史豆豆++李萌++蘇寧++孫嘯濤++何如霞++王昌濤

摘要：通過(guò)單因素試驗(yàn)優(yōu)化表面活性劑輔助提取沙棘（Hippophae rhamnoides L.）葉中黃酮的提取工藝，并且對(duì)粗提液的抗氧化活性進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明，表面活性劑輔助提取沙棘葉黃酮的最佳提取工藝為選用0.02 g/mL的蔗糖酯作表面活性劑、乙醇體積分?jǐn)?shù)5%、提取溫度70 ℃、料液比1∶70（g∶mL）、提取時(shí)間1.5 h，此條件下黃酮提取率為1.6%。黃酮粗提液對(duì)超氧陰離子自由基、羥自由基、DPPH自由基有明顯的清除作用。

關(guān)鍵詞：沙棘（Hippophae rhamnoides L.）葉；黃酮；表面活性劑；抗氧化活性

中圖分類號(hào)：S793.6 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2017）09-1726-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.09.031

Process Optimization and Anti-oxidation Evaluation of Total Flavonoids from Hippophae rhamnoides L. Leaves by Surfactant

SHI Dou-dou1a，LI Meng1a，SU Ning2，SUN Xiao-tao1b，HE Ru-xia1a，WANG Chang-tao1a，c

（1a.Beijing Key Laboratory of Plant Resources Research and Development；1b. Beijing Key Laboratory of Food Flavor Chemistry；1c.Beijing Advanced Innovation Center for Food Nutrition and Human Health，Beijing Technology and Business University， Beijing 100048，China；

2.Chinese Academy of Inspection and Quarantine，Cosmetics Technology Center， Beijing 100048，China）

Abstract： The extraction technology of total flavonoids from Hippophae rhamnoides L. leaves was optimized by single factor experiment，and the flavonoids content，the antioxidant activity of crude extract were determined. The results showed that the optimum extraction conditions were ethanol concentration 5%，extraction temperature 70 ℃，ratio of solid to liquid 1∶70（g∶mL）， extraction time 1.5 h，the concentration of surfactants was 0.02 g/mL. Under this condition， the extraction rate of flavonoids was 1.6%. The superoxide anion，OH·free radical， DPPH free radical scavenging effect.

Key words： Hippophae rhamnoides L. leaves； flavonoids； microorganism； antioxidant activity

沙棘（Hippophae rhamnoides L.）是胡頹子科沙棘屬植物，灌木或亞喬木落葉樹種，又名黑刺、醋柳、酸刺等，是一種小漿果植物[1]，是中國(guó)古代藏醫(yī)、蒙醫(yī)治病的常用藥[2]。沙棘葉作為沙棘果種植的副產(chǎn)品被廢棄，但其中黃酮類物質(zhì)含量豐富，主要成分為槲皮素、異鼠李素、山奈酚及其苷類、楊梅酮、氯原酸、豬草苷、兒茶酸、黃芪苷等[3]，具有重要的開(kāi)發(fā)價(jià)值。

蔗糖脂肪酸酯簡(jiǎn)稱蔗糖酯（Sucrose Esters，簡(jiǎn)稱SE），是一種新型的多元醇型非離子型表面活性劑。蔗糖酯具有良好的乳化、分散、增溶、潤(rùn)滑、滲透、起泡、黏度調(diào)節(jié)、防老化、抗菌等性能[4]。同時(shí)，它還具有無(wú)毒、易生物降解等特性?，F(xiàn)已被批準(zhǔn)作為食品添加劑。本研究借助蔗糖酯的增溶作用[5]，通過(guò)單因素試驗(yàn)優(yōu)化表面活性劑輔助提取沙棘葉中總黃酮的提取工藝，并且對(duì)粗提液進(jìn)行黃酮含量及抗氧化活性的測(cè)定，以期提高沙棘黃酮提取率。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

供試材料：沙棘葉（青?？灯丈锟萍加邢薰荆┓鬯楹笥?0目篩篩選，60 ℃下烘干至恒重備用。

試劑：蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（生化試劑，中國(guó)藥品生物制品檢定所）；DPPH（1，1-二苯基-2-三硝基苯肼）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；無(wú)水乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉均為市售國(guó)產(chǎn)分析純；Tris-HCl緩沖液（弱堿性）、鄰苯三酚溶液、HCl溶液、H2O2、FeSO4、水楊酸、蔗糖脂肪酸酯等。

