張艷紅 段春芳 謝憑

·論著·

循環(huán)腫瘤細(xì)胞對(duì)結(jié)直腸癌預(yù)后的相關(guān)性研究

張艷紅 段春芳 謝憑

目的 研究分析肥大細(xì)胞三種亞型對(duì)結(jié)直腸癌預(yù)后可能產(chǎn)生的影響，從而發(fā)現(xiàn)肥大細(xì)胞對(duì)結(jié)直腸癌預(yù)后的影響因素，為臨床指導(dǎo)治療提供理論依據(jù)。方法 選擇2011年資料完整的結(jié)直腸癌根治術(shù)后石蠟標(biāo)本40例作為試驗(yàn)組，術(shù)前未放療或化療；另取20例正常大腸組織，作為對(duì)照組，采用雙重免疫組化技術(shù)對(duì)試驗(yàn)組做連續(xù)切片進(jìn)行染色，觀察2組中各亞型構(gòu)成比是否有差異。計(jì)算出40例結(jié)直腸癌患者切片中各亞型的總平均計(jì)數(shù)值，與試驗(yàn)組每張切片相對(duì)應(yīng)的平均計(jì)數(shù)值進(jìn)行比較，觀察肥大細(xì)胞各亞型的數(shù)量與性別、癌的分化程度、癌的浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及生存時(shí)間的關(guān)系，并總結(jié)肥大細(xì)胞三種亞型與結(jié)直腸癌之間的關(guān)系。結(jié)果 TIM在結(jié)直腸癌根治術(shù)后石蠟標(biāo)本有不同程度的浸潤(rùn)，2組的在結(jié)直腸癌的N分期和TNM分期及腫瘤分化程度方面差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。高計(jì)數(shù)組和低計(jì)數(shù)組5年總生存率和無瘤生存率分別為63.1%、59.3%和82.9%、79.0%，2組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。COX比例風(fēng)險(xiǎn)模型單因素分析結(jié)果顯示，在腫瘤組織中，肥大細(xì)的浸潤(rùn)是對(duì)結(jié)直腸癌患者總生存時(shí)間和無瘤生存時(shí)間造成影響的不良因素，后續(xù)多因素分析得出，對(duì)結(jié)直腸癌患者總生存時(shí)間、無瘤生存時(shí)間而言，浸潤(rùn)肥大細(xì)胞為其獨(dú)立影響因素(P<0.05)。結(jié)論 TIM與結(jié)直腸癌的N分期和TNM分期相關(guān)，循環(huán)腫瘤細(xì)胞可影響結(jié)直腸癌患者預(yù)后，所以可借助對(duì)循環(huán)腫瘤細(xì)胞的檢測(cè)，去對(duì)結(jié)直腸癌患者的生存預(yù)后進(jìn)行預(yù)測(cè)，提高患者的預(yù)后及生存率。

循環(huán)腫瘤細(xì)胞；結(jié)直腸癌；預(yù)后；相關(guān)性

作為最常見的實(shí)體惡性腫瘤，結(jié)直腸癌有著較高的發(fā)病率和致死率，在惡性腫瘤中，其發(fā)病率占據(jù)第3位[1,2]，病死率居第5位，在腫瘤間質(zhì)中，肥大細(xì)胞無疑是重要的組成部分，包括MCt和MCtc兩種亞型，其能通過c-kit發(fā)揮效能，以往已有研究證實(shí)肥大細(xì)胞與腫瘤性疾病的病理過程密切相關(guān)，腫瘤部位能夠清晰觀察到肥大細(xì)胞侵潤(rùn)，因此很多研究認(rèn)為肥大細(xì)胞具有作為腫瘤治療靶點(diǎn)的潛在價(jià)值[3]，但是否與腫瘤患者的預(yù)后有關(guān)系尚不明確，也鮮見此方面的研究，因此，本研究選擇結(jié)直腸癌根治術(shù)后石蠟標(biāo)本和正常大腸組織進(jìn)行了研究分析，報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇廣州市番禺區(qū)南村醫(yī)院2011年資料完整的結(jié)直腸癌根治術(shù)后石蠟標(biāo)本40例為試驗(yàn)組，其中男27例，女13歲；年齡36～68歲；術(shù)前未放療或化療，術(shù)后隨訪時(shí)間在5年以上；另取40例正常大腸組織為對(duì)照組，其中男21例，女19例；年齡34～69歲，平均年齡(58±14)歲。對(duì)每個(gè)組織蠟塊切片，分別做甲苯胺藍(lán)和阿爾新藍(lán)-藏紅O染色兩種特殊染色，在光鏡下觀察切片的肥大細(xì)胞，在40×10倍鏡下，對(duì)每張切片取染色陽(yáng)性密度最高的5個(gè)蠟塊，該方案經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)討論通過。

