湯倩倩 盧山 蔣敏海

SCID小鼠永久性左側(cè)大腦中動脈阻塞模型的制備及評價

湯倩倩 盧山 蔣敏海

目的 研究嚴(yán)重免疫缺陷（SCID）小鼠永久性左側(cè)大腦中動脈閉塞（L-MCAO）模型的制備及評價。方法 將SCID小鼠隨機分為假手術(shù)組和L-MCAO組各15只。于SCID小鼠嗅束外緣電凝并切斷左側(cè)大腦中動脈（L-MCA），制作L-MCAO模型。使用激光散斑血流儀實時監(jiān)測小鼠腦血流量，并計算腦血流量比值；術(shù)后在小鼠麻醉清醒后24h進行神經(jīng)功能學(xué)評分；術(shù)后2周后取小鼠大腦行2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC）染色和二氨基聯(lián)苯胺（DAB）染色，并計算腦梗死面積百分比。結(jié)果 術(shù)后60m in L-MCAO組小鼠腦血流量比值基本穩(wěn)定在0.47±0.55，神經(jīng)功能學(xué)評分為（1.95±0.76）分，腦梗死面積百分比為（18.47±1.92）%；假手術(shù)組及建模失敗的小鼠未見梗死區(qū)域。結(jié)論 SCID小鼠永久性L-MCAO模型在一定程度上可以模擬人類腦梗死，制作成功率高，在臨床腦梗死觀察和藥物研究方面具有較高的應(yīng)用價值。

嚴(yán)重免疫缺陷 小鼠 左側(cè)大腦中動脈閉塞術(shù) 腦血流量

腦梗死是一種高發(fā)病率、高死亡率、高致殘率和高復(fù)發(fā)率的疾病。目前，主要通過開發(fā)與應(yīng)用梗腦死部位恒定、制作成功率高的動物模型對腦梗死后病變部位的病理、生理變化和相關(guān)藥物療效進行研究。大腦中動脈（middle cerebralartery，MCA）是大腦主要供血血管之一，通過大腦中動脈閉塞（middle cerebral artery occlusion， MCAO）術(shù)可以制備腦缺血模型[1-2]。嚴(yán)重免疫缺陷（severe combined immuno deficiency，SCID）小鼠永久性左側(cè)大腦中動脈閉塞（left middle cerebral artery occlusion，LMCAO）模型的建模梗死部位僅局限于MCA供血區(qū)域，因此該模型具備小鼠術(shù)后存活時間長、死亡率較低、梗死部位較一致、梗死面積均一性好的優(yōu)勢，有利于研究腦梗死后病變部位的病理、生理變化和藥物療效評價。本文就該模型的制備及評價作一探討，現(xiàn)報道如下。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 8周齡雄性SCID小鼠30只，平均體重（20.0±3.0）g，購自浙江省中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心，本實驗取得浙江省中醫(yī)藥大學(xué)動物保護委員會批準(zhǔn)。實驗前小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，自由獲得水和食物；動物房12h明暗周期循環(huán)（7：00～19：00給予光照），控制室溫為（21±2）℃、濕度60%。誘導(dǎo)腦梗死后7d提供粉狀食物和無菌水。

1.2 實驗材料 2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC），XTX-4B型手術(shù)顯微鏡（鎮(zhèn)江市新天醫(yī)療器械有限公司），雙極電凝器（上海醫(yī)療器械股份有限公司），微型骨鉆，雙極鉗夾，ABS型小動物氣體麻醉機（上海玉研科學(xué)儀器有限公司），二氨基聯(lián)苯胺（DAB），異氟烷（上海玉研科學(xué)儀器有限公司），Omegazone激光散斑血流成像儀（日本東京Omegawave公司）

1.3 方法

1.3.1 構(gòu)建L-MCAO模型 將8周齡雄性SCID小鼠分為假手術(shù)組和L-MCAO組各15只。分別使用3%異氟烷誘導(dǎo)全身麻醉并用吸入1.5%的氟烷維持麻醉；按圖1a（插頁）所示放置小鼠，局部消毒，在手術(shù)顯微鏡下于左眼球與左耳孔連線中點處剪開皮膚，分離皮膚、筋膜和唾液腺，見圖1b（插頁）；使用雙極電凝器電凝灼閉視野中的血管，分離筋膜至顴骨，剪斷左顴骨，分離肌肉組織至顱底；用微型骨鉆去除顱骨。用鑷子夾取出殘留顱骨，除去硬腦膜；暴露左側(cè)大腦中動脈（L-MCA），見圖1c（插頁）；在近嗅束處用雙極電凝器電凝切斷LMCA，見圖1d（插頁）。復(fù)位肌肉組織和唾液腺，在手術(shù)區(qū)域加用動物用抗生素，用0.9%氯化鈉溶液棉球擦拭后縫合。術(shù)后將實驗動物放入恒溫箱，待動物清醒后做相關(guān)實驗。手術(shù)過程中將小鼠體溫控制在36.5～37.0℃。30只小鼠手術(shù)均成功，假手術(shù)組小鼠除不電凝切斷以外，其余同模型動物。術(shù)后小鼠均成活。有1只在飼養(yǎng)中2周內(nèi)死亡。模型制作的成功率在2周時達到96.67%。

