陳曼麗 陳孟輝 宮蕊 張翠召 唐龍妹 齊莉莉

·論著·

忽略種族及生活方式等因素的冠狀動脈粥樣硬化患者常見基因分析篩查

陳曼麗 陳孟輝 宮蕊 張翠召 唐龍妹 齊莉莉

目的 篩選冠狀動脈粥樣硬化主要相關(guān)基因，以指導(dǎo)疾病的早期診斷、遠期預(yù)防。方法 檢測參與冠心病(CAD)發(fā)生發(fā)展的基因，通過搜索基因表達綜合數(shù)據(jù)庫(GEO)收集來自不同大洲的CAD患者的血液樣本基因表達研究。對各大洲CAD患者和正常對照組(NC)之間的基因表達的比較分析，確定不同大洲CAD患者和NC之間差異表達基因的普通集合(DEGS)。對差異表達基因通過Cytoscape軟件，建立共同的PPI網(wǎng)絡(luò)。了解其在CAD中的生物學(xué)作用。結(jié)果 基因庫中：亞洲、歐洲和北美洲CAD患者和對照組之間，分別有575個，868個和476個基因被確定為重要的存在差異表達的基因。在三個不同大洲發(fā)現(xiàn)24個基因與CAD相關(guān)，6個與早起CAD或動脈粥樣硬化有關(guān)的基因。在PPI網(wǎng)絡(luò)中重要的樞紐蛋白，包括IRF4(階=23)、PLAUR(階=17)和hist1h2ae(階=15)。結(jié)論 忽略民族、種族、生活方式和環(huán)境因素的差異，這種檢測方式可以為了解CAD的發(fā)病機制提供重要的監(jiān)測手段，并推動診斷標(biāo)志物和有效的治療策略的發(fā)展。

冠狀動脈疾病;不同大陸;基因表達;共同基因

冠心病(CAD)，作為一種復(fù)雜的慢性疾病，受遺傳、環(huán)境及生活方式等多種因素影響[1,2]。盡管在CAD的預(yù)防和治療方面取得相當(dāng)大的進展，但是它的并發(fā)癥、發(fā)病率和死亡率仍然很高[3]，在不同的民族有很大的差異。南亞(SA)包括印度、巴基斯坦、孟加拉、或斯里蘭卡血統(tǒng)，被認為比其他民族有更高的患冠心病的風(fēng)險[4,5]，可能由于一些特定的感染如結(jié)核分支桿和巨細胞病毒感染所致[6]。然而，已知的文章報告中，種族/族裔與CAD的聯(lián)系是復(fù)雜的，由于在種族/族裔群體的異質(zhì)性，故而報道已知性甚少。最近的大規(guī)?；虮磉_譜的研究，表明遺傳基因表達的改變與CAD發(fā)生、發(fā)展相關(guān)，并提供了在不同大洲此類疾病發(fā)生分子環(huán)境的有價值的信息[7-10]。識別CAD的潛在的差異性表現(xiàn)的基因表達機制，可能會對CAD的預(yù)防和治療確立新的目標(biāo)。在這項研究中，我們假設(shè)CAD是由一組共同的基因介導(dǎo)的，這組基因無論種族、族裔、生活方式和(或)環(huán)境因素的差異。我們分析和比較來源于不同大洲的患有CAD人群的基因表達的明顯特征，以確定一組共同表達的基因，這可能為了解CAD的發(fā)病機制提供了關(guān)鍵基礎(chǔ)，并且促進診斷標(biāo)志物和有效的治療策略的發(fā)展。

1 材料與方法

CAD中符合條件的基因表達譜的篩選是通過搜索基因表達綜合數(shù)據(jù)庫來確定的(GEO, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo)[11],并使用以下關(guān)鍵詞及其組合：“冠狀動脈疾病、基因表達、基因芯片”作為入選詞條。我們只采用了原始的實驗文章，分析CAD和對照組血液樣本基因表達譜。非人類研究，綜述文章和表達譜的綜合分析，不納入此實驗分析。

1.1 數(shù)據(jù)預(yù)處理 不同的微陣列平臺、基因命名和臨床樣本所產(chǎn)生的不同的微陣列數(shù)據(jù)之間的異質(zhì)性，使它難以直接比較基因表達數(shù)據(jù)。處理此類問題上，我們應(yīng)用一個全球性的標(biāo)準化的方法應(yīng)盡量減少不一致。因此，我們通過分位數(shù)標(biāo)準化和log2轉(zhuǎn)換預(yù)處理每個研究的原始微陣列數(shù)據(jù)得到強度值。

1.2 不同大洲基因差異表達的功能注釋 用基因本體表達(GO)去詮釋不同大洲基因差異表達的生物學(xué)作用?；虮磉_將顯示分析基因集的功能注釋和分類。此外，KEGG數(shù)據(jù)庫是公認的綜合數(shù)據(jù)庫，KEGG通路富集分析WASL還檢測到潛在的基因差異表達途徑。這將有助于我們了解關(guān)于新陳代謝、細胞過程、人類疾病和其他的分子間的相互作用和反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)[12]。應(yīng)用Web訪問的程序GENECODIS13，分析這些功能。