1.2 方法 此次研究中，對(duì)石蠟標(biāo)本進(jìn)行常規(guī)脫蠟，切片厚度4 μm，脫蠟、水化，PBS溶液漂洗3次，每次漂洗3 min，將切片微波礦院修復(fù)10 min，繼續(xù)采用PBS溶液漂洗3次，3 min/次，在37%下內(nèi)源性過氧化物酶活性用0.3%H2O2封閉孵育20 min，甩去多與溶液，于枸櫞酸鈉修復(fù)液中微波修復(fù)后，將鼠抗人單抗Tryptase抗體(購(gòu)自美國(guó)NeoMarkers公司，1∶4 000)滴加入其中，4℃孵育12 h，PBS溶液漂洗3次。并在洗脫的基礎(chǔ)上進(jìn)行兔的多克隆第二抗/辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗鼠滴加，37℃孵育30 min，PBS溶液漂洗3次，滴加3,3/-二氨基聯(lián)苯胺顯色1 min。待其DAB顯色，則應(yīng)當(dāng)進(jìn)行蘇木素復(fù)染5 min，鹽酸乙醇分化，常規(guī)脫水、透明封片，鏡下觀察。類蛋白酶采用SP法染色，脫蠟水化，PBS溶液漂洗3次，微波抗原修復(fù)，繼續(xù)漂洗，微波抗原修復(fù)，PBS溶液反復(fù)漂洗3次，滴加過氧化氫溶液，蒸餾水清晰，滴加正常贍養(yǎng)血清封閉液，孵育，清除掉多與液體，加入trytase抗體(Novocastra公司生產(chǎn))，25℃下孵育1 h，采用PBA溶液漂洗3次后，滴加二抗孵育，繼續(xù)采用PBSA溶液漂洗，加入3,3/-二氨基聯(lián)苯胺顯色(北京中山生物科技有限公司生產(chǎn))，待其DAB顯色，則應(yīng)當(dāng)進(jìn)行蘇木素復(fù)染5 min，鹽酸乙醇分化，常規(guī)脫水、透明封片，鏡下觀察。

1.3 觀察指標(biāo) (1)肥大細(xì)胞：陽(yáng)性染色區(qū)域在200倍光鏡下觀察，對(duì)每張切片取染色陽(yáng)性密度最高的5個(gè)蠟塊，將其高倍視野陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量的平均值作為TIM密度。類胰蛋白酶陽(yáng)性肥大細(xì)胞為肥大細(xì)胞總數(shù)，促胰蛋白酶一樣數(shù)目為肥大細(xì)胞亞型MCtr亞型數(shù)目。(2)計(jì)算結(jié)直腸癌患者切片中各亞型的總平均計(jì)數(shù)值(總平均計(jì)數(shù)值=結(jié)直腸癌患者切片中各亞型肥大細(xì)胞的總計(jì)數(shù)/結(jié)直腸癌患者切片中肥大細(xì)胞的總計(jì)數(shù))；與試驗(yàn)組每張切片相對(duì)應(yīng)的平均計(jì)數(shù)值進(jìn)行比較，大于總平均計(jì)數(shù)的設(shè)為高計(jì)數(shù)組，小于或等于總平均計(jì)數(shù)的設(shè)為低計(jì)數(shù)組。(3)大腸癌組織學(xué)分類依照1986年全國(guó)大腸癌協(xié)作組分類標(biāo)準(zhǔn)，乳頭狀腺癌及管狀癌Ⅰ級(jí)為高分化癌，管狀腺癌Ⅱ及和粘液腺癌為中分化癌，未分化癌、印戒細(xì)胞癌以及管狀腺癌Ⅲ級(jí)為低分化癌。癌浸潤(rùn)深度依照1988年美國(guó)聯(lián)合也會(huì)制定大腸癌TNM分期標(biāo)準(zhǔn)。(4)觀察肥大細(xì)胞各亞型的數(shù)量與性別、癌的分化程度、癌的浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及生存時(shí)間的關(guān)系。對(duì)試驗(yàn)組病例進(jìn)行隨訪，包括術(shù)后治療康復(fù)、復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移、生存期等。

