王超群 曾悅 王艷 黃必飛 孫鑫鑫 趙永明 王倩 胡桂女 蘇振銘

乳腺癌中膜型基質(zhì)金屬蛋白酶-1蛋白表達及其臨床病理意義

王超群 曾悅 王艷 黃必飛 孫鑫鑫 趙永明 王倩 胡桂女 蘇振銘

目的 探討膜型基質(zhì)金屬蛋白酶-1（MT1-MMP）蛋白表達在乳腺癌發(fā)生、發(fā)展中的臨床病理意義。方法 收集2011年1月至2014年12月404例女性乳腺組織石蠟標本分為5組，其中浸潤性乳腺癌組220例、導管原位癌（DCIS）Ⅲ組39例、DCISⅠ～Ⅱ組33例、普通型導管增生（UDH）組64例、正常乳腺組48例。采用免疫組化EnVision法檢測MT1-MMP蛋白的表達。 結(jié)果 （1）浸潤性乳腺癌、DCISⅢ、DCISⅠ～Ⅱ、UDH、正常乳腺組中MT1-MMP蛋白陽性率分別為67.73%（149/220）、25.64%（10/39）、6.06%（2/33）、4.69%（3/64）、18.75%（9/48）；浸潤性乳腺癌組陽性率顯著高于DCISⅢ、DCISⅠ～Ⅱ、UDH和正常乳腺組（均P＜0.01）；DCISⅢ組陽性率顯著高于DCISⅠ～Ⅱ和UDH組（均P＜0.05）。（2）MT1-MMP蛋白表達與腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期及孕激素受體（PR）相關(guān)（均P＜0.05）。logistic回歸模型多因素分析顯示浸潤性乳腺癌患者MT1-MMP蛋白表達的獨立相關(guān)因素包括腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（OR=0.213，95%CI=0.084～0.544，P＜0.01）和PR表達狀態(tài)（OR=1.927，95%CI=1.049～3.542，P＜0.05）。 結(jié)論 MT1-MMP蛋白表達自UDH和DCISⅠ～Ⅱ、DCISⅢ至浸潤性乳腺癌顯著升高，且其MT1-MMP蛋白表達與浸潤性乳腺癌患者多項預(yù)后不良因素相關(guān)，提示其在乳腺癌進展的全過程中均發(fā)揮了重要作用，有望成為抗乳腺癌治療的一個潛在生物學標志。

膜型基質(zhì)金屬蛋白酶-1 乳腺癌 免疫組化 導管原位癌 普通型導管增生

乳腺癌是我國女性常見的惡性腫瘤，且近年來發(fā)病率和病死率均呈上升趨勢[1]。腫瘤的侵襲性生長和轉(zhuǎn)移是導致患者死亡的主要原因。因此，尋找乳腺癌發(fā)生、發(fā)展相關(guān)的生物標記物，進行靶向干預(yù)，對預(yù)防腫瘤發(fā)生、提高患者生存質(zhì)量和生存率有著重要意義。膜型基質(zhì)金屬蛋白酶-1（MT1-MMP）是基質(zhì)金屬蛋白酶家族的一個重要成員，其編碼的蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量為66kDa，在多種腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮了重要的作用[2]。目前，關(guān)于浸潤性乳腺癌和導管原位癌（DCIS）中MT1-MMP蛋白表達差異情況尚存在爭議[3-6]，關(guān)于MT1-MMP蛋白在乳腺癌發(fā)生、發(fā)展的全過程中的主要作用少有相關(guān)報道。本研究檢測正常乳腺組織、普通型導管增生（UDH）、DCIS及浸潤性乳腺癌組織中MT1-MMP蛋白的表達，并分析其在乳腺癌發(fā)生、發(fā)展中的作用，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 對象和方法