圖1 L-MCAO模型的構(gòu)建（a：構(gòu)建模型過程中小鼠定位的示意圖；b：構(gòu)建模型過程中小鼠定位的實際圖，紅色圓形所示為手術(shù)區(qū)域；c：高倍鏡下解剖左顴骨，去除顱骨及硬腦膜，暴露L-MAC；d：電凝L-MAC的主干并切斷血管；比例尺：1mm）

1.3.2 激光散斑血流成像儀測定小鼠MCA區(qū)腦血流量暴露并使用780納米半導(dǎo)體激光照射小鼠頭骨。在LMCAO術(shù)前及術(shù)后0、10、20、30、60min，定位于前囟背側(cè)2.5、3mm處（即MCA急性缺血邊緣區(qū)）測定小鼠的腦血流量；以顱骨中線，測定對側(cè)大腦半球?qū)ΨQ位置的腦血流量。腦血流量比值=左側(cè)腦血流量/對側(cè)腦血流量。

圖2 L-MCAO小鼠MCA區(qū)腦血流量隨時間變化二維激光散斑圖（a：術(shù)前；b：術(shù)后0min；c：術(shù)后10min；d：術(shù)后20min；e：術(shù)后30min；f：術(shù)后60min；比例尺：1mm）

1.3.3 神經(jīng)功能學(xué)評分 參照Longa等[3]的5分制評分標(biāo)準(zhǔn)，在小鼠麻醉清醒后24h內(nèi)由觀察者采取單盲法進行神經(jīng)功能評分：無神經(jīng)功能缺損癥狀為0分；輕微神經(jīng)功能缺損，不能完全伸展左側(cè)前爪為1分；中度局灶性神經(jīng)功能缺損，行走時向左側(cè)轉(zhuǎn)圈為2分；重度局灶性神經(jīng)功能缺損，向左側(cè)傾倒為3分；不能自發(fā)行走，意識水平下降為4分；死亡為5分。分值越高說明行為障礙越嚴(yán)重。術(shù)后神經(jīng)功能評分l～3分則說明模型制作成功，評分0、4、5分則視為模型制作失敗。

1.3.4 梗死后腦切片行TTC染色 模型小鼠術(shù)后2周，斷頭取腦，用0.9%氯化鈉溶液沖洗大腦表面的血污，置于－80℃冰箱內(nèi)冷凍5min，取出并放入腦切片模具，以1mm厚度行冠狀切片，再行TTC染色（正常的腦組織呈紅色；缺血核心區(qū)梗死的腦組織不著色，呈白色）。

1.3.5 梗死后腦切片行DAB染色及腦梗死面積百分比計算 模型小鼠術(shù)后2周，斷頭取腦，用0.9%氯化鈉溶液沖洗大腦表面的血污，置于－80℃冰箱內(nèi)冷凍5 min，取出并放入腦切片模具，以20μm厚度行冠狀切片，再行DAB染色（棕色區(qū)域為正常腦組織，缺損區(qū)域為梗死組織）。使用Image J軟件處理，計算腦梗死面積百分比[4]。腦梗死面積百分比=（腦梗死面積）/（腦梗死側(cè)半球面積）×100%。

2 結(jié)果

2.1 L-MCAO術(shù)后小鼠MCA區(qū)腦血流量比值變化 LMCAO術(shù)后小鼠MCA區(qū)腦血流量隨時間變化的二維激光散斑圖像的代表性圖片，見圖2a-f（插頁）；術(shù)后60min小鼠腦血流量比值基本穩(wěn)定在0.47±0.55，激光散斑圖像定量分析缺血核心區(qū)的腦血流量比值隨時間的變化圖，見圖3。

圖3 腦血流量比值隨時間的變化圖

2.2 神經(jīng)功能學(xué)評分 所有小鼠麻醉清醒后24h神經(jīng)功能評分結(jié)果：L-MCAO小鼠神經(jīng)功能學(xué)評分為（1.95± 0.76）分，假手術(shù)組神經(jīng)功能學(xué)評分為0分。

2.3 TTC染色明確腦梗死情況 L-MCAO術(shù)后2周，TTC染色發(fā)現(xiàn)永久性L-MCAO模型左側(cè)大腦皮層可見缺血核心梗死發(fā)白區(qū)域，見圖4a（插頁）；假手術(shù)組及建模失敗的小鼠無梗死區(qū)域，見圖4b（插頁）。

圖4 L-MCAO術(shù)后2周TTC染色結(jié)果[a：永久性L-MCAO模型左側(cè)大腦皮層可見缺血核心梗死發(fā)白區(qū)域（箭頭所示）；b：假手術(shù)組及模型失敗的小鼠無梗死區(qū)域]

