秦王閣閣++蔣維++黃煒誠++薛艷紅++劉士平

摘要：從三峽地區(qū)自然腐爛的柑橘果實上分離出1株優(yōu)勢致腐菌，經(jīng)rDNA-ITS序列分析和形態(tài)學(xué)觀察，鑒定該菌為Penicillium citrinum。用來自三峽地區(qū)特有灌木疏花水柏枝（Myricaria laxiflora）的12株具較高抗氧化活性內(nèi)生真菌，分析其對柑橘致腐菌的拮抗作用。結(jié)果表明，其中4株具有較好的拮抗效果，菌株SG-4的發(fā)酵液水相粗提物的抑菌活性最好，在柑橘中亦可抑制致腐菌生長，自然貯藏過程中有效阻止柑橘果實腐爛，說明可在三峽地區(qū)柑橘的生物保鮮中進行推廣和利用。

關(guān)鍵詞：內(nèi)生真菌；柑橘；抗氧化；生物保鮮

中圖分類號：S666；S609+.3 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2017）09-1717-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.09.029

Biopreservation of Several Endophytes to the Citrus in Three Gorges Region

QINWANG Ge-ge， JIANG Wei， HUANG Wei-cheng， XUE Yan-hong， LIU Shi-ping

（College of Life Science and Pharmacy， Three Gorges University， Yichang 443002， Hubei，China）

Abstract： A dominant fungus caused citrus rot was isolated from the naturally decaying fruit in the Three Gorges area. Through rDNA-ITS sequence and morphology analysis， the strain was identified as Penicillium citrinum. 12 endophytic fungi with high antioxidant activity from Myricaria laxiflora，a specific shrub in the Three Gorges area，were chosen to evaluate the antagonism to the citrus rot fungi. The results displayed that 4 endophytic fungi had good antagonistic activity. The aqueous phase crude extracts from SG-4 broth showed the best antifungal activity， which can inhibit the rot fungi growth in citrus fruit and effectively prevent the decay in natural storage. All the endeavors indicated that the endophytic fungi can be promoted and used in the biopreservation of citrus in the Three Gorges region.

Key words： endophytic fungi； citrus； antioxidant； biopreservation

三峽地區(qū)是中國優(yōu)質(zhì)柑橘的主產(chǎn)區(qū)之一，桔、柑、橙、柚總種植面積逾26.7萬hm2，是當(dāng)?shù)氐闹匾еa(chǎn)業(yè)[1]。但是柑橘采后鮮果集中上市，果實又迅速發(fā)生后熟，季節(jié)性供過于求導(dǎo)致大量的柑橘腐爛，造成巨大的經(jīng)濟損失[2]。霉菌的生長、氧化和失水是影響柑橘貯藏的主要因素[3]，傳統(tǒng)上使用冷藏、氣調(diào)、打蠟等工藝進行防腐保鮮，但這些方法有些成本高，有些有副作用影響果品的品質(zhì)[4]。生物保鮮法為解決上述問題提供了新的契機。一些細(xì)菌、酵母或絲狀真菌作為柑橘致腐菌的拮抗劑，配合一些植物次生代謝產(chǎn)物（主要作為抗氧化劑）能有效控制果實的采后病害[5-7]，能保持原有風(fēng)味和營養(yǎng)，貯藏條件易控制，處理費用低，污染小，是果品貯運保鮮的重要發(fā)展方向[8]。

為篩選到合適的拮抗菌，本研究首先分離鑒定了三峽地區(qū)柑橘優(yōu)勢致腐菌，然后從特異分布在三峽河岸帶地區(qū)常年受淹水脅迫（氧化脅迫）的疏花水柏枝（Myricaria laxiflora）上[9，10]，篩選出12株抗氧化活性較高的內(nèi)生真菌，分析其對柑橘致腐菌的拮抗作用和果實保鮮作用，獲得一株抗氧化活性較高，同時又具備較高拮抗活性的內(nèi)生真菌SG-4，為柑橘生物保鮮和采后病害防治奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 疏花水柏枝高抗氧化活性內(nèi)生真菌篩選

選取12株在淹水脅迫前后有氧或無氧條件下從疏花水柏枝的根、莖、葉中分離得到的內(nèi)生真菌進行拮抗菌的篩選，經(jīng)總抗氧化能力測定，其抗氧化活性均大于15 U/mL，18S ITS序列比對后確定到屬，具體菌株信息見表1。

1.2 柑橘優(yōu)勢致腐菌的分離與鑒定

從自然條件下完全腐爛的三峽地區(qū)柑橘果實中挑取孢子接種于馬鈴薯培養(yǎng)基（PDA）中，28 ℃培養(yǎng)7 d，多次劃線分離純化，具體分離鑒定程序參考孔玉珊等[2]的方法。