1.1 對象 收集2011年1月至2014年12月東陽市人民醫(yī)院病理科女性乳腺組織石蠟標本404例，分為5組，其中浸潤性乳腺癌組220例、DCISⅢ組39例、DCISⅠ～Ⅱ組33例、UDH組64例、正常乳腺組48例。按WHO標準（2012年）進行分型和分級。浸潤性乳腺癌患者年齡28～77（52.26±11.48）歲；組織學分級：Ⅰ級18例，Ⅱ級145例，Ⅲ級57例；TNM分期：Ⅰ期76例，Ⅱ期93例，Ⅲ期51例，Ⅳ期0例。參照術(shù)后免疫組化結(jié)果將浸潤性乳腺癌分為4個分子亞型：Luminal A[雌激素受體（ER）+/孕激素受體（PR）+/表皮生長因子受體（HER）2-，Ki-67＜14%]86例；Luminal B（ER+/PR+/HER2-，Ki-67≥14%或 ER+/PR+/HER2+）54例；HER2過表達（ER-/PR-/HER2+）40例和三陰性（ER-/PR-/HER2-）29例。本研究中11例浸潤性乳腺癌患者因HER2免疫組化結(jié)果不明確且未行進一步熒光原位雜交（FISH）檢測，故未進行分子分型。DCISⅢ組患者年齡30～69（50.13±9.26）歲；DCISⅠ～Ⅱ組患者年齡35～71（51.89± 10.96）歲；UDH組患者年齡22～65（43.19±12.16）歲；正常乳腺組年齡32～66（48.24±8.56）歲。所有患者術(shù)前均未做化療、免疫及放射治療。

1.2 方法

1.2.1 免疫組化染色 所有組織均以10%甲醛溶液固定，石蠟包埋，4μm連續(xù)切片。免疫組化實驗采用En－Vision二步法：檸檬酸鹽緩沖液高壓熱修復(fù)，0.3%H2O2室溫孵育15min，以1∶100稀釋比例滴加兔抗人MT1-MMP多克隆抗體（克隆號：H-72，Santa Cruz公司）室溫孵育70min，之后用EnVision二步法試劑盒（Dako公司）室溫孵育45min，最后用DAB顯色劑（Dako公司）顯色5～8min，蘇木素復(fù)染、脫水、透明、封蠟。

1.2.2 免疫組化評分 MT1-MMP蛋白染色結(jié)果判定采用以下標準。染色強度計分：0（無染色），1（淡黃色），2（棕黃色），3（棕褐色）；染色范圍計分：0（無陽性細胞），1（1%～25%），2（26%～50%），3（51%～75%），4（76%～100%）。兩者相加得分0～7分，以≥3分且切片中≥5%細胞染色視為陽性。染色結(jié)果判讀由2位病理醫(yī)師獨立完成。2位病理醫(yī)師判讀結(jié)果不一致的病例，由第3位醫(yī)師參與判讀并得出最終結(jié)果。

1.3 浸潤性乳腺癌患者臨床病理特征 包括年齡、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、組織學分級、TNM分期、ER、PR、c-erbB-2、分子分型，用于后續(xù)分析這些特征與MT1-MMP蛋白表達之間的關(guān)系。

1.4 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件。計數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗；MT1-MMP蛋白表達與浸潤性乳腺癌患者臨床病理特征之間的多因素分析采用logistic回歸模型。

2 結(jié)果

2.1 MT1-MMP蛋白在乳腺組織中的表達及分布 見圖1。

圖1 MT1-MMP蛋白在不同乳腺組織中的免疫組化染色（EnVision二步法）情況（a：正常乳腺組織，腺上皮陰性表達，×200；b：UDH，增生上皮陰性表達，×200；c：DCISⅢ級，導管內(nèi)異型腫瘤上皮細胞陽性表達，×100；d：浸潤性導管癌，癌細胞胞質(zhì)陽性表達，× 200）

由圖1可見，MT1-MMP蛋白染色主要定位于乳腺腺上皮或腫瘤細胞胞質(zhì)，少數(shù)病例可見細胞膜著色。正常乳腺和腫瘤組織中間質(zhì)成分（成纖維細胞、內(nèi)皮細胞）均可見著色。

浸潤性乳腺癌組、DCISⅢ組、DCISⅠ～Ⅱ組、UDH組、正常乳腺組中MT1-MMP蛋白陽性率分別為67.73%（149/220）、25.64%（10/39）、6.06%（2/33）、4.69%（3/64）、18.75%（9/48）。其中，浸潤性乳腺癌組MT1-MMP蛋白陽性率高于DCISⅢ組、DCISⅠ～Ⅱ組、UDH組和正常乳腺組（χ2=111.843，均P＜0.01）。DCISⅢ組MT1-MMP高于DCISⅠ～Ⅱ組和UDH組及正常乳腺組，且與前兩者比較，差異有統(tǒng)計學意義（χ2=4.934、7.841，均P＜0.05）。正常乳腺組MT1-MMP蛋白陽性率高于UDH組，差異有統(tǒng)計學意義（χ2=5.670，P＜0.05）。