儀器：UVmini-1240型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（日本島津制作所），水浴恒溫?fù)u床、全溫度震蕩培養(yǎng)箱（太倉(cāng)華美生化儀器廠），恒溫水浴鍋、分析天平、稱量天平、ZN-04B型小型粉碎機(jī)（北京興時(shí)利和科技發(fā)展有限公司），低速大容量臺(tái)式離心機(jī)、DHG-9030A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥機(jī)（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 表面活性劑輔助法提取沙棘葉黃酮 量取150 mL 25%乙醇，按照1∶70的料液比（g∶mL，下同）加入沙棘葉粉末，再加入3 g表面活性劑，在50 ℃下提取0.5 h，4 800 r/min離心，取上清液待測(cè)。

供試表面活性劑：十二烷基硫酸鈉（AS）、十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）、雙（2-乙基己基）磺基丁二酸鈉（AOT）、十二烷基三甲基氯化銨（DTAC）、十二烷基磺酸鈉（SDS）、聚氧乙烯月桂醚（Brij-35）、吐溫-20（Tween-20）、曲拉通X-100（X-100）和兩種生物表面活性劑（鼠李糖脂、蔗糖酯）。

1.2.2 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程的建立 準(zhǔn)確配制濃度為1 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液，精確吸取體積為0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液，將體積補(bǔ)齊至1 mL，各加入5%的NaNO2溶液0.3 mL，搖勻，放置6 min后，再加入10%的Al（NO3）3溶液0.3 mL，搖勻后，放置6 min，加入1 mol/L的NaOH溶液4 mL，再加0.4 mL的水，搖勻后，放置10 min，以空白試劑為對(duì)照，在波長(zhǎng)510 nm條件下測(cè)定溶液吸光度。以蘆丁濃度為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。對(duì)蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液的濃度和吸光度A510 nm進(jìn)行線性回歸處理，計(jì)算得到回歸方程：Y=1.378 7x-0.002 7，R2=0.999 5。

1.2.3 黃酮提取率測(cè)定 準(zhǔn)確吸取1 mL的粗提液，按照“1.2.2”的方法測(cè)定粗提液吸光度，由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出粗提液中黃酮的濃度。

黃酮提取率=粗提液中黃酮濃度×粗提液總體積/原料質(zhì)量×100%。

1.2.4 單因素試驗(yàn) 選取蔗糖酯加入量、料液比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取溫度、提取時(shí)間5個(gè)因素進(jìn)行單因素試驗(yàn)，考察這5個(gè)因素對(duì)蔗糖酯輔助法提取沙棘葉黃酮提取率的影響，以提取率為衡量指標(biāo)，確定表面活性劑輔助法提取沙棘葉黃酮的最佳工藝條件。

1）蔗糖酯加入量對(duì)沙棘葉黃酮提取率的影響。量取150 mL 5%乙醇，按照1∶70的料液比（g∶mL，下同）加入沙棘葉粉末，再加入1、2、3、4、5、6、7 g蔗糖酯，在50 ℃下提取0.5 h，4 800 r/min離心，取上清液待測(cè)。

2）料液比對(duì)沙棘葉黃酮提取率的影響。量取150 mL 5%乙醇，按照1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶70、 1∶80的料液比加入沙棘葉粉末，再加入3 g蔗糖酯，50 ℃下提取0.5 h，4 800 r/min離心，取上清液待測(cè)。

3）乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)沙棘葉黃酮提取率的影響。量取150 mL 5%、10%、20%、30%、40%、60%乙醇，按照1∶70的料液比加入沙棘葉粉末，再加入3 g蔗糖酯，在50 ℃下提取0.5 h，4 800 r/min離心，取上清液待測(cè)。

4）提取溫度對(duì)沙棘葉黃酮提取率的影響。量取150 mL5%乙醇，按照1∶70的料液比加入沙棘葉粉末，再加入3 g蔗糖酯，在40、50、60、70、80 ℃下提取0.5 h，4 800 r/min離心，取上清液待測(cè)。

5）提取時(shí)間對(duì)沙棘葉黃酮提取率的影響。量取150 mL 5%乙醇，按照1∶70的料液比加入沙棘葉粉末，再加入3 g蔗糖酯，在70 ℃下提取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h，4 800 r/min離心，取上清液待測(cè)。