2 結(jié)果

2.1 肥大細(xì)胞免疫組織化學(xué)染色結(jié)果 肥大細(xì)胞漿液中均能夠觀察到胃促胰酶和類胰蛋白酶，二者染色均呈現(xiàn)棕黃色，大腸癌組織中肥大細(xì)胞亞型數(shù)目顯著高于正常組織細(xì)胞，大腸癌組織中肥大細(xì)胞構(gòu)成比與正常組織差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 大腸癌組織和正常組織中肥大細(xì)胞亞型分析 n=40

2.2 TIM與臨床病理因素的關(guān)系 2組體重指數(shù)、年齡、飲酒史、吸煙史、術(shù)前癥狀比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。多因素回歸分析顯示，無瘤生存時(shí)間影響因素包括TNM分期和肥大細(xì)胞浸潤(rùn)，影響生存之間因素包括TNM分期和肥大細(xì)胞浸潤(rùn)。TIM在結(jié)直腸癌根治術(shù)后石蠟標(biāo)本有不同程度的浸潤(rùn)，2組的在結(jié)直腸癌的N分期、TNM分期及腫瘤分化程度方面比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2、3。

2.3 肥大細(xì)胞表達(dá)與臨床病理關(guān)系 試驗(yàn)組MCtc平均計(jì)數(shù)(45.8±12.6)，Mct平均計(jì)數(shù)(13.4±3.9)，26例患者M(jìn)Ctc為高計(jì)數(shù)組，不同性別和額腫瘤組織學(xué)分化程度肥大細(xì)胞亞型表達(dá)差異不明顯(P>0.05)，肥大細(xì)胞高計(jì)數(shù)組腫瘤浸潤(rùn)程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移發(fā)生率顯著低于低計(jì)數(shù)組(P<0.05)，5年生存率顯著高于低計(jì)數(shù)組(P<0.05)，有結(jié)巴結(jié)轉(zhuǎn)移24例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移16例。見表4。

表2 TIM與臨床病理因素比較 n=40，例(%)

表3 結(jié)直腸癌患者總生存時(shí)間、無瘤生存時(shí)間的多因素分析

3 討論

作為當(dāng)前最常見的胃腸道惡性腫瘤，結(jié)直腸癌對(duì)患者的生活質(zhì)量會(huì)造成極大影響，主要依據(jù)UICC/AJCC制訂的TNM分期來進(jìn)行治療和預(yù)后[4]，以病理解剖因素為主導(dǎo)，尚未納入腫瘤發(fā)生發(fā)展環(huán)節(jié)的生物學(xué)因素，不斷地運(yùn)用過程中，其各種弊端也逐漸暴露。

結(jié)直腸癌是一種異質(zhì)性腫瘤，很多學(xué)者已經(jīng)認(rèn)可了結(jié)直腸癌預(yù)后和腫瘤炎癥免疫微環(huán)境的關(guān)系[5,6]，而作為腫瘤間質(zhì)的重要組成部分，肥大細(xì)胞于腫瘤發(fā)生發(fā)展環(huán)節(jié)作用易被忽視，在結(jié)直腸癌的預(yù)后價(jià)值方面仍存爭(zhēng)議。肥大細(xì)胞在機(jī)體各個(gè)器官中均有存在，在肺細(xì)胞以及小腸黏膜層均由M Cr亞型表達(dá)[7,8]，皮膚和小腸黏膜MCtc占據(jù)主導(dǎo)優(yōu)勢(shì)，以往研究發(fā)現(xiàn)，類胰蛋白酶具有促進(jìn)新生血管形成作用，能夠間接促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖，在體外研究中也發(fā)現(xiàn)，胃促胰梅能夠誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞的聚集，具有抗腫瘤效果[9]，國(guó)內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)肥大細(xì)胞與肺腺癌預(yù)后密切相關(guān)。有研究認(rèn)為TIM與結(jié)直腸癌患者的預(yù)后呈正相關(guān)[10,11]，也有人認(rèn)為組織內(nèi)肥大細(xì)胞的浸潤(rùn)數(shù)量越多[12]，將會(huì)降低患者的生存幾率，其預(yù)后也會(huì)越差。