1.3 菌株致病性檢測

將菌株用無菌水制成1×105 CFU/mL的菌懸液，柑橘果實用2%次氯酸鈉溶液消毒2 min，清水洗凈，在柑橘果實上刺4個直徑3 mm、深3 mm的傷口，在傷口處接種20 μL孢子懸浮液，晾干，于28 ℃培養(yǎng)觀察果實發(fā)病情況。根據(jù)柯赫氏法則[11]，檢測菌株的致腐菌。

1.4 內(nèi)生菌對致腐菌的抑菌作用

從4 ℃冰箱中取出高抗氧化活性內(nèi)生真菌，接種到PDA平板上，28 ℃培養(yǎng)7 d。將致腐菌接種于PDA液體培養(yǎng)基中，待菌絲球產(chǎn)生后接種到PDA斜面上，28 ℃培養(yǎng)3 d，加入9 mL無菌水，刮下孢子，取500 μL孢子懸液涂布在PDA培養(yǎng)基上。用打孔器取內(nèi)生菌菌餅，接種于涂布致腐菌的平板上，28 ℃恒溫培養(yǎng)2 d，測量抑菌圈直徑。

提取內(nèi)生真菌發(fā)酵液粗提物時，先將內(nèi)生真菌接種到150 mL PDA液體培養(yǎng)基中，28 ℃培養(yǎng)7 d。真空抽濾分離發(fā)酵液與菌體，菌體用等體積70%丙酮浸提24 h，重復(fù)3次過濾取濾液。濾液用乙酸乙酯等體積萃取，得到三部分分別為菌體相、水相和乙酸乙酯相。水相在55 ℃、0.1 MPa下旋蒸至黏稠狀，收集待用。菌體相與酯相在42 ℃、0.1 MPa下旋蒸至黏稠狀收集。將致腐菌接種到PDA斜面培養(yǎng)基上，28 ℃下培養(yǎng)3 d。在試管中加10 mL無菌水，用接種環(huán)刮下所有孢子。在PDA平板表面加入400 μL稀釋10倍的柑橘致腐病菌孢子菌懸液，涂布均勻。將牛津杯立在培養(yǎng)基表面，每個牛津杯滴入150 μL 10倍稀釋的真菌提取物，觀察抑菌作用。以0.2 mg/L化學(xué)保鮮劑咪鮮抑霉唑為正對照，28 ℃培養(yǎng)3 d。

1.5 柑橘貯藏試驗

柑橘洗凈后，刺4個直徑3 mm、深3 mm的傷口，在傷口處接種100 μL柑橘致腐菌孢子懸浮液，空白組用清水涂抹柑橘表面，試驗組用真菌提取物稀釋10倍涂抹，晾干，28 ℃培養(yǎng)觀察果實發(fā)病情況。自然貯藏時選取體形大小、成熟度基本一致、無病蟲和機械損傷的宜昌本地柑橘果實，7個為一組用不同方法保存。貯藏后30 d進行第1次調(diào)查， 以后每隔15 d調(diào)查1次，共查3次。爛果率=爛果數(shù)÷調(diào)查總果數(shù)×100%，防腐效果=（空白組爛果率-對應(yīng)處理爛果率）÷空白組爛果率×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 三峽地區(qū)柑橘優(yōu)勢致腐菌

取宜昌地區(qū)生產(chǎn)的柑橘，自然貯藏，分離到兩株優(yōu)勢致腐菌，其中一株鑒定為鐮刀菌（Fusarium sp.）[2]，另一株命名為G-1，在PDA培養(yǎng)基上菌落呈絨狀，形狀不規(guī)則，疏松，生長較快；菌絲體為白色，之后形成灰綠色霉層，邊緣菌絲帶白色，較寬，基質(zhì)顏色為白色。顯微鏡檢觀察其分生孢子串生，呈橢圓形，菌絲分枝且具有橫隔（圖1）。其18S ITS序列（登錄號KX599232）與已報道的橘青霉（Penicillium citrinum）同源性高達(dá)100%，進化樹分析表明（圖2），該菌是一株橘青霉。

為進一步明確所分離的橘青霉是否是造成三峽地區(qū)柑橘采后腐爛的優(yōu)勢菌，將菌株接種在柑橘果實上2 d后進行觀察，在傷口周圍形成約2 cm的病斑，果皮變軟，之后病斑快速擴大，全果變軟，表皮開始長出白色菌體，之后生長出大量的分生孢子，最后形成灰綠色霉層，果皮變?yōu)楹稚?，故判斷所分離得到的橘青霉與先期分離的鐮刀菌一樣，均為三峽地區(qū)柑橘采后的致腐菌（圖3）。

2.2 疏花水柏枝內(nèi)生菌菌株對致腐菌的抑菌作用

為了從疏花水柏枝內(nèi)生真菌中篩選到對柑橘致腐菌有拮抗作用的菌株，采用抑菌圈法分析了內(nèi)生真菌對2株柑橘致腐優(yōu)勢菌的拮抗作用。結(jié)果表明，在12株高抗氧化活性的內(nèi)生菌中，有4株內(nèi)生真菌具有較好的拮抗效果，分別為HY-1、HG-2、SG-4、SG-17，其中SG-4抑菌活性最明顯（表2）。

