楊明軒++周揚(yáng)++陸俊++李賀

摘要：以5個(gè)沙棘（Hippopha？觕 rhamnoides L.）品種的果實(shí)為試材，建立氣相色譜內(nèi)標(biāo)法測(cè)定沙棘果肉油和種子油主要脂肪酸成分的方法。果肉油和種子油采用氯仿-甲醇法提取，甲醇鈉-甲醇法甲酯化衍生后進(jìn)行定性和定量。結(jié)果表明，十九烷酸甲酯是氣相色譜法測(cè)定沙棘果實(shí)中脂肪酸成分含量的理想內(nèi)標(biāo)物。果肉油和種子油中的主要脂肪酸為棕櫚酸、棕櫚油酸、硬脂酸、油酸、亞油酸和α-亞麻酸。果肉油中棕櫚油酸（36.25%）和棕櫚油酸（28.92%）含量高，α-亞麻酸含量低；種子油中亞油酸（33.65%）和α-亞麻酸（32.95%）含量高，棕櫚油酸含量低。5個(gè)品種沙棘的果肉油和種子油中主要脂肪酸的組成及含量存在一定的差異。亞歷山大12號(hào)果肉油中的脂肪酸含量最高，為84.84 g/100 g油；無(wú)刺豐種子油中的脂肪酸含量最高，為88.39 g/100 g油。該方法操作簡(jiǎn)便、快速、重復(fù)性好，適合沙棘油脂樣品中脂肪酸的定量測(cè)定。

關(guān)鍵詞：沙棘（Hippopha？觕 rhamnoides L.）；果肉油；種子油；脂肪酸；內(nèi)標(biāo)法；定量分析

中圖分類(lèi)號(hào)：S793.6；O657.7+1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2017）09-1734-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.09.033

Determination of Fatty Acids in Pulp Oil and Seed Oil from Sea Buckthorn by GC Internal Standard Method

YANG Ming-xuan，ZHOU Yang，LU Jun，LI He

（College of Environment and Resources， Dalian Minzu University， Dalian 116600， Liaoning，China）

Abstract： A gas chromatographic method for determination of fatty acids in pulp oil and seed oil was established with five cultivars of sea buckthorn berries as materials. The pulp oil and seed oil were extracted using chloroform-methanol method. The qualitative and quantitative analysis of fatty acids in oils were performed after they were methylated with CH3ONa-CH3OH. The results showed that methyl nonadecylate was optimal internal standard to analyse the contents of fatty acids in pulp oil and seed oil from sea buckthorn. The main fatty acids included palmitic，palmitoleic，stearic，oleic，linoleic and α-linolenic acids. In pulp oil，the contents of palmitoleic acid （36.25%） and palmitic acid （28.92%） were high and α-linolenic acid was few. In seed oil， the contents of linoleic acid（33.65%） and α-linolenic acid（32.95%） were high and palmitoleic acid was few. There were some differences in composition and content of main fatty acids among five cultivars. The pulp oil from Yalishanda-12 exhibited the highest content of total fatty acids at 84.84 g/100 g oil，respectively. The seed oil from Wucifeng contained highest total fatty acids at 88.39 g/100 g oil. The method is simple，effective and accurate for the fatty acid determination of sea buckthorn oil samples.

Key words：sea buckthorn（Hippopha？觕 rhamnoides L.）；pulp oil；seed oil；fatty acid；internal standard method；quantitative analysis

沙棘（Hippopha？觕 rhamnoides L.）又名酸刺、醋柳等，胡頹子科沙棘屬多年生落葉灌木或小喬木，適應(yīng)性強(qiáng)，耐干旱，鹽堿，是中國(guó)重要的生態(tài)經(jīng)濟(jì)植物[1]。沙棘的果肉、種子和葉都含有油，即果肉油、種子油、葉油，其含油量受到基因型、生長(zhǎng)環(huán)境、成熟時(shí)期等影響。通常所說(shuō)的沙棘油主要指果肉油和種子油，二者富含不飽和脂肪酸，例如果肉油中有較多的棕櫚油酸、油酸，種子油中的亞油酸和亞麻酸較多[2，3]。沙棘油經(jīng)濟(jì)價(jià)值極高，作為藥用原料，廣泛用于治療燒傷、燙傷、凍傷等，對(duì)扁桃體炎、口腔炎、結(jié)膜炎等都有顯著療效，另外它還能調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)，對(duì)于心、腦血管系統(tǒng)疾病以及腫瘤、癌癥等有預(yù)防作用[4，5]。

