63.2%，油脂生產量為5.2 g/L，為n(C)/n(P)=96時的2.16倍，油脂得率也為對照組的2.48倍，說明當磷元素受到限制時，碳源絕大部分流向油脂合成途徑。Wu等[9]采用彎曲隱球酵母發(fā)酵N-乙酰-D-葡萄糖胺，在120 h時，耗糖量約為65 g/L，胞內油脂質量分數達到45.4%。而在本實驗中，彎曲隱球酵母消耗52.7 g/L的N-乙酰-D-葡萄糖胺，可積累超過細胞干重63.2% 的油脂。可見采用磷元素限制的調控策略能夠使得N-乙酰-D-葡萄糖胺更多的流向油脂合成方向。

對發(fā)酵終點微生物菌體進行脂質體生物成像分析，結果如圖1所示。在n(C)/n(P)為96(圖1(a))的培養(yǎng)條件下，彎曲隱球酵母胞內含有較少的油脂；而當n(C)/n(P)提高到689和34 451(圖1(b)、(c))，發(fā)酵終點的菌體中可觀測到明顯的油滴狀物質，該結果與油脂含量分析的結果吻合。

表1 不同質量濃度的KH2PO4條件下彎曲隱球酵母生長及產油結果

(a) ρ(KH2PO4)=3.6 g/L

(b) ρ(KH2PO4)=0.5 g/L

(c) ρ(KH2PO4)=0.01 g/L

圖1C.curvatusATCC 20509在不同質量濃度的KH2PO4條件下微生物脂質體成像結果

Fig.1 Liposomes results ofC.curvatusATCC 20509 at different KH2PO4concentrations

結果表明，彎曲隱球酵母在含低濃度的KH2PO4培養(yǎng)基中生長時，糖代謝流能選擇性地轉向油脂生物合成，隨著磷元素含量的降低，油脂量顯著增加。因此，在氮元素豐富的情況下，較強的磷脅迫可用于調控微生物的油脂生產。

2.1.2 不同濃度的磷酸鹽對彎曲隱球酵母油脂成分的影響

采用GC-MS對不同n(C)/n(P)下培養(yǎng)所得油脂樣品進行分析，結果如表2所示，其中油酸(18∶1)含量最高，其次分別是棕櫚酸(16∶0)和硬脂酸(18∶0)，這3種脂肪酸含量之和占總脂肪酸含量90%以上，這與Liu等[12]的研究成果相似，也與Wu等[9]此前研究的在不限制磷元素條件下的脂肪酸組成相似。同時，磷元素營養(yǎng)限制對油脂的脂肪酸組成影響較大：隨著n(C)/n(P)的增加，飽和脂肪酸含量呈先下降后升高的趨勢，且變化顯著，當n(C)/n(P)為96、689和34 451時，飽和脂肪酸質量分數分別為45.2%、38.8%和65.5%。因此，磷元素調控還可作為一種調控脂肪酸組成的有效手段。

表2 不同碳磷摩爾比下彎曲隱球酵母脂肪酸組分

2.2 硫元素限制調控對彎曲隱球酵母產油影響

2.2.1 不同濃度的硫酸鹽對彎曲隱球酵母生長及油脂量的影響

設置3種n(C)/n(S)培養(yǎng)基，通過添加不同量的Na2SO4，形成n(C)/n(S)分別為180、719和35 958的培養(yǎng)環(huán)境，其中n(C)/n(S)=180為對照組。經過121 h培養(yǎng)，彎曲隱球酵母生物量分別為18.8、13.0和6.6 g/L，隨著硫元素的減少，生物量呈逐漸下降的趨勢，說明硫元素缺乏時，不利于菌體繁殖，該趨勢與磷元素限制相類似。胞內油脂含量隨著硫元素的減少呈上升趨勢，從16.2%上升到56.4%，說明硫元素限制能夠促進彎曲隱球酵母中油脂含量的積累。油脂生產量及油脂得率均呈先上升后下降的趨勢，由3.0 g/L (n(C)/n(S)=180)上升到6.0 g/L (n(C)/n(S)=719)再下降到3.8 g/L (n(C)/n(S)=35 958)，說明硫元素的適量限制可誘導菌體內的油脂生產，但是，過度的限制反而會對油脂的生產產生不良影響。

對發(fā)酵終點微生物菌體進行脂質體生物成像分析，結果如圖2所示。在n(C)/n(S)為180(圖2(a))的培養(yǎng)條件下，彎曲隱球酵母胞內含有較少的油脂，而隨著n(C)/n(S)從719提高到35 958(圖2(b)、(c))，微生物菌體內油滴狀物質明顯增多變大，該結果與油脂含量分析的結果吻合。

結果表明，彎曲隱球酵母在含低濃度Na2SO4的培養(yǎng)基中生長時，糖代謝流能選擇性地轉向油脂生物合成，然而過低濃度的硫元素限制不僅影響生物量的積累，還可能導致油脂生物合成途徑中的必要條件受阻，影響油脂量積累及底物利用速率和效率。由此可知，在氮元素豐富的情況下，微弱的硫脅迫可作為一種有效調控油脂生產的方式。

