李晨蔚 李凱敏 王子善 郭晶 劉雅輝

LUNX與VEGFA基因聯(lián)合檢測對Ⅰ期非小細胞肺癌淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移的臨床意義

李晨蔚 李凱敏 王子善 郭晶 劉雅輝

目的 探討人類肺組織特異性X蛋白（LUNX）與血管內(nèi)皮生長因子A（VEGFA）基因聯(lián)合檢測對I期非小細胞肺癌（NSCLC）淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移的臨床意義。方法 選擇入院手術(shù)的39例I期NSCLC患者（淋巴結(jié)78枚）為實驗組，同期入院的10例肺良性腫瘤患者（淋巴結(jié)19枚）為對照組，采用RT-PCR檢測兩組患者淋巴結(jié)LUNX、VEGFAm RNA表達，并分析其表達與NSCLC患者臨床特征的相關(guān)性。結(jié)果 實驗組淋巴結(jié)LUNX、VEGFA mRNA陽性表達率為23.08%、19.23%，分別高于對照組的5.26%、0.00%（均P＜0.05）。與常規(guī)病理檢測比較，RT-PCR檢測LUNX、VEGFAm RNA表達診斷NSCLC淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移陽性率均較高（均P＜0.05）。I期NSCLC患者淋巴結(jié)LUNX、VEGFAm RNA表達水平與肺癌病理類型、細胞分化程度、TNM分期均呈正相關(guān)（r=0.661、0.552和0.527，均P＜0.05），與患者性別、年齡、吸煙史等未見相關(guān)（r=0.212、0.236和0.183，均P＞0.05）。結(jié)論 LUNX、VEGF基因聯(lián)合檢測可輔助常規(guī)病理檢測判斷I期NSCLC淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移，為臨床診治提供一定的幫助。

非小細胞肺癌 微轉(zhuǎn)移 肺組織特異性X蛋白 血管內(nèi)皮生長因子A 反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈式反應(yīng)

近年來，肺癌的發(fā)病率、病死率呈逐年上升趨勢[1]。肺癌預(yù)后與腫瘤的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移有著密切的關(guān)系，臨床上接受根治手術(shù)的Ⅰ期非小細胞肺癌（NSCLC）的復(fù)發(fā)率為25%～50%[2-3]，5年生存率為57%～85%[2-4]；NSCLC術(shù)后復(fù)發(fā)可能與常規(guī)病理檢查較難發(fā)現(xiàn)淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移有關(guān)。故筆者聯(lián)合檢測NSCLC患者淋巴結(jié)中人類肺組織特異性X蛋白（LUNX）與血管內(nèi)皮生長因子A（VEGFA）基因的表達，以探討其診斷Ⅰ期NSCLC淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移的臨床價值。

1 對象和方法

1.1 對象 選取2015年1月至2016年1月在本院胸外科接受根治性手術(shù)治療的39例Ⅰ期NSCLC患者（淋巴結(jié)78枚）為實驗組，其中男16例，女23例；年齡40～ 78（65.5±6.21）歲；病理類型：腺癌26例，鱗癌13例；分化程度：高-中分化28例，低分化11例；TNM分期（國際抗癌聯(lián)盟2009年修訂版）：Ⅰa期16例，Ⅰb期23例。術(shù)中取每例患者的腫瘤組織、手術(shù)切除的肺葉中距離腫塊最遠端的肺組織各一小塊（置于凍存管中液氮保存），肺門及隆突下淋巴結(jié)各1枚（平均切成2份，其中l(wèi)份置于凍存管中液氮保存，1份送病理檢查），共收集腫瘤組織39份、肺組織39份、淋巴結(jié)組織78份；選擇同期入院的10例肺良性腫瘤患者（每例患者取2枚淋巴結(jié)，其中1例因操作困難僅取1枚，共收集淋巴結(jié)組織19份）作為對照組。所有標本在收集過程中均避免細菌和腫瘤細胞污染。

1.2 方法

1.2.1 化學(xué)試劑 Trizol試劑盒和瓊脂糖、反逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和PCR試劑盒均為美國Invitrogen生產(chǎn)；DEPC、dNTP為上海捷蘭公司生產(chǎn)。