1.3 不同大洲常見基因集合的鑒定 對比不同大洲的基因表達差異，并且識別共同基因。為了解在CAD常見基因的生物學(xué)作用，進行蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(PPI)分析。PPI分析可以在分子和細胞活動規(guī)則上顯示蛋白質(zhì)的功能(包括生長、發(fā)育、代謝規(guī)律，分化和凋謝)。我們通過檢索基因/蛋白相互作用的檢索工具(STRING)(HTTP：//www.string-db.org/)(這是一個已知和預(yù)測蛋白質(zhì)相互作用構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)的數(shù)據(jù)庫)，然后使用Cytoscape軟件，使得PPI網(wǎng)絡(luò)上常見基因的分布特征可視化以供實驗需求。

1.4 統(tǒng)計分析 應(yīng)用矩陣實驗室(MATLAB)軟件來識別CAD與NC之間的差異表達基因(DEGS)。首先進行一個基因特異性t檢驗，然后計算出個體的微陣列研究的P值。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同大洲的CAD基因表達差異 收集依據(jù)納入標(biāo)準來自外周血的總共4個CAD表達譜：1組歐洲(gse12288)，1組亞洲(gse42148)和2組北美洲(gse20680，gse20681)。為全球標(biāo)準化的目的，我們通過分位數(shù)標(biāo)準化和log2轉(zhuǎn)換預(yù)處理原始微陣列數(shù)據(jù)得到基因表達譜每個探針的強度值。采用Matlab軟件識別CAD和NC樣本之間的基因表達差異。最終，亞洲、歐洲、北美洲CAD與NC樣本比較下575 868和476個基因被認為是重要明顯表達的差異(P<0.05)。

2.2 差異表達基因的功能注釋 為描述不同大洲CAD的基因表達差異的主要生物主題，我們通過基于網(wǎng)絡(luò)的軟件GENEGODIS，進行GO分類和KEGG通路富集統(tǒng)計分析?；虮磉_如在蛋白信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，血液凝固，細胞粘附，免疫應(yīng)答，磷脂的生物合成過程，脂質(zhì)代謝過程和感染等方面，一些共同的基因表達作為4個CAD表達譜中此類基因功能的注釋標(biāo)注。見圖1～3。

圖1 亞洲人群CAD患者基因差異表達的顯著富集的功能注釋。A，生物過程中GO分類富集統(tǒng)計前10位。B，KEGG通路富集統(tǒng)計前10位

圖2 歐洲人群CAD患者基因差異表達的顯著富集的功能注釋。A，生物過程中GO分類富集統(tǒng)計前10位。B，KEGG通路富集統(tǒng)計前10位

圖3 美洲人群CAD患者基因差異表達的顯著富集的功能注釋。A，生物過程中GO分類富集統(tǒng)計前10位。B，KEGG通路富集統(tǒng)計前10位

2.3 識別不同大陸的常見基因 在來自歐洲、亞洲和北美的人群中發(fā)現(xiàn)了在CAD患者中有24個基因差異表達。其中6個基因在CAD或動脈粥樣硬化發(fā)病前表達，與此相關(guān)。不同大洲常見基因的PPI網(wǎng)絡(luò)，是通過Cytoscape軟件了解CAD表達基因的生物學(xué)作用所建立的。在PPI網(wǎng)絡(luò)，比較度高低依據(jù)是基因蛋白比鄰點直接連接的多少，度高的節(jié)點被定義為樞紐的蛋白質(zhì)，重要的樞紐蛋白質(zhì)包含IRF4(度=23)、PLAUR(度=17)和hist1h2ae(度=15)。見表1，圖4、5。

3 討論

我們確定了來自歐洲、北美洲和亞洲的CAD患者的868、476和575差異表達基因。這些基因編碼的蛋白參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、血凝、細胞粘附、免疫應(yīng)答、磷脂生物合成過程、脂質(zhì)代謝過程和感染，這些作用在冠心病的發(fā)展中起重要作用。全身及局部炎性反應(yīng)包括免疫細胞的活化以及此類細胞遷移到血管壁，這已被證明在冠狀動脈粥樣硬化性心臟病中起到重要的病理生理作用[16，17]。

已經(jīng)證實，白細胞的粘附激活內(nèi)皮細胞，并遷移到膜下，促使冠狀動脈斑塊形成、增長并且增加其不穩(wěn)定性[18]。最近的一項綜合基因組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)了脂質(zhì)代謝、凝血、免疫功能與CAD相關(guān)的基因網(wǎng)絡(luò)[19]。大量的研究報告了人類CAD與某些細菌和病毒長期接觸持續(xù)感染具有相關(guān)性[20,21]。盡管來源于歐洲、北美洲和亞洲中CDA患者的基因差異表達集合，無任何重疊。但是在這個基因集合中仍然發(fā)現(xiàn)了共同表達的24個基因，并且6個基因與早期冠心病和動脈粥樣硬化有關(guān)。以下簡述此六基因的特性。