2.2 MT1-MMP蛋白表達與浸潤性乳腺癌患者臨床病理特征的關(guān)系 見表1。

表1 浸潤性乳腺癌組織MT1-MMP蛋白表達與患者臨床病理特征的關(guān)系

由表1可見，MT1-MMP蛋白表達與腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期及PR相關(guān)（均P＜0.05）。隨著組織學分級增高，MT1-MMP蛋白表達有增高趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。MT1-MMP蛋白表達與浸潤性乳腺癌患者年齡、腫瘤大小、c-erbB-2、分子分型均無關(guān)（均P＞0.05）。進一步以logistic回歸模型多因素分析MT1-MMP蛋白表達與浸潤性乳腺癌患者臨床病理特征之間的關(guān)系，顯示浸潤性乳腺癌患者MT1-MMP蛋白表達的獨立相關(guān)因素包括腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（OR=0.213，95%CI= 0.084～0.544，P＜0.01）和PR表達狀態(tài)（OR=1.927，95% CI=1.049～3.542，P＜0.05）。

3 討論

基質(zhì)金屬蛋白酶是一類鋅離子依賴性蛋白水解酶，它們是參與細胞外基質(zhì)降解和代謝的最主要酶類[7]。膜型基質(zhì)金屬蛋白酶是基質(zhì)金屬蛋白酶的一個亞家族，其中已發(fā)現(xiàn)MT1-MMP/MMP-14、MT2-MMP/MMP-15、MT3-MMP/MMP-16、MT4-MMP/MMP-17、MT5-MMP/ MMP-24、MT6-MMP/MMP-25 6種成員[8]。其中MT1-MMP是MT-MMPs家族的一個重要成員，在纖維肉瘤、腎細胞癌、肝細胞性肝癌等多種腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮了重要的作用[2,9]。目前，雖然有部分文獻報道了乳腺癌中MT1-MMP蛋白的表達[3-6]，但關(guān)于浸潤性乳腺癌和DCIS中MT1-MMP蛋白表達差異情況尚存在爭議：Lodillinsky等[3]研究顯示，在DCIS向浸潤性癌進展的過程中MT1-MMP蛋白表達顯著增強，然而另一項研究顯示MT1-MMP蛋白表達在DCIS中顯著高于DCIS伴微浸潤的區(qū)域[4]。另外有研究顯示DCIS和浸潤性乳腺癌之間MT1-MMP蛋白表達未見明顯差異[5-6]。并且我們查閱國內(nèi)外相關(guān)數(shù)據(jù)庫后發(fā)現(xiàn)，關(guān)于MT1-MMP蛋白在乳腺癌發(fā)生、發(fā)展的全過程中哪幾個階段發(fā)揮主要作用鮮有相關(guān)報道。因此，在本研究中，我們選取了乳腺癌發(fā)生、發(fā)展過程中的一系列樣本，即選取正常乳腺組織、UDH、DCIS及浸潤性乳腺癌等來闡明MT1-MMP蛋白在乳腺癌中的表達及其在乳腺癌發(fā)生、發(fā)展中的臨床病理意義。

本研究結(jié)果顯示，MT1-MMP蛋白在正常乳腺組織中表達高于UDH組織。我們認為可能是由于UDH中增生上皮較正常乳腺上皮相對幼稚，其在增生過程中MT1-MMP基因表達的一個或多個環(huán)節(jié)（如轉(zhuǎn)錄或翻譯過程）受限，從而導致其表達下調(diào)。在病變由UDH和DCISⅠ～Ⅱ、DCISⅢ級至浸潤性乳腺癌發(fā)展的過程中，MT1-MMP蛋白表達呈上升趨勢，可能是受到一些腫瘤發(fā)生、發(fā)展相關(guān)信號通路的調(diào)控，且MT1-MMP蛋白表達與浸潤性乳腺癌患者腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、較高的臨床分期、PR陰性等多項預(yù)后不良因素相關(guān)，這些結(jié)果提示MT1-MMP蛋白在乳腺癌進展的全過程中均發(fā)揮了重要作用。