1.2.2 引物的設(shè)計與合成 序列參照Gene Bank數(shù)據(jù)庫中各目的基因的序列，引物由ABI公司的Primer Express Software v2.0設(shè)計，由華大基因公司合成。引物序列如下，LUNX正鏈：5′-TCGGCATAAAGCTCCAAGTG-3′，LUNX反鏈5′-GAAATTTGCAGGCTTCCAGG-3′；VEGFA正鏈：5′-GGCCTCCGAAACCATGAACT-3′，VEGFA反鏈5′-TCGTGATGATTCTGCCCTCC-3′；GAPDH正鏈：5′-AQCCACATCQCTCAGACAC-3′，GAPDH反鏈：5′-GCCCAATACQACCAAATTCC-3′。

1.2.3 總RNA的抽提與檢測 取實驗組的腫瘤組織、肺組織、淋巴結(jié)組織，以及對照組的淋巴結(jié)組織，使用TRIzol試劑分離純化；取1μl總RNA測OD260，電泳觀察28s、18s亮帶，以鑒定RNA提取質(zhì)量；使用紫外線分光光度計對RNA進行定量分析。

1.2.4 RT-PCR 按照Invitrogen反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進行cDNA第l鏈合成；以第l鏈反應(yīng)合成物為模板，通過PCR技術(shù)和基因特異性引物檢測LUNX、VEGFA mRNA表達；分別擴增同一樣本的目的基因和看家基因，并以 2-△△Ct分析 PCR產(chǎn)物的濃度比值來反映LUNX、VEGFAmRNA表達水平。當淋巴結(jié)組織LUNX、VEGFA mRNA表達水平高于或等于腫瘤組織表達水平的中位數(shù)則認為淋巴結(jié)LUNX、VEGFA mRNA陽性；低于腫瘤組織LUNX、VEGFA mRNA表達水平的中位數(shù)則認為陰性。淋巴結(jié)LUNX、VEGFA mRNA陽性表達率=陽性淋巴結(jié)數(shù)目/被檢測淋巴結(jié)數(shù)目×100.00%。

1.2.5 常規(guī)病理檢測 標本經(jīng)固定后，常規(guī)石蠟包埋，4μm切片；常規(guī)用二甲苯脫蠟，經(jīng)各級乙醇脫水，蘇木素染色5min，鹽酸乙醇分化30s（提插數(shù)下），溫水浸泡15min，置伊紅液2min；然后常規(guī)脫水，透明，封片鏡檢。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件。計數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗；采用Pearson相關(guān)分析淋巴結(jié)LUNX、VEGFA mRNA陽性表達率與臨床資料的相關(guān)性。

2 結(jié)果

2.1 預(yù)實驗結(jié)果 隨機抽取1個樣品進行預(yù)實驗，RNA電泳圖中，RNA的28s、18s亮帶清楚可見，說明RNA質(zhì)量合格，見圖1。擴增曲線正常、平滑，指數(shù)增長期、對數(shù)增長期、平臺期明顯，說明基線設(shè)置合理，見圖2a（插頁）。熔解曲線只有單峰，說明無非特異性擴增，見圖2b（插頁）。

圖1 預(yù)實驗電泳圖

2.2 兩組患者淋巴結(jié)LUNX、VEGFA mRNA陽性表達率比較 實驗組淋巴結(jié)LUNX、VEGFA mRNA陽性表達率為23.08%（18/78）、19.23%（15/78），分別高于對照組的5.26%（1/19）、0.00%，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2＝3.96、3.82，均P＜0.05）。

2.3 RT-PCR與常規(guī)病理檢測NSCLC淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移陽性率比較 LUNX、VEGFA mRNA檢測NSCLC淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移陽性率為23.08%（18/78）、19.23%（15/78），均高于常規(guī)病理檢測的8.97%（7/78），差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=5.76、3.39，均P＜0.05）。

