陳思禹,崔越,洪甜,李玲,晉帥,黃俊,尤文葉,韓笑,葉棋濃,劉陽(yáng),王鈺琦

1.解放軍總醫(yī)院，北京 100853；2.首都師范大學(xué)，北京 100048；

3.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 生物工程研究所，北京 100850；4.錦州醫(yī)科大學(xué)，遼寧 錦州 121000

K-ras原核表達(dá)載體的構(gòu)建及生物學(xué)功能研究

陳思禹1,崔越2,洪甜3,李玲3,晉帥1,黃俊3,尤文葉1,韓笑4,葉棋濃2,劉陽(yáng)1,王鈺琦1

1.解放軍總醫(yī)院，北京 100853；2.首都師范大學(xué)，北京 100048；

3.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 生物工程研究所，北京 100850；4.錦州醫(yī)科大學(xué)，遼寧 錦州 121000

目的：構(gòu)建帶Myc標(biāo)簽的K-ras原核表達(dá)載體，并初步鑒定其生物學(xué)活性。方法：利用PCR技術(shù)從人乳腺文庫(kù)中擴(kuò)增人K-ras結(jié)構(gòu)域的基因編碼序列，插入載體pXJ-40得到重組質(zhì)粒，經(jīng)BamHⅠ和KpnⅠ雙酶切鑒定后，Western印跡檢測(cè)其在人293T細(xì)胞中的表達(dá)；利用GST pull down實(shí)驗(yàn)檢測(cè)與Raf1-RBD的結(jié)合情況，驗(yàn)證其生物性活性。結(jié)果：用PCR技術(shù)從人乳腺文庫(kù)中擴(kuò)增得到約570 bp的目的片段，插入載體pXJ-40后構(gòu)建了Myc-K-ras重組質(zhì)粒，并經(jīng)酶切鑒定及測(cè)序證實(shí)無誤；Myc-K-ras能在293T細(xì)胞中正確表達(dá)，并能與Raf1-RBD結(jié)合，具有生物學(xué)活性。結(jié)論：為進(jìn)一步研究K-ras的生物學(xué)功能奠定了重要基礎(chǔ)。

人K-ras基因；Ras/Raf/Mek/Erk；原核表達(dá)

［Key words］humanK-rasgene;Ras/Raf/Mek/Erk;eukaryotic expression

RAS通路作為調(diào)節(jié)表皮生長(zhǎng)因子受體活化下游效應(yīng)的主要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之一，對(duì)細(xì)胞的增殖具有非常重要的作用[1]。RAS家族包括K-ras/N-ras/H-ras，它們具有相似的結(jié)構(gòu)與功能。RAS蛋白相對(duì)分子質(zhì)量為21×103，因而又稱P21蛋白。RAS蛋白具有GTP酶活性作用，通過將有絲分裂和生長(zhǎng)信號(hào)從細(xì)胞漿傳遞到細(xì)胞核內(nèi)而參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、分化和調(diào)亡等多種生物學(xué)過程[2]。

大量研究顯示肺癌的發(fā)生與K-ras突變密切相關(guān)。15%～20%的非小細(xì)胞型肺癌（NSCLC）患者存在ras基因突變，其中約90%為K-ras基因突變；約80%的K-ras基因突變發(fā)生于12號(hào)密碼子（G12D），其余則主要位于13和61號(hào)密碼子上[3]?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)約30%的肺腺癌患者有K-ras基因突變，且K-ras基因突變多見于女性患者。在早期和局部晚期NSCLC中，K-ras基因突變與生存期短有密切關(guān)系，K-ras基因突變預(yù)示預(yù)后不良[4～5]。

1 材料和方法

1.1 材料

大腸桿菌DH5α感受態(tài)、原核表達(dá)載體pXJ-40、結(jié)合有GST蛋白的GST beads、結(jié)合有GSTRaf1-RBD蛋白的GST beads由本實(shí)驗(yàn)室保存；限制性核酸內(nèi)切酶BamHⅠ和KpnⅠ、PCR所需試劑及T4DNA連接酶由TaKaRa公司提供；合成K-ras基因片段的上、下游引物由作者設(shè)計(jì)，北京賽百盛生物技術(shù)有限公司合成；DNA膠回收試劑盒購(gòu)自北京天根生物科技有限公司；質(zhì)粒提取試劑盒為Promega公司產(chǎn)品；DMEM及小牛血清均購(gòu)自Gibco公司；VigoFect為威格拉斯生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；辣根過氧化物酶（HRP）偶聯(lián)的抗Myc標(biāo)簽鼠單克隆抗體由Sigma公司提供；已構(gòu)建的基因由北京華大生物技術(shù)有限責(zé)任公司測(cè)序。