1.2.5 驗(yàn)證試驗(yàn) 在最佳工藝條件下，測(cè)定沙棘葉黃酮提取率，3次重復(fù)，取平均值。

1.2.6 粗提液抗氧化活性的測(cè)定

1）對(duì)超氧陰離子清除作用。取0.05 mol/L pH 8.2的Tris-HCl緩沖液4.5 mL于試管中，置于25 ℃水浴中預(yù)熱20 min；分別加入1 mL不同濃度的試樣和0.4 mL，25 mmol/L的鄰苯三酚溶液（2.5 mmol/L鄰苯三酚（由10 mmol/L HCl配制），混勻后于25 ℃水浴中反應(yīng)5 min；加入8 mol/L鹽酸1.0 mL終止反應(yīng)，以Tris-HCl緩沖液作參比，空白組以0.1 mL去離子水代替樣品試液，在299 nm處測(cè)定吸光度，計(jì)算清除率?？瞻讓?duì)照組以1 mL試樣溶劑代替樣品，每個(gè)處理均3次重復(fù)。

清除率=（A1-A2）/A1×100%

式中，A1為空白吸光度，A2為試樣吸光度。

2）對(duì)羥自由基清除作用。在試管中依次加入2 mL 6 mmol/L FeSO4，2 mL不同稀釋倍數(shù)待測(cè)樣品，2 mL 6 mmol/L H2O2，搖勻，室溫靜止10 min。再加入2 mL 6 mmol/L水楊酸，搖勻，于37 ℃水浴加熱30 min后取出，測(cè)定其吸光度Ai；在試管中依次加入2 mL 6 mmol/L FeSO4，2 mL不同稀釋倍數(shù)待測(cè)樣品，2 mL 6 mmol/L H2O2，搖勻，室溫靜止10 min，再加入2 mL去離子水，搖勻，于37 ℃水浴加熱30 min后取出，測(cè)定其吸光度Aj；在試管中依次加入2 mL 6 mmol/L FeSO4，2 mL去離子水，2 mL 6 mmol/L H2O2，搖勻，室溫靜止10 min，再加入2 mL 6 mmol/L水楊酸，搖勻，于37 ℃水浴加熱30 min后取出，測(cè)定其吸光度A0。

清除率=[（A0+Aj）-Ai]/A0×100%

3）對(duì)DPPH自由基清除作用。取等體積（一般為3 mL）的待測(cè)液與2×10-4 mol/L的DPPH溶液混勻（A1管）；取等體積的無(wú)水乙醇（待測(cè)物溶劑）與2×10-4 mol/L的DPPH溶液混勻（A2管）；取等體積的無(wú)水乙醇與待測(cè)液混勻（A3管）；反應(yīng)30 min后，在517 nm下測(cè)A1、A2、A3管吸光度[6]。

清除率=[（A2+A3）-A1]/A2×100%

2 結(jié)果與分析

2.1 表面活性劑種類對(duì)沙棘葉黃酮提取的影響

表面活性劑種類對(duì)沙棘葉黃酮提取的影響如圖1所示。由圖1可知，分別用表面活性劑Brij-35、AS、蔗糖酯、SDS、AOT、鼠李糖酯、5%乙醇、X-100、Tween-20、CTAB、DTAC輔助提取沙棘葉黃酮時(shí)，提取率逐漸降低；當(dāng)使用X-100、Tween-20、CTAB和DTAC輔助提取時(shí)，黃酮提取率低于5%乙醇輔助提取時(shí)的提取率，因此，這4種表面活性劑除了不能促進(jìn)沙棘葉黃酮的提取，反而對(duì)其有抑制作用，故選用蔗糖酯為最合適的表面活性劑。

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 蔗糖酯加入量對(duì)沙棘葉黃酮提取的影響 不同蔗糖酯添加量對(duì)沙棘葉黃酮提取率的影響如圖2所示。當(dāng)溶液總體積為150 mL，在蔗糖酯加入量小于5 g時(shí)，其沙棘葉黃酮提取率逐漸增加，且在5 g時(shí)達(dá)到峰值，而高于5 g之后提取率明顯下降，故蔗糖酯加入量為5 g最為適宜。

2.2.2 料液比對(duì)沙棘葉黃酮提取的影響 料液比對(duì)蔗糖酯輔助提取沙棘葉黃酮的影響如圖3所示。當(dāng)料液比為1∶60、1∶70、1∶80時(shí)沙棘葉黃酮提取率比較理想，且在1∶70時(shí)候達(dá)到峰值，在此之前隨著料液比的增加提取率呈上升趨勢(shì)；當(dāng)提取率大于1∶70時(shí)，沙棘葉黃酮提取率呈明顯的下降趨勢(shì)，故選用 1∶70為最佳料液比。