沙棘油中的脂肪酸組成及含量是衡量果實(shí)品質(zhì)的一個(gè)重要指標(biāo)。國(guó)內(nèi)外針對(duì)沙棘油脂肪酸含量的檢測(cè)主要集中于脂肪酸組分相對(duì)含量的測(cè)定[6-8]，而脂肪酸絕對(duì)含量測(cè)定的研究相對(duì)較少。本試驗(yàn)在進(jìn)行內(nèi)標(biāo)物的選擇和色譜條件的優(yōu)化之后，建立了氣相色譜內(nèi)標(biāo)法測(cè)定沙棘果肉油和種子油中脂肪酸的方法，促進(jìn)了沙棘種質(zhì)資源評(píng)價(jià)和綜合開(kāi)發(fā)利用。

1 材料與方法

1.1 材料

供試的5個(gè)沙棘品種（壯圓黃、無(wú)刺豐、柳沙1號(hào)、西伯利亞紅暈、亞歷山大12號(hào)）的成熟果實(shí)于2013年7月采自遼寧省阜新沙棘良種選育研究所（E121°28′，N42°26′），-50 ℃長(zhǎng)期保存。

1.2 主要試劑、儀器

37種脂肪酸甲酯、棕櫚酸甲酯、棕櫚油酸甲酯、硬脂酸甲酯、油酸甲酯、亞油酸甲酯、亞麻酸甲酯和十九烷酸甲酯的分析標(biāo)準(zhǔn)品均購(gòu)自Sigma-Aldrich（中國(guó)）公司，色譜純級(jí)，純度≥99%；氯仿、甲醇和正己烷購(gòu)自美國(guó)Heonywell Burdick & Jackson公司，均為色譜純級(jí)，純度≥99%；甲醇鈉，氯化鉀為分析純，購(gòu)自生工生物工程上海（股份）有限公司。

GC-2010型氣相色譜儀及工作站（日本SHIMADZU）；Labconco低溫冷凍濃縮機(jī)（美國(guó)Labconco）；Mettler Toledo AB135-S型電子分析天平（瑞士 Mettler Toledo）；XW-80A微型旋渦混合儀（上海滬西分析儀器廠）。

1.3 方法

1.3.1 果肉油及種子油提取 取適量冷凍保存的沙棘果實(shí)真空凍干4 d（11 Pa，-53 ℃）。凍干后的果實(shí)放入研缽中，取出種子（自然風(fēng)干后保存），倒入液氮快速研磨至粉末狀，再次真空干燥1 d（11 Pa，-53 ℃），取出后-20 ℃保存。

果肉油的提取：取1 g果肉粉末于50 mL離心管中，加入10 mL甲醇攪拌混勻1 min，再加入20 mL氯仿攪拌混勻2 min，徹底混勻后過(guò)濾，殘?jiān)?0 mL的氯仿-甲醇（2∶1，V/V）重新懸浮，混勻后過(guò)濾，殘?jiān)?0 mL的氯仿-甲醇（2∶1，V/V）再懸浮，混勻過(guò)濾，收集濾液，加入1/4體積的0.88%的KCl，搖勻靜置，分層后除去上層，對(duì)下層用1/4體積的甲醇-水（1∶1，V/V）洗滌，移去上層重復(fù)上一步驟，移去上層，將下層過(guò)濾，濾液于-20 ℃保存。

種子油的提?。喝? g風(fēng)干種子，經(jīng)液氮研磨成粉末，移到50 mL離心管內(nèi)，余下步驟與果肉油提取方法相同。

1.3.2 樣品的甲酯化 準(zhǔn)確量取500 μL上述樣品，參考Christie[9]的方法，采用甲醇鈉-甲醇法對(duì)樣品進(jìn)行甲酯化處理。分析前向甲酯化的樣品中加入500～1 000 μL含有1 mg/mL十九烷酸甲酯的正己烷，充分溶解后經(jīng)0.45 μmL濾膜過(guò)濾待測(cè)。

1.3.3 色譜條件 色譜柱：Agilent-DB23色譜柱 （60 m×0.25 mm×0.25 μm）；柱箱：90 ℃；SPL1（進(jìn)樣口）：250 ℃；載氣：高純氮?dú)?；柱流量：0.8 mL/min；FID2（檢測(cè)器）：270 ℃；分流比30∶1，進(jìn)樣量1 μL。柱箱升溫程序：初始溫度為90 ℃，以9 ℃/min的速度升溫至190 ℃，再以3 ℃/min的速度升溫至215 ℃，保持10 min，再以3 ℃/min的速度升溫至230 ℃保持5 min，最后以3 ℃/min的速度升溫至245 ℃保持5 min。