2.3 內(nèi)生真菌發(fā)酵液粗提物對致腐菌的抑菌作用

為了進一步明確HY-1、HG-2、SG-4、SG-17這4株內(nèi)生菌發(fā)揮抑菌作用的機理，采用抑菌圈法分析了內(nèi)生菌發(fā)酵液粗提物對致腐菌的拮抗作用。結(jié)果表明，只有各內(nèi)生真菌發(fā)酵液水相粗提物對柑橘致腐菌有明顯的抑菌作用，說明抗菌物質(zhì)存在于各內(nèi)生真菌發(fā)酵液水相粗提取物中，且SG-4發(fā)酵液水相粗提物對致腐菌的抑制效果明顯優(yōu)于其他菌株（表3，圖4）。

為了探究內(nèi)生真菌對柑橘果實的保鮮作用，分析了SG-4發(fā)酵液粗提物對柑橘接種橘青霉致腐菌后的抑菌作用。結(jié)果表明，空白組柑橘果實接種致腐菌橘青霉9 d后，全果變軟，表皮上形成灰綠色霉層，果皮變?yōu)楹稚?，果實腐爛。試驗組柑橘果實涂抹SG-4發(fā)酵液水相粗提物并接種橘青霉9 d后，僅在傷口周圍形成少許白色菌體。由此可證明，SG-4發(fā)酵液水相粗提物能較好地抑制柑橘果實中橘青霉的生長，有效阻止柑橘果實的腐爛（圖5）。

2.4 柑橘自然貯藏中的保鮮作用

為了分析SG-4粗提物對自然貯藏下柑橘的保鮮作用，采用SG-4粗提物液體浸果，配合保鮮膜的保水作用，對不同貯藏時期的柑橘保鮮效果進行了分析。結(jié)果表明，柑橘在室溫下分別貯藏30、45、60 d后，SG-4粗提物浸果能有效抑制柑橘橘青霉、鐮刀菌等致腐菌的生長，從而達(dá)到柑橘保鮮的效果（表4）。

在柑橘自然貯藏過程中，添加保鮮膜可以有效防止水分的蒸發(fā)，起到保持水分和新鮮度的作用。但從上述試驗結(jié)果可以看出（表4），保鮮膜對于柑橘防止致腐菌的感染沒有作用，出現(xiàn)添加保鮮膜后其腐爛率增加的現(xiàn)象，不管是空白組還是添加SG-4粗提物后表現(xiàn)出類似的趨勢，表明適度的低氧水平可能會促進柑橘致腐菌的生長。但是，不管是否添加保鮮膜，與空白組相比，SG-4提取物對柑橘致腐菌都有很好的抑制作用，且SG-4粗提物液體浸果+保鮮膜和正對照咪鮮抑霉唑的防腐效果相當(dāng)，表明SG-4可以配合保鮮膜等保水措施來共同延長柑橘的保鮮期。

3 小結(jié)與討論

從自然發(fā)病的完全腐爛的宜昌本地柑橘果實上分離出1株優(yōu)勢致腐菌，經(jīng)rDNA-ITS序列分析表明該菌為Penicillium citrinum。采用抑菌圈法分析了12株三峽地區(qū)本地物種疏花水柏枝內(nèi)生真菌對柑橘致腐菌的拮抗作用，結(jié)果表明在12株內(nèi)生真菌中，有4株具有較好的拮抗效果，分別為HY-1、HG-2、SG-4、SG-17。其中SG-4顯示出較好的抑菌活性，對三峽地區(qū)柑橘的生物保鮮和防腐發(fā)揮作用。

采用抑菌圈法分析了內(nèi)生真菌HY-1、HG-2、SG-4、SG-17發(fā)酵液水相粗提物對柑橘致腐菌的拮抗作用，結(jié)果表明4株內(nèi)生真菌發(fā)酵液的水相粗提物對致腐菌有很好的抑制作用，其中SG-4效果最佳。采用柑橘實體貯藏試驗分析了內(nèi)生真菌發(fā)酵液水相粗提物對柑橘的保鮮作用，結(jié)果表明SG-4發(fā)酵液水相粗提物能較好地抑制致腐菌的生長，阻止柑橘果實腐爛，且在室溫下保存60 d后，SG-4粗提物浸果仍能有效地抑制自然儲存條件下柑橘致腐菌的生長。

今后還需進一步明確內(nèi)生真菌起拮抗作用的物質(zhì)基礎(chǔ)，根據(jù)活性跟蹤分離得到高拮抗活性的化合物，將相關(guān)工藝進一步優(yōu)化，為研發(fā)新型柑橘生物保鮮劑等提供依據(jù)。

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