本次研究中，采用雙重免疫組化技術(shù)對(duì)試驗(yàn)組做連續(xù)切片進(jìn)行染色等，總結(jié)肥大細(xì)胞三種亞型與結(jié)直腸癌之間的關(guān)系。研究結(jié)果顯示，肥大細(xì)胞漿液中均能夠觀察到胃促胰酶和類胰蛋白酶，二者染色均呈現(xiàn)棕黃色，大腸癌組織中肥大細(xì)胞亞型數(shù)目顯著高于正常組織細(xì)胞，大腸癌組織中肥大細(xì)胞構(gòu)成比與正常組織無明顯差異(P>0.05)，提示癌變過程中，大腸癌組織中肥大細(xì)胞表達(dá)并不存在顯著變化，但是肥大細(xì)胞總數(shù)增加。從后續(xù)的研究分析看來，TIM在結(jié)直腸癌根治術(shù)后石蠟標(biāo)本有不同程度的浸潤(rùn)，2組的在結(jié)直腸癌的N分期和TNM分期方面對(duì)比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，對(duì)試驗(yàn)組隨訪至2015年8月。試驗(yàn)組MCtc平均計(jì)數(shù)(45.8±12.6)，Mcr平均計(jì)數(shù)(13.4±3.9)，18例患者M(jìn)Ctc為高計(jì)數(shù)組，19例患者M(jìn)Ct為高計(jì)數(shù)組，不同性別和額腫瘤組織學(xué)分化程度肥大細(xì)胞亞型表達(dá)差異不明顯(P>0.05)，肥大細(xì)胞高計(jì)數(shù)組腫瘤浸潤(rùn)程度以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移發(fā)生率顯著低于低計(jì)數(shù)組(P<0.05)。高計(jì)數(shù)組和低計(jì)數(shù)組5年總生存率顯著高于低計(jì)數(shù)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。推測(cè)肥大細(xì)胞能夠抑制干細(xì)胞e-myc基因拜倒發(fā)揮抗腫瘤作用[13]，同時(shí)肥大細(xì)胞能夠增強(qiáng)嗜酸性顆粒細(xì)胞的活性，促進(jìn)胃促胰酶細(xì)胞聚集，發(fā)揮抗腫瘤細(xì)胞作用，因此高計(jì)數(shù)組患者生存率提高。在其他研究中發(fā)現(xiàn)，肥大細(xì)胞具有促進(jìn)新生血管增殖作用，能夠加快腫瘤細(xì)胞的發(fā)展[14]，但是在本組研究中可以看出惡化程度高的大腸癌患者肥大細(xì)胞亞型表達(dá)與惡化程度低的患者差異并不明顯，關(guān)于肥大細(xì)胞抑制腫瘤細(xì)胞作用還需要進(jìn)一步分析。COX比例風(fēng)險(xiǎn)模型單因素分析結(jié)果顯示，在腫瘤組織中，肥大細(xì)的浸潤(rùn)是對(duì)結(jié)直腸癌患者總生存時(shí)間和無瘤生存時(shí)間造成影響的不良因素，后續(xù)多因素分析得出，對(duì)結(jié)直腸癌患者總生存時(shí)間、無瘤生存時(shí)間而言，浸潤(rùn)肥大細(xì)胞為其獨(dú)立影響因素(P<0.05)。

表4 肥大細(xì)胞表達(dá)與臨床病理關(guān)系分析 例

綜上所述，經(jīng)研究得出，論TIM與結(jié)直腸癌的N分期和TNM分期相關(guān)，其浸潤(rùn)密度與患者預(yù)后呈負(fù)相關(guān)，循環(huán)腫瘤細(xì)胞可影響結(jié)直腸癌患者預(yù)后，所以可借助對(duì)循環(huán)腫瘤細(xì)胞的檢測(cè)，去對(duì)結(jié)直腸癌患者的生存預(yù)后進(jìn)行預(yù)測(cè)，提高患者的預(yù)后及生存率，為個(gè)體化治療提供依據(jù)。

1 王瑞玲,李雪,孫鵬,等.結(jié)直腸癌循環(huán)腫瘤細(xì)胞的研究進(jìn)展.中華臨床醫(yī)師雜志：電子版,2014,42:85-89.

2 魏曉軍,白雪,聶玉輝,等.T7 RNA聚合酶催化的熒光擴(kuò)增技術(shù)檢測(cè)結(jié)直腸癌循環(huán)腫瘤細(xì)胞hTERT與臨床病理的關(guān)系.臨床軍醫(yī)雜志,2012,40:846-848.

3 王大巍,孫立輝,金長(zhǎng)凱,等.循環(huán)腫瘤細(xì)胞與結(jié)直腸癌預(yù)后關(guān)系.中國(guó)公共衛(wèi)生,2014,30:1617-1618.

4 王大巍,孫立輝,金長(zhǎng)凱,等.外周血腫瘤細(xì)胞CK20表達(dá)與結(jié)直腸癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的關(guān)系.中國(guó)老年學(xué)雜志,2014,38:4741-4743.

5 吳志清.循環(huán)腫瘤細(xì)胞與結(jié)直腸癌的相關(guān)性研究進(jìn)展.西南軍醫(yī),2015，22:298-301.