1.3.4 混標(biāo)的配制及標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定 稱取適量棕櫚酸甲酯、棕櫚油酸甲酯、硬脂酸甲酯、油酸甲酯、亞油酸甲酯、亞麻酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)品，用含有1 mg/mL十九烷酸甲酯的正己烷溶液分別配制成5、5、2、4、5、5 mg/mL的6種脂肪酸甲酯儲(chǔ)備液。按表1的濃度梯度，取適當(dāng)體積的每種儲(chǔ)備液，用含有濃度為1 mg/mL正己烷（19∶0）的溶液定容，配制8組脂肪酸甲酯的混合標(biāo)準(zhǔn)品（混標(biāo)）。根據(jù)果肉和種子中脂肪酸的組成特點(diǎn)，選擇適合的濃度范圍，應(yīng)用GCsolution工作站內(nèi)標(biāo)法制定每種脂肪酸甲酯相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 按上述色譜條件，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)樣品的保留時(shí)間和峰面積對(duì)樣品進(jìn)行定性定量。采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行單因素方差分析和差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的確定及內(nèi)標(biāo)物的選擇

圖1是37種脂肪酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)品的總離子流色譜情況，在該色譜條件下，37種脂肪酸甲酯混合標(biāo)準(zhǔn)品顯示出較好的分離效果，其出峰時(shí)間在6～45 min之內(nèi)，可用于待測(cè)沙棘油中脂肪酸成分的定性。

如圖2和圖3所示，沙棘果肉油和種子油中所有的脂肪酸甲酯顯示出較好的分離效果和較高的信號(hào)響應(yīng)，與37種脂肪酸甲酯混標(biāo)的出峰時(shí)間一致性高。利用GCsolution軟件將樣品的總離子流與37種脂肪酸甲酯混標(biāo)的色譜圖進(jìn)行比對(duì)后定性。根據(jù)出峰時(shí)間、峰高和峰面積可判斷，沙棘果肉油和種子油中的主要脂肪酸包括棕櫚酸（C16：0）、棕櫚油酸（C16：1）、硬脂酸（C18：0）、油酸（C18：1c）、亞油酸（C18：2c）和α-亞麻酸（C18：3n3）6種，集中在20～30 min被分離，但它們?cè)诠庥秃头N子油中的組成有所不同。

植物油脂中脂肪酸的定量常以十五烷酸及其甲酯、十七烷酸及其甲酯作為內(nèi)標(biāo)物，也有用十三烷酸及其甲酯作為內(nèi)標(biāo)物。但由圖2和圖3可見(jiàn)，上面提到的內(nèi)標(biāo)物不適于本試驗(yàn)。在柳沙1號(hào)沙棘的果肉油和種子油中，均檢測(cè)出了十五烷酸（15：0）和十七烷酸（C17：0），前者在果肉油和種子油中為微量，出峰時(shí)間大約在19 min；后者在果肉油中含量稍高，種子油中為痕量，出峰時(shí)間大約在22 min。另外，沙棘果肉和種子中的主要脂肪酸為16碳和18碳脂肪酸，出峰時(shí)間集中在20～30 min，十三烷酸甲酯作為內(nèi)標(biāo)物出峰時(shí)間距離這一范圍較遠(yuǎn)，不是理想的內(nèi)標(biāo)物。圖4為供試樣品不加十九烷酸甲酯和加入十九烷酸甲酯作為內(nèi)標(biāo)物的對(duì)比色譜。十九烷酸甲酯的出峰時(shí)間在被測(cè)物出峰范圍之內(nèi)，且與被檢測(cè)物分離效果明顯，不與已知脂肪酸甲酯反應(yīng)，可以有效起到內(nèi)標(biāo)物的作用，表明其是理想的脂肪酸定量的內(nèi)標(biāo)物。因此本試驗(yàn)選擇沙棘果肉油和種子油中均未檢測(cè)到的十九烷酸甲酯作為脂肪酸定量所用內(nèi)標(biāo)物。