表3 不同質量濃度Na2SO4條件下彎曲隱球酵母生長及產油結果

(a) ρ(Na2SO4)=2.0 g/L

(b) ρ(Na2SO4)=0.5 g/L

(c) ρ(Na2SO4)=0.01 g/L

圖2C.curvatusATCC 20509在不同質量濃度的Na2SO4條件下微生物脂質體生物的成像結果

Fig.2 Liposomes results ofC.curvatusATCC 20509 at different Na2SO4concentrations

2.2.2 不同濃度的硫酸鹽對彎曲隱球酵母油脂成分的影響

采用GC-MS對不同n(C)/n(S)培養(yǎng)條件下所得油脂樣品進行分析，結果如表4所示，其中油酸(18∶1)含量最高，其次分別是棕櫚酸(16∶0)和硬脂酸(18∶0)，這3種脂肪酸質量分數之和占總脂肪酸質量分數90%以上，這與Liu等[12]的研究成果相似。此外，實驗結果還表明，硫元素限制對油脂的脂肪酸組成影響很大：飽和脂肪酸含量隨著n(C)/n(S)的增加，呈先增加后減少的趨勢，在n(C)/n(S)為180、719和35 958時，飽和脂肪酸質量分數分別為46.4%、60.8%和56.0%，該趨勢與磷元素限制相反。說明硫元素限制對脂肪酸組成產生較大影響，有望通過對硫元素的調控直接調控菌油的脂肪酸組成。

表4 不同碳硫摩爾比下彎曲隱球酵母脂肪酸組分

3 結 論

采用磷元素和硫元素限制對彎曲隱球酵母的油脂積累進行調控。結果表明，提高培養(yǎng)基的n(C)/n(P) 或n(C)/n(S)均能夠促進微生物的油脂積累。油脂含量和油脂得率隨著n(C)/n(P)的增加而升高，隨著n(C)/n(S)的增加先上升后下降。對脂肪酸組分進行分析表明，菌油中油酸含量最高，其次是棕櫚酸和硬脂酸。n(C)/n(P)和n(C)/n(S)對脂肪酸的成分也產生影響，隨著n(C)/n(P)的增高，飽和脂肪酸含量先下降后上升；而隨著n(C)/n(S)的增高，飽和脂肪酸含量先上升后下降。因此有望通過對磷元素或硫元素的調控，直接調控菌油的脂肪酸組成。本研究為營養(yǎng)元素脅迫調控微生物轉化甲殼素單體——N-乙酰-D-葡萄糖胺生產微生物油脂，提高其產量及改變油脂成分提供了依據，此外，該實驗結果也為富氮生物質生產微生物油脂提供了新的思路和策略。

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Regulation of lipid accumulation from N-acetyl-D-glucosamine byCryptococcuscurvatusunder nutrition stress conditions

GAO Ning1,2, LIU Sasa1,2, BAO Ruiqi1,2, XIE Tongzhou1,2,JI Chaofan1,2, DONG Xiuping1,2, LIN Xinping1,2

( 1.School of Food Science and Technology, Dalian Polytechnic University, Dalian 116034, China；2.National Engineering Research Center of Seafood, Dalian Polytechnic University, Dalian 116034, China )

CryptococcuscurvatusATCC 20509 using N-acetylglucosamine as unique carbon source was used to investigate phosphorus and sulfate limitation impact on lipid accumulation, and fatty acid compositions were also analyzed by GC-MS. The results illustrated that both phosphorus and sulfur limitation could regulate lipid accumulation under nitrogen-rich condition. The lipid content and yield increased withn(C)/n(P) ratio increasing, while, increased initially and then decreased withn(C)/n(S) ratio increasing. The fatty acid analysis showed that the content of saturated fatty acid decreased first and then increased withn(C)/n(P) ratio increasing, while the content of saturated fatty acid increased first and then decreased withn(C)/n(S) ratio increasing.

Cryptococcuscurvatus; lipid; nutrition stress conditions

2016-09-29.

國家自然科學基金項目(3150100464)；中國博士后科學基金項目(2016M591419).

高 寧(1989-),女,碩士研究生；通信作者：林心萍(1985-),女,講師.

TS222;Q815

A

1674-1404(2017)03-0157-05

高寧,劉灑灑,包汭琪,謝同舟,紀超凡,董秀萍,林心萍.營養(yǎng)脅迫調控彎曲隱球酵母轉化N-乙酰-D-葡萄糖胺生產油脂[J].大連工業(yè)大學學報,2017,36(3):157-161.

GAO Ning, LIU Sasa, BAO Ruiqi, XIE Tongzhou, JI Chaofan, DONG Xiuping, LIN Xinping. Regulation of lipid accumulation from N-acetyl-D-glucosamine byCryptococcuscurvatusunder nutrition stress conditions[J]. Journal of Dalian Polytechnic University, 2017, 36(3): 157-161.