1.2 人K-ras基因編碼區(qū)的擴(kuò)增

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的K-ras基因編碼序列設(shè)計(jì)上、下游引物。擴(kuò)增模板為人乳腺文庫(kù)，擴(kuò)增目的基因片段過程中使用Prime star酶。PCR條件：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s、58℃退火30 s、72℃延伸1 min，34個(gè)循環(huán)；72℃再延長(zhǎng)5 min。PCR結(jié)束后檢測(cè)PCR產(chǎn)物，在紫外燈下鑒定后切出目的基因片段，用DNA膠回收試劑盒完整地回收目的基因片段。

1.3 Myc-K-ras重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定

PCR產(chǎn)物及載體pXJ-40經(jīng)BamHⅠ和KpnⅠ雙酶切，用T4DNA連接酶于16℃連接過夜后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，挑單克隆進(jìn)行菌液PCR鑒定及BamHⅠ和KpnⅠ雙酶切鑒定，將陽(yáng)性單克隆的質(zhì)粒送北京華大公司測(cè)序。

1.4 Myc-K-ras在293T細(xì)胞系中的表達(dá)

將質(zhì)粒Myc、Myc-K-ras各轉(zhuǎn)染2個(gè)10 cm皿，每皿轉(zhuǎn)染15μg，24 h后收細(xì)胞，用含1∶1000的蛋白酶抑制劑和DTT的RIPA裂解液混勻細(xì)胞，冰浴30 min后加入等量的SDS，用Western印跡檢測(cè)其表達(dá)情況。

1.5 Myc-K-ras活性檢測(cè)

Myc-K-ras轉(zhuǎn)染10 cm皿，15μg質(zhì)粒，24 h后收細(xì)胞，用含1∶1000的蛋白酶抑制劑和DTT的低鹽免疫沉淀（IP）緩沖液500μL混勻細(xì)胞，冰浴30 min后超聲波裂解細(xì)胞（超聲2 s，停2 s，每個(gè)樣品超聲2次），之后于4℃、12 000 r/min離心10 min，取離心后的30μL細(xì)胞超聲波產(chǎn)物于另一管中做in put，加入等量的SDS于-20℃保存。將與GST-Raf1-RBD結(jié)合的beads、與GST結(jié)合的beads各30μL分別加入上述細(xì)胞裂解產(chǎn)物中，于4℃結(jié)合4 h以上，4℃、3000 r/min離心3 min去上清，用IP緩沖液500μL洗3次，混勻，于4℃環(huán)境中搖晃，5 min后，3000 r/min離心2 min重復(fù)3次，利用Western印跡檢測(cè)觀察活性。

2 結(jié)果

2.1 人K-ras基因編碼序列的克隆

擴(kuò)增模板為人乳腺文庫(kù)，擴(kuò)增獲得與預(yù)期片段大?。s570 bp）一致的PCR產(chǎn)物（圖1）。

2.2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定

用BamHⅠ和KpnⅠ同時(shí)對(duì)目的基因片段及pXJ-40載體進(jìn)行雙酶切，之后將二者連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，做菌液PCR后挑選陽(yáng)性克?。▓D2），提取相應(yīng)的質(zhì)粒，對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行BamHⅠ和KpnⅠ雙酶切鑒定，可見約570 bp的目的條帶（圖3），表明人K-ras基因的編碼序列已插入載體pXJ-40相應(yīng)的酶切位點(diǎn)中。將連接成功的質(zhì)粒送北京華大生物技術(shù)有限責(zé)任公司測(cè)序，測(cè)序后的目的片段與文獻(xiàn)報(bào)道相應(yīng)序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果表明兩者完全一致（序列略），無任何突變現(xiàn)象發(fā)生。