圖4 歐洲、亞洲、北美洲人群CAD患者基因差異表達餅圖

圖5 基于PPI網(wǎng)絡(luò)基因庫，共同基因蛋白之間相互聯(lián)系以及各組間相互作用(紅色和藍色的節(jié)點分別代表對基因差異表達的上下調(diào)節(jié)度,紫色的節(jié)點表示的蛋白質(zhì)是關(guān)于基因預(yù)測與基因差異表達相互關(guān)系)

表1 在亞洲、歐洲和北美洲的CAD患者中發(fā)現(xiàn)的上調(diào)或下調(diào)的24個基因

PLAUR是纖溶酶原激活劑(PA)系統(tǒng)的重要組成部分，它可能會使血栓形成，調(diào)節(jié)血管損傷反應(yīng)。另外通過膽固醇喂養(yǎng)家兔實驗研究驗證發(fā)現(xiàn)，PLAUR在早期的動脈硬化進程中可以被顯著上調(diào)[22]。如組織型PA，動脈粥樣硬化的動脈往往增加內(nèi)膜PLAUR表達，而血管內(nèi)膜中層蛋白表達使PLAUR表達率有較大增加[23]。兩者互相促進。

TNFRSF10C和一種胞外TRAIL結(jié)合區(qū)域和一個跨膜結(jié)構(gòu)域組成一個TRAIL膜結(jié)合的誘導(dǎo)受體，它用NF-κbdependent方式通過調(diào)節(jié)血管平滑肌細胞(VSMC)IGF1R的表達在動脈粥樣硬化中發(fā)揮著重要作用。由于缺乏凋亡結(jié)構(gòu)域或凋亡結(jié)構(gòu)域功能，低濃度的TRAIL無法誘導(dǎo)VSMC凋亡，此種情況下，TNFRSF10C和DR4促進VSMC增殖[24,25]。

ID3成為在免疫和血管壁細胞抗脈粥樣硬化途徑中的一個重要的基因上游調(diào)節(jié)器，通過對冠心病患者中的ID3的功能性顯著多態(tài)性的識別調(diào)節(jié)，被認為直接與人冠狀動脈病變相關(guān)[26,27]。

通過FGA編碼的蛋白是纖維蛋白原的α組分，它與凝血反應(yīng)和動脈粥樣硬化的發(fā)展密切相關(guān)[28,29]。一些前瞻性研究顯示，血漿纖維蛋白原水平與冠心病和心肌梗死的風(fēng)險密切相關(guān)[30]。FGB rs1800787和rs1800789 SNPs作為次要等位基因純合子的表達可能增強對冠心病患者的保護，使發(fā)病風(fēng)險降低約50%[31]。

IRF4為干擾素調(diào)節(jié)因子(IRF)家族的成員之一，作為最初被描述為原始免疫和適應(yīng)性免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)中信號傳導(dǎo)和功能的下游調(diào)節(jié)器[32]，被認定為在PPI網(wǎng)絡(luò)最重要的樞紐蛋白。IRF4也與炎性反應(yīng)密切相關(guān)[33]。在人類和小鼠的心肌細胞中，作為轉(zhuǎn)錄因子IRF4在免疫細胞中高表達。IRF4在人類擴張型心肌病和小鼠肥厚型心臟病中表達下調(diào)，表明IRF4在心肌肥厚和衰竭的過程中的起重要作用。

在先前闡述的24個與CAD相關(guān)的基因中，一些基因，如F13B，serinc1，mboat2，hist1h2ae和hist1h3b通過參與凝血、磷脂的生物合成過程等相關(guān)功能，可能與CAD發(fā)生發(fā)展有關(guān)。

這些數(shù)據(jù)如實來自亞洲、歐洲和北美洲人群基因表達綜合數(shù)據(jù)庫中。通過此數(shù)據(jù)分析研究表明CAD患者和對照組樣本存在基因差異表達。盡管來自不同大洲的CAD確定的基因差異表達集合，由于健康差距等多種因素在很大程度上不重疊的，但是一組共同的24個基因被確定下來。故亞洲、歐洲和北美的樣本獲得的結(jié)果之間的一致性，表明忽略種族、生活方式或環(huán)境因素的CAD及動脈硬化的進程，可能被同樣的基因途徑調(diào)停。

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10.3969/j.issn.1002-7386.2017.11.010

050011 河北省石家莊市第三醫(yī)院老年病科(陳曼麗、宮蕊),胸外科(陳孟輝),檢驗科(張翠召);河北醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院流行病與衛(wèi)生統(tǒng)計教研室(唐龍妹);河北醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)教研室(齊莉莉)

宮蕊，050011 河北省石家莊市第三醫(yī)院老年病科；

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R 541.4

A

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2017-01-06)