2.4 NSCLC患者淋巴結(jié)LUNX、VEGFA mRNA陽性表達率與臨床特征的相關(guān)性 腺癌、低分化、Ⅰb期患者淋巴結(jié)LUNX、VEGFA mRNA陽性表達率均分別高于鱗癌、高-中分化、Ⅰa期患者（均P＜0.05），見表1。進一步作Pearson相關(guān)分析，發(fā)現(xiàn)淋巴結(jié)LUNX、VEGFA mRNA表達水平與肺癌病理類型、細胞分化程度、TNM分期均呈正相關(guān)（r=0.661、0.552和0.527，均P＜0.05），但與患者性別、年齡、吸煙史等未見相關(guān)（r=0.212、0.236和0.183，均P＞0.05）。

表1 不同臨床特征NSCLC患者淋巴結(jié)LUNX、VEGFAmRNA陽性表達率比較[例（%）]

3 討論

早期NSCLC患者術(shù)后復(fù)發(fā)率、病死率仍較高[1-2]，國外學(xué)者認為與淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移有關(guān)[4]。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，利用RT-PCR技術(shù)檢測組織中腫瘤特異性mRNA，可在1×106～1×107個細胞中檢出1個癌細胞，使得及時發(fā)現(xiàn)外周血或淋巴結(jié)中微癌轉(zhuǎn)移成為可能[5]。檢測腫瘤標志物是發(fā)現(xiàn)微轉(zhuǎn)移的主要方法，LUNX是人類肺組織特異性基因[6]，不在間葉組織和正常淋巴結(jié)中表達；若在肺癌患者的淋巴結(jié)或血液中檢測到LUNX mRNA表達，提示可能存在癌細胞的轉(zhuǎn)移；因此，LUNX是一個兼顧特異度和靈敏度的分子標志物[7]。實體瘤的發(fā)生、浸潤與轉(zhuǎn)移均依賴于新生血管的生成，腫瘤組織1～2mm3須啟動血管生成才能維持不斷惡性增殖的腫瘤特性[8]；而腫瘤血管生成的開關(guān)由腫瘤細胞或基質(zhì)細胞分泌的血管生成因子所誘導(dǎo)，其中VEGFA是目前公認的最強、最特異的促血管生成因子[9-10]。實驗組中VEGFA mRNA表達陽性的15枚淋巴結(jié)均有LUNX mRNA表達，本文利用RT-PCR同時檢測NSCLC患者LUNX、VEGFAmRNA表達，可提高發(fā)現(xiàn)微轉(zhuǎn)移灶的靈敏度和準確率，有助于術(shù)后準確分期和個體化治療方案的制定。

本研究對同一淋巴結(jié)進行RT-PCR與常規(guī)病理檢測，發(fā)現(xiàn)RT-PCR檢測淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移陽性率明顯高于常規(guī)病理檢測，表明RT-PCR檢測NSCLC患者縱隔淋巴結(jié)中特異基因的表達來輔助診斷肺癌微轉(zhuǎn)移具有更高的靈敏度。RT-PCR技術(shù)操作流程復(fù)雜，在檢測過程中可能存在技術(shù)偏倚，故本研究對照組淋巴結(jié)中出現(xiàn)了1例LUNX mRNA陽性表達，存在靈敏度過高的問題。因此，RT-PCR作為一種輔助診斷方法，關(guān)于肺癌微轉(zhuǎn)移的靈敏度和特異度的問題有待更大樣本的實驗研究。總的來說，RT-PCR檢測NSCLC患者LUNX、VEGFAmRNA表達，能發(fā)現(xiàn)部分常規(guī)病理檢測陰性者的淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移，可作為常規(guī)病理檢測的輔助判斷。

此外，本研究發(fā)現(xiàn)LUNX、VEGFA mRNA表達與NSCLC患者的臨床資料相關(guān)，其中腺癌、低分化、Ⅰb期患者的LUNX、VEGFA mRNA陽性表達率分別高于鱗癌、高-中分化、Ⅰa期患者，提示聯(lián)合檢測LUNX、VEGFA mRNA表達對患者病理類型的判斷有一定幫助，可為臨床診治提供相關(guān)依據(jù)。

[1]Wang L J,Yu C H,Liu Y.et al.Lung cancerm ortality trends in China from 1988 to 2013:new challenges and opportunities for the governm ent[J].Int JEnviron Res Pub lic Health,2016,13(11): 1052.

[2]Grace K Dy,Lourdes Ylagan,SaraswatiPokharel,et al.The p rognostic significance of focaladhesion kinase exp ression in stage Inon smallcell lung cancer[J].JThorac Onco l,2014,9(9):1278-1284.