2.2.3 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)沙棘葉黃酮提取的影響 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)提取沙棘葉黃酮提取率的影響如圖4所示。當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為5%時(shí)，沙棘葉黃酮的提取效率最高，此后隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的升高提取率反而降低，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到40%時(shí)，提取率才有所回升，但回升幅度較低。因此，選用5%為最佳乙醇體積分?jǐn)?shù)。

2.2.4 提取溫度對(duì)沙棘葉黃酮提取的影響 提取溫度對(duì)提取沙棘葉黃酮提取率的影響如圖5所示。當(dāng)提取溫度達(dá)到70 ℃時(shí)，沙棘葉黃酮提取率達(dá)到峰值；當(dāng)提取溫度小于40 ℃時(shí)提取率明顯降低，當(dāng)提取溫度高于70 ℃時(shí)，提取率也呈降低趨勢(shì)，故選用70 ℃為最加提取溫度。

2.2.3 提取時(shí)間對(duì)沙棘葉黃酮提取的影響 提取時(shí)間對(duì)提取沙棘葉黃酮提取率的影響如圖6所示。沙棘葉黃酮提取率在提取時(shí)間為1.5 h的時(shí)達(dá)到峰值，2.0 h時(shí)提取率有明顯回落，但當(dāng)提取時(shí)間延長(zhǎng)至2.5 h時(shí)，提取率又有所增長(zhǎng)。因此，選用1.5 h為最佳時(shí)提取時(shí)間。

2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

在最佳工藝條件下，即150 mL 5%乙醇，按照1∶70的料液比加入沙棘葉粉末2 g，再加入5 g蔗糖酯，在70 ℃下提取1.5 h，4 800 r/min離心，取上清液測(cè)定沙棘葉黃酮提取率，3次重復(fù)，取平均值。結(jié)果表明，沙棘葉黃酮提取率為1.6%。

2.4 沙棘葉黃酮粗提液的抗氧化活性

2.4.1 沙棘葉黃酮粗提液對(duì)超氧陰離子的清除作用 從圖7中可以看出，沙棘黃酮粗提液對(duì)超氧陰離子有明顯的抑制作用，粗提液對(duì)超氧陰離子自由基的清除作用隨粗提液稀釋倍數(shù)增大而呈下降趨勢(shì)。粗提液稀釋倍數(shù)越大，粗提液對(duì)超氧陰離子自由基的清除作用越小。

2.4.2 沙棘葉黃酮粗提液對(duì)羥自由基的清除作用 從圖8中可以看出，沙棘黃酮粗提液對(duì)羥自由基的清除作用隨粗提液稀釋倍數(shù)增大呈先上升后下降的趨勢(shì)，粗提液稀釋倍數(shù)越小，粗提液對(duì)羥自由基的清除作用越明顯，在粗提液稀釋倍數(shù)達(dá)到1.25倍時(shí)，清除作用達(dá)到最大值。

2.4.3 沙棘葉黃酮粗提液對(duì)DPPH自由基的清除作用 沙棘黃酮粗提液對(duì)DPPH自由基的IC50值為1.16%。從圖9中可以看出，沙棘黃酮粗提液對(duì)DPPH的清除作用隨粗提液稀釋倍數(shù)的變化呈下降趨勢(shì)，沙棘黃酮粗提液的稀釋倍數(shù)越大，粗提液對(duì)DPPH自由基的清除作用越小，當(dāng)沙棘黃酮粗提液的稀釋倍數(shù)達(dá)到80倍后，抑制作用趨于最小值，之后變化較小。

3 小結(jié)

利用表面活性劑蔗糖酯通過(guò)在其表面、界面的吸附作用或在溶液中形成的分子聚合體而改變黃酮類物質(zhì)在水溶液中的溶解性，提高了沙棘葉黃酮的提取率。蔗糖酯輔助法在提高沙棘葉黃酮提取率的同時(shí)，也是一種綠色環(huán)保、高效、快速的沙棘葉黃酮提取方法。

蔗糖酯輔助提取沙棘葉黃酮，得到的黃酮粗提液具有較強(qiáng)的抗氧化活性。沙棘葉黃酮粗提液對(duì)DPPH自由基的IC50值為1.16%，對(duì)超氧陰離子、羥自由基也有較明顯的清除作用。本試驗(yàn)旨在探索提取沙棘葉黃酮的新方法，試驗(yàn)證明這種新方法可行，且黃酮提取率較高，對(duì)沙棘葉黃酮應(yīng)用于化妝品領(lǐng)域提供了參考。

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