6 劉平,魏子白.結(jié)直腸癌循環(huán)腫瘤細(xì)胞臨床應(yīng)用進(jìn)展.現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué),2013,21:1393-1395.

7 陳媛媛,程勃然,王振盟,等.循環(huán)腫瘤細(xì)胞的檢測(cè)在結(jié)直腸癌中的應(yīng)用.中華臨床醫(yī)師雜志：電子版,2014，18:128-132.

8 吳康,鄧安梅,顏宏利.結(jié)直腸癌循環(huán)腫瘤細(xì)胞及DNA的研究進(jìn)展.中國(guó)腫瘤生物治療雜志,2015,22：55-56.

9 Tsouma A，Aggeli C，Lembessis P，et al． Multiplex RT-PCR-based detections of CEA，CK20 and EGFR in colorectal cancer patients.World J Gastroenterol，2010，16:5965-5974．

10 張宏,馬楠,張方圓,等.結(jié)直腸癌組織δ-catenin表達(dá)與臨床病理因素及預(yù)后相關(guān)性分析.中華腫瘤防治雜志,2014,21:1429-1434.

11 馬清,陳水平,陳建魁.肝癌患者循環(huán)腫瘤細(xì)胞的檢測(cè)及其臨床應(yīng)用研究進(jìn)展.標(biāo)記免疫分析與臨床, 2014,21:599-602.

12 劉彥魁,王曉莉,金琳芳,等.外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞在評(píng)估結(jié)直腸癌患者KRAS基因突變中的價(jià)值.國(guó)際腫瘤學(xué)雜志,2015,42：88-89.

13 關(guān)雅萍,榮學(xué)東,張先欣,等.腫瘤循環(huán)細(xì)胞在消化系統(tǒng)腫瘤中的研究進(jìn)展.中華消化病與影像雜志：電子版,2015，33:35-39.

14 蔡澤榮, 柯嘉, 吳小劍. 循環(huán)腫瘤細(xì)胞在結(jié)直腸癌的研究進(jìn)展.結(jié)直腸肛門外科,2012，18:206-209.

Correlation of circulating tumor cells and the prognosis of patients with colorectal cancer

ZHANGYanhong*,DUANChunfang,XIEPing*.

*NancunHospitalofPanyuDistrict,Guangzhou511442,China

Objective To investigate the effects of three subtypes of mast cells (TIM) on the prognosis of patients with colorectal carcinoma in order to find the influencing factors of mast cells on the prognosis of colorectal cancer,so as to provide theoretical basis for guiding clinical treatment of rectal cancer.Methods The 40 specimens of radical resection of colorectal cancer with complete clinical data in 2011 were selected as experimental group,without preoperative radiotherapy or chemotherapy,and the other 20 cases of normal colorectal tissues were served as control group.The differences of subtypes were observed by using double immunohistochemical technique continuous slices staining. The correlation between the numbers of different subtypes of mast cells and patient’s sex, differentiation degree of cancer, invasion depth, lymph node metastasis,patient’s survival time was analyzed,moreover, the correlation between the three subtypes of mast cell and colorectal cancer was investigated. Results The TIM had different degree infiltration in paraffin-embeded specimens after radical resection of colorectal cancer,there were significant differences in N staging and TNM staging of colorectal cancer between two groups (P<0.05). The 5-year total survival rates and tumor-free survival rate in high counting group and low counting group were 63.1%, 59.3% and 82.9%, 79%,respectively,there were significant differences between two groups (P<0.05).The single factor analysis of COX proportional hazards model showed that in tumor tissue, infiltration of mast cells was adverse factors influencing overall survival time and tumor-free survival time of patients with colorectal cancer.Moreover multiple factor analysis showed mast cells infiltration was independent influencing factors on overall survival time and tumor-free survival time of patients with colorectal cancer (P<0.05).Conclusion TIM is closely correlated to N staging and TNM staging of colorectal cancer,and circulating tumor cells can influence the prognosis of patients with colorectal cancer, therefor, the detection of circulating tumor cells can be used to predict the survival prognosis of patients with colorectal cancer to improve patient’s prognosis and survival rate.

circulating tumor cells; colorectal cancer; prognosis; correlation

10.3969/j.issn.1002-7386.2017.11.009

項(xiàng)目來源：廣州市番禺區(qū)科技與信息化高科技攻關(guān)項(xiàng)目(編號(hào)：2014-203-27)

511442 廣東省廣州市番禺區(qū)南村醫(yī)院(張艷紅、謝憑)； 廣東省廣州市番禺新造醫(yī)院(段春芳)

R 735.3

A

1002-7386(2017)11-1634-04

2016-11-20)