2.4 DAB染色后計算腦梗死面積百分比 L-MCAO術(shù)后2周，DAB染色發(fā)現(xiàn)永久性L-MCAO模型左側(cè)大腦皮層區(qū)出現(xiàn)梗死缺損區(qū)域，見圖5a（插頁）；假手術(shù)組及建模失敗的小鼠無梗死區(qū)域，見圖5b（插頁）。本研究中建模成功的小鼠腦梗死面積百分比為（18.47±1.92）%，見圖6。

圖5 L-MCAO術(shù)后2周DAB染色結(jié)果[a：永久性L-MCAO模型左側(cè)大腦皮層區(qū)出現(xiàn)梗死缺損區(qū)域（箭頭所示）；b：假手術(shù)組及模型失敗的小鼠無梗死區(qū)域]

圖6 模型小鼠腦梗死面積百分比

3 討論

動物模型的制作與應(yīng)用，對腦梗死后病理、生理變化的研究以及相關(guān)藥物療效的評價具有重要意義。由于嚙齒類動物價格便宜、來源容易、同高等動物腦血管的解剖相似、組織切片小等優(yōu)點，一般被用來制作腦缺血動物模型。動物腦缺血模型的制作方法大體分為開顱法和非開顱法[5]。既往多采用大鼠制作腦缺血模型，大鼠腦缺血模型最早在1981年由Tamura等[6]采用開顱電凝的方法來制作，隨后Bederson等[7]把電凝法加以推進。電凝切斷大鼠MCA制作腦梗死模型目前已被廣泛使用，但是存在手術(shù)操作復(fù)雜、腦梗死的部位和體積變異性大的缺點。目前，相關(guān)研究開始選擇SCID小鼠電凝切斷近嗅束處的MCA，制作出梗死部位和梗死體積相對恒定的皮層腦梗死動物模型。本文探討了SCID小鼠永久性L-MCAO模型的制備及評價，其優(yōu)點概括如下：（1）SCID小鼠個體差異小，血管分支少；（2）該模型可以產(chǎn)生穩(wěn)定、可重復(fù)性的大腦皮層梗死，使用較少數(shù)量的動物就能進行各種有效的篩選實驗研究；（3）制作簡單、操作方便、失敗率低；（4）術(shù)后小鼠的存活時間長（可存活至自然死亡）[8]、死亡率低；（5）可以評估長期治療或?qū)嶒炛委煹牟涣挤磻?yīng)，用于慢性期觀察[9-10]。

綜上所述，本文方法制備的SCID小鼠永久性L-MCAO模型在一定程度上可以模擬人類腦梗死，制作成功率高，在相關(guān)臨床腦梗死方面的觀察和藥物研究方面具有較高的應(yīng)用價值。

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Establishment of permanent left middle cerebral artery occlusion model in SCID mice

TANG Qianqian,LU Shan,JIANG Minhai.

Department of Neurology，Hangzhou Hospital Affiliated to Nanjing Medical University,Hangzhou 310006，China

Objective To estab lish a permanent left m idd le cereb ral artery occ lusion(L-MCAO)model in severe combined immunodeficiency(SCID)m ice. Methods Thirty SCID m ice were random ly d ivided into sham operation g roup and L-MCAO g roup w ith 15 in each g roup.The leftm idd le cereb ralartery occ lusion was induced by electrocoagulation in SCID m ice of L-MCAO g roup.The cereb ralb lood flow wasmonitored by laser Dopp ler,and the ratio of cereb ralb lood flow was calculated. The neurological deficit score was assessed 24h after operation.The animals were sacrificed two weeks after the operation;the b rain tissues were stained w ith 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride(TTC)and d iam inobenzidine(DAB),and the percentage of cerebral infarction area was calculated. Results The ratio of cerebral b lood flow in L-MCAO group was 0.47±0.55,the neurologicaldeficitscore was 1.95±0.76,and the percentage of cereb ral infarction area was(18.47±1.92)%.While there was no cerebral infarction lesion in the sham g roup and model failed m ice.Conclusion The permanent L-MCAO model of SCID m ice has been estab lished w ith high success rate,which simulates human cerebral infarction to a certain extent,and may be used for research on cereb ralinfarction and d rug development.

Severe combined immunodeficiency Mouse Leftm idd le cereb ralartery occ lusion Cereb ralb lood flow

2016-11-07）

（本文編輯：陳丹）

10.12056/j.issn.1006-2785.2017.39.6.2016-1836

杭州市科技發(fā)展計劃項目（20150733Q 07），杭州市衛(wèi)生科技計劃（重點）項目（2014Z03）

310006南京醫(yī)科大學(xué)附屬杭州醫(yī)院（杭州市第一人民醫(yī)院）神經(jīng)內(nèi)科

蔣敏海，E-mail：jm1977@126.com