2.2 線性關(guān)系與重現(xiàn)性

圖5是6種脂肪酸甲酯混合標(biāo)準(zhǔn)品加/未加內(nèi)標(biāo)物的色譜情況，以標(biāo)準(zhǔn)品與內(nèi)標(biāo)物的峰面積比為橫坐標(biāo)（x），以標(biāo)準(zhǔn)品與內(nèi)標(biāo)物的質(zhì)量濃度比為縱坐標(biāo)（y），進(jìn)行線性回歸分析。配制的內(nèi)標(biāo)物十九烷酸甲酯的正己烷溶液濃度為1 mg/mL，所有的脂肪酸甲酯混標(biāo)和甲酯化的待測(cè)樣品均用此溶液溶解后檢測(cè)，因此，y即代表每種脂肪酸甲酯的質(zhì)量濃度。根據(jù)所測(cè)樣品的濃度范圍建立相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見(jiàn)表2和表3。果肉油中6種主要脂肪酸的線性回歸方程的相關(guān)系數(shù)在0.999 1～0.999 8；種子油中6種主要脂肪酸的線性回歸方程的相關(guān)系數(shù)在0.994 2～0.999 8，表明在設(shè)定的氣相色譜條件下6種脂肪酸組分的峰面積與其含量有較好的線性相關(guān)性，試驗(yàn)方法能在給定的濃度范圍內(nèi)準(zhǔn)確地測(cè)定脂肪酸組分的含量。

對(duì)回收率的測(cè)定本研究采用加標(biāo)回收法，各取3份等體積的已知質(zhì)量濃度的果肉油和種子油甲酯化樣品，分別加入不同質(zhì)量的6種脂肪酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)品，使果肉油中棕櫚酸甲酯和棕櫚油酸甲酯的質(zhì)量濃度增加1.0 mg/mL，油酸甲酯和亞油酸甲酯的質(zhì)量濃度增加0.4 mg/mL，硬脂酸甲酯和α-亞麻酸甲酯質(zhì)量濃度增加0.1 mg/mL；使種子油中亞油酸甲酯和α-亞麻酸甲酯的質(zhì)量濃度增加1.0 mg/mL，油酸甲酯和棕櫚酸甲酯的質(zhì)量濃度增加0.50 mg/mL，硬脂酸甲酯和棕櫚油酸甲酯的質(zhì)量濃度增加0.1 mg/mL，根據(jù)每種標(biāo)準(zhǔn)品的加入量和檢出量計(jì)算其回收率。另外，檢測(cè)6份平行處理得到的樣品，計(jì)算測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，以考察試驗(yàn)方法的重復(fù)性。方法的回收率結(jié)果和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差見(jiàn)表2和表3。在所選擇的方法和條件下，果肉油和種子油主要脂肪酸定量分析的回收率分別在在92.4%～101.2%和92.7%～102.3%，符合試驗(yàn)要求。二者被測(cè)定脂肪酸的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于4.0%，說(shuō)明方法重復(fù)性好。

2.3 不同品種沙棘果肉油與種子油中脂肪酸組成及含量的測(cè)定

由表4可知，5個(gè)品種沙棘果肉油的主要脂肪酸成分中棕櫚油酸和棕櫚酸含量較多，分別占36.25%和28.93%；其次是油酸（15.29%）和亞油酸（12.27%）；硬脂酸（4.52%）和α-亞麻酸（2.75%）含量較少。不飽和脂肪酸含量占66.56%，多不飽和脂肪酸（亞油酸和α-亞麻酸）占15.02%。果肉中棕櫚油酸比棕櫚酸含量稍高，在24.02～32.56 g/100 g油之間，棕櫚酸的含量在14.36～26.33 g/100 g油之間，二者含量最高的品種是柳沙1號(hào)，達(dá)到58.89 g/100 g油。油酸和亞油酸的平均含量分別為（14.26±2.25）和（9.32±1.77） g/100 g油。果肉中只含有微量的α-亞麻酸，平均為（2.09±0.65） g/100 g油。果肉油中主要脂肪酸含量高的品種是亞歷山大12號(hào)和柳沙1號(hào)，分別為84.84 g/100 g油和84.15 g/100 g 油，含量較高的是壯圓黃和無(wú)刺豐，分別為75.91 g/100 g和74.18 g/100 g油，西伯利亞紅暈最低，為60.62 g/100 g油。5個(gè)品種沙棘果肉油中6種主要脂肪酸的平均含量從大到小依次排列為棕櫚油酸>棕櫚酸>油酸>亞油酸>硬脂酸>α-亞麻酸。