本研究表明MT1-MMP蛋白在HER2過表達型和TNBC中的表達較Luminal型略高，但差異無統(tǒng)計學意義，與先前研究結(jié)果一致[10]。另外他們的研究顯示MT1-MMP蛋白表達與浸潤性乳腺癌患者激素狀態(tài)、臨床分期無關(guān)[10]，與本研究結(jié)果有較大的差別，我們分析可能是由于評分標準的差異造成的。

關(guān)于MT1-MMP影響腫瘤細胞侵襲和轉(zhuǎn)移的下游機制已有較多研究報道，目前顯示它除了自身可降解細胞外基質(zhì)外，還可促進腫瘤間質(zhì)內(nèi)成纖維細胞分泌基質(zhì)金屬蛋白酶2前體和基質(zhì)金屬蛋白酶9前體，并進一步激活這些前體基質(zhì)金屬蛋白酶[11]，從而促進基質(zhì)降解和腫瘤細胞遷移。另外MT1-MMP和CD44異源二聚體可激活表皮生長因子受體并啟動下游一系列促腫瘤信號通路[2]。然而關(guān)于腫瘤中調(diào)控MT1-MMP表達的上游機制目前僅見少數(shù)報道，Akanuma等[12]報道食管鱗狀細胞癌中微小RNA-133a可調(diào)控MT1-MMP和細胞骨架蛋白FSCN1表達，進而影響癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移，且MT1-MMP和FSCN1有協(xié)同促癌作用。那么乳腺癌中MT1-MMP是否受到miR-133a的調(diào)控，其和FSCN1之間是否存在相關(guān)性，我們將進一步研究。

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Expression of MT1-MMP in breast cancer and its correlation w ith clinicopathology

WANG Chaoqun,ZENG Yue,WANG Yan,et

al.Department of Pathology,Dongyang People's Hospital，Dongyang 322100,China

Objective To investigate the exp ression of MT1-MMP p rotein in breast cancer and to evaluate its c linicopathologic significance. Methods The exp ression of MT1-MMP p rotein was detected by immunohistochem ical EnVision method in 48 samp les ofnormalb reast tissues,64 cases ofusualductalhyperp lasia (UDH),72 cases ofductalcarcinoma in situ (DCIS)and 220 cases of invasive b reast cancer. Results The exp ression rates ofMT1-MMP p rotein in invasive breast cancer, DCISⅢ,DCISⅠ-Ⅱ,UDH and normalbreast tissues were 67.73%(149/220),25.64%(10/39),6.06%(2/33),4.69%(3/64),18.75% (9/48).The MT1-MMP p rotein exp ression in invasive breast cancer was significantly higher than those in DCISⅢ,DCISⅠ-Ⅱ, UDH and normal breast tissues(P＜0.01),and MT1-MMP p rotein exp ression in DCISⅢwas significantly higher than those in DCISⅠ-Ⅱ (P＜0.05)and UDH(P＜0.01).MT1-MMP p rotein exp ression in invasive b reast cancer was increased w ith the increasing c linical stages(P＜0.01),and MT1-MMP p rotein positive rates in patients with axillary lymph node metastasis and negative PR status were significantly higher than those w ith negative axillary lym ph node and positive PR(P＜0.01 and P＜0.05, respectively).Logistic regression analysis showed thataxillary lym ph nodemetastasis(OR=0.213,95%CI=0.084～0.544,P＜0.01) and PR status(OR=1.927,95%CI=1.049～3.542,P＜0.05)were independent fac tors ofMT1-MMP p rotein exp ression in invasive b reastcancer.Conclusion MT1-MMP p rotein exp ression shows significantly increasing trend from UDH,DCISⅠ-Ⅱ,DCISⅢto invasive b reast cancer,and its exp ression is correlated w ith unfavorab le p rognostic factors of invasive b reast cancer,suggesting that MT1-MMP may p lay an im portant role in the p rog ression of breast cancer and m ight be a potential anti-cancer therapy biologicalmarker.

MT1-MMP Breastcancer Immunohistochem istry DCIS UDH

2016-05-16）

（本文編輯：楊麗）

10.12056/j.issn.1006-2785.2017.39.6.2016-698

浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科技計劃項目（2012KYB230）

322100 東陽市人民醫(yī)院病理科（王超群、曾悅、黃必飛、孫鑫鑫、王倩），腫瘤內(nèi)科（王艷），腫瘤外科（趙永明、胡桂女），生物醫(yī)學實驗室（蘇振銘）

王超群，E-mail：chaoqunw869@163.com