[3]Joachim Pfannschm id t,Gerlinde Egerer,Thomas M,eta l.Surgical intervention forpulm onary m etastases[J].Dtsch Arzteb l Int, 2012,109(40):645-651.

[4]Kaoru Kaseda,Keisuke Asakura,Akio Kazama,etal.Risk factors for p redicting occult lymph node metastasis in patientsw ith c linicalstage Inon smallcell lung cancer staged by integrated fluorodeoxyg lucose positron em ission tomography/computed tomography[J].World JSurg,2016,40(12):2976-2983.

[5]Datta YH,Adams P T,DrobyskiW R,etal.Sensitive detec tion of occult breast cancer by the reverse-transcrip tase polymerase chain reaction[J].JClin Oncol,1994,12(3):475-482.

[6]Iwao K,Watanabe T,Fujiwara Y,etal.Isolation ofa novelhuman lung-specific gene,LUNX,a potentialmolecularmarker for detection ofm icrometastasis in non-small-cell lung cancer[J].Int J Cancer,2001,91(4):433-437.

[7]Anastasia Katseli,Haralam pos Maragos,Ad rianos Nezos,et al. Multip lex PCR-based detection of circulating tumor cells in lung cancer patients using CK19,PTHrP,and LUNX specific p rim ers[J].Clin Lung Cancer,2013,14(5):513-520.

[8]Sand ra Ryeom,Judah Folkman.Role of endogenous angiogenesis inhibitors in Down synd rom e[J].J Cranio fac Surg,2009,20 (Supp l1):595-596.

[9]Devika Kir,Manju Saluja,Shrey Mod i,et al.Venkatachalam A[J]. Oncotarget,2016,7(40):65348-65363.

[10]Tomokazu Fujimoto,Toshihiro Inoue,KeiMaki,et al.Vascular endothelialg row th factor-A increases the aqueous humor outflow facility[J].PLoSOne,2016,11(9):e0161332.

Expression of LUNX and VEGFA mRNA in lymph nodes of patients w ith stage I non-small-cell lung cancer and its clinical significance

LI Chenw ei,LI Kaimin,WANG Zishan,et al.Department of Thoracic Surgery,Ningbo First Hospital，Ningbo 315010,

China

Objective To evaluate the exp ression of LUNX and VEGFA gene in lym ph nodes of patients w ith stage I non-small cell lung cancer(NSCLC)and its c linicalsignificance.Methods The exp ression of LUNX gene and VEGFA gene in tumor tissue and lym ph nodes was detected by RT-PCR in 39 stage INSCLC patients(cancer g roup)and 10 lung benign tumor patients(benign g roup).The association of LUNX and VEGFA exp ression w ith age,sex,smoking history and c linicopathological features of NSCLC patients was analyzed.Results The positive exp ression rates of LUNXmRNA and VEGFA mRNA in cancer g roup were 23.08%and 19.23%,which were significantly higher than those of benign group(5.26%and 0.00%,P＜0.05).The exp ression rates of LUNXm RNA and VEGFA m RNA in lym ph nodes were significantly higher than metastasis rate detected by routine pathologicalexam ination(both P＜0.05)．The exp ression of LUNXm RNA and VEGFAm RNA in lymph nodes was c losely correlated w ith pathological type,cancer cell differentiation and c linic stage(r=0.661,0.552,0.527,all P＜0.05),while not correlated with age，sex and smoking history(r=0.212,0.236,0.183,all P＞0.05).Conclusion The exp ression of LUNXmRNA and VEGFAmRNA in the lymph nodesmay be an ind icator ofm icrometastases in patients w ith stage INSCLC.

LUNX Mic rometastase LUNX VEGFA RT-PCR

2016-09-14）

（本文編輯：陳丹）

10.12056/j.issn.1006-2785.2017.39.6.2016-1437

寧波市醫(yī)學(xué)科技計劃項目(2014A04)

315010寧波市第一醫(yī)院胸外科（李晨蔚、李凱敏、王子善、郭晶），分子醫(yī)學(xué)實驗室（劉雅輝）

李晨蔚，E-mail：nblcw2008@126.com