5個(gè)品種沙棘種子油中的主要脂肪酸含量的比較分析結(jié)果如表5所示。其中不飽和脂肪酸的含量明顯高于果肉油，占83.41%，多不飽和脂肪酸占66.27%，兩種多不飽和脂肪酸亞油酸和α-亞麻酸在種子中含量較多，分別占33.65%和32.95%；其次是油酸，占15.50%，棕櫚油酸含量最低，僅占1.32%。不飽和脂肪酸含量明顯高于果肉油。5個(gè)沙棘品種的種子中亞油酸的含量在25.73～30.75 g/100 g油，α-亞麻酸在19.97～29.89 g/100 g油，二者含量最高的是無(wú)刺豐品種，達(dá)60.64 g/100 g油，油酸的平均含量為12.77 g/100 g油，棕櫚酸的平均含量為9.81 g/100 g油，硬脂酸的平均含量為3.85 g/100 g油，棕櫚油酸為微量，平均1.09 g/100 g油。種子油中主要脂肪酸含量最大的品種是無(wú)刺豐，為88.39 g/100 g油，其次為壯圓黃、柳沙1號(hào)和亞歷山大12號(hào)，分別為85.85、84.77和81.84 g/100 g油，西伯利亞紅暈最低，為71.06 g/100 g油。沙棘種子油中6種主要脂肪酸的平均含量從大到小依次排列為：亞油酸>α-亞麻酸>油酸>棕櫚酸>硬脂酸>棕櫚油酸。

3 小結(jié)與討論

色譜分析的內(nèi)標(biāo)物應(yīng)與被測(cè)組分的相對(duì)分子質(zhì)量和沸點(diǎn)相近、結(jié)構(gòu)相似，且保留時(shí)間相近，但又能分開(kāi)。已報(bào)道的植物油脂分析用氣相色譜的內(nèi)標(biāo)物有十三烷酸甲酯[10]、十五烷酸甲酯[11]、十七烷酸甲酯[12]，陳云峰等[13]曾采用十九烷酸甲酯為內(nèi)標(biāo)測(cè)定了生物柴油中的脂肪酸甲酯及亞麻酸甲酯含量。本研究中，供試沙棘品種果肉油和種子油的脂肪酸成分經(jīng)定性后發(fā)現(xiàn)含有少量或微量的十五烷酸和十七烷酸，與Singh等[8]在印度沙棘品種中的發(fā)現(xiàn)相一致，從而使得十五烷酸甲酯和十七烷酸甲酯無(wú)法作為定量的內(nèi)標(biāo)物，而十三烷酸甲酯出峰時(shí)間距離待測(cè)脂肪酸較遠(yuǎn)，故選擇十九烷酸甲酯為內(nèi)標(biāo)物進(jìn)行定量分析。按照優(yōu)化的色譜條件，待測(cè)成分及內(nèi)標(biāo)物分離效果良好，驗(yàn)證了十九烷酸甲酯是定量分析沙棘油脂肪酸的理想內(nèi)標(biāo)物。

試驗(yàn)測(cè)得的沙棘果肉油和種子油中主要脂肪酸的成分與前人的報(bào)道基本一致[6，7]，包括棕櫚酸、棕櫚油酸、硬脂酸、油酸、亞油酸和α-亞麻酸。6種脂肪酸在果肉油和種子油中的組成差異較大，果肉油中棕櫚油酸和棕櫚酸含量高，亞麻酸含量最低；種子油中亞油酸和α-亞麻酸含量高，棕櫚油酸含量最低。沙棘果肉油和種子油中的脂肪酸組成與遺傳、地理環(huán)境、氣候條件、成熟期等有關(guān)，其中遺傳是關(guān)鍵影響因素。本研究中的5個(gè)沙棘品種生長(zhǎng)環(huán)境相同，均為成熟期采摘，其果實(shí)中不同部位（果肉和種子）脂肪酸的的組成和含量存在較大的差異，主要與基因型和遺傳有關(guān)。果肉油中主要脂肪酸的總量大小順序?yàn)閬啔v山大12號(hào)>柳沙1號(hào)>壯圓黃>無(wú)刺豐>西伯利亞紅暈；種子油中主要脂肪酸的總量大小順序?yàn)闊o(wú)刺豐>壯圓黃>柳沙1號(hào)>亞歷山大12號(hào)>西伯利亞紅暈。

本研究首次建立了以十九烷酸甲酯為內(nèi)標(biāo)的氣相色譜法測(cè)定沙棘油脂肪酸的方法，為沙棘油脂肪酸的絕對(duì)含量提供了有效的方法，有助于沙棘油脂肪酸的精確檢測(cè)和深度開(kāi)發(fā)。

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