2.3 Western印跡檢測(cè)Myc-K-ras在293T細(xì)胞中的表達(dá)

為了驗(yàn)證Myc-K-ras能否在細(xì)胞中正確表達(dá)，將構(gòu)建初步成功的Myc-K-ras質(zhì)粒和Myc空載體分別轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，24 h后收集細(xì)胞蛋白進(jìn)行Western印跡。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染Myc空載體的無條帶，轉(zhuǎn)染Myc-K-ras質(zhì)粒的在相對(duì)分子質(zhì)量約21×103處檢出條帶（圖4），說明構(gòu)建的Myc-K-ras能在293T細(xì)胞中正確表達(dá)。

圖1 目的基因K-ras的PCR擴(kuò)增

圖2 重組質(zhì)粒Myc-K-ras的菌液PCR鑒定

圖3 重組質(zhì)粒Myc-K-ras的酶切鑒定

2.4 Myc-K-ras活性鑒定

用純化的GST-Raf1-RBD融合蛋白、GST蛋白與轉(zhuǎn)染Myc-K-ras的細(xì)胞裂解產(chǎn)物的GST-pull down反應(yīng)結(jié)果進(jìn)行Western印跡，結(jié)果顯示Myc-K-ras可與GST-Raf1-RBD蛋白結(jié)合，與文獻(xiàn)報(bào)道一致（圖5）[6～7]。

圖4 Western印跡檢測(cè)Myc-K-ras的表達(dá)

圖5 Myc-K-ras活性鑒定

3 討論

發(fā)現(xiàn)非小細(xì)胞肺癌K-ras基因突變已有20多年，其臨床價(jià)值最近引起廣泛關(guān)注。最近的研究顯示[8-9]，存在K-ras基因突變的非小細(xì)胞肺癌患者難以從輔助化療中獲益，而且K-ras基因突變多發(fā)生于應(yīng)用Gefitinib或Eroltinib治療過程中疾病進(jìn)展的NSCLC患者[10]。有研究表明，存在K-ras基因突變的NSCLC患者在應(yīng)用Eroltinib聯(lián)合化療時(shí)，其疾病進(jìn)展時(shí)間及中位生存時(shí)間均低于單獨(dú)應(yīng)用化療的患者[11]。這些提示K-ras基因突變情況可作為表皮生長(zhǎng)因子受體酪氨酸激酶抑制劑療效的預(yù)測(cè)指標(biāo)。此外，關(guān)于K-ras基因突變與吸煙史之間的關(guān)系眾說紛紜，有研究顯示K-ras基因突變與吸煙史密切相關(guān)，而在終生未吸煙患者中幾乎未發(fā)現(xiàn)K-ras基因突變[12]，但亦有研究顯示不吸煙的NSCLC患者同樣可存在K-ras基因突變[13]?？梢婈P(guān)于K-ras與肺癌發(fā)生的關(guān)系有大量工作亟待解決。因此，Myc-K-ras的構(gòu)建對(duì)研究K-ras突變與肺癌發(fā)生之間的關(guān)系有重要意義。

參考文獻(xiàn)

[1]Downward J.Targeting RAS signalling pathways in cancer therapy[J].Nat Rev Cancer,2003,3(1):11-22.

[2]Khosravi-Far R,Der C J.The Ras signal transduction pathway[J].Cancer Metastasis Rev,1994,13(1):67-89.

[3]Mascaux C,Iannino N,Martin B,et al.The role of RAS oncogene in survival of patients with lung cancer:a systematic review of the literature with meta analysis[J].Br J Cancer,2005,92(1):131-139.

[4]Nelson H H,Christiani D C,Mark E J,et al.Implications and prognostic value of k-ras mutation for earlystage lung cancer in women[J].J Natl Cancer Inst, 1999,91(23):2032-2038.

[5]Huncharek M,Muscat J,Geschwind J F.K-ras oncogene mutation as a prognosticmarker in non-small cell lung cancer:A combined analysis of 881 cases [J].Carcinogenesis,1999,20(8):1507-1510.

[6]Mclubrey J A,Steelman L S,Chappell W H,et al. Roles of the Raf/MEK/ERK pathway in cell growth, malignant t ransformat ion and drug resistance[J].Biochim Biophys Acta,2007,1773(8):1263-1284.

[7]Sacks D B.The role of scaf fold proteins in MEK/ ERK signaling[J].Biochem Soc Trans,2006,34(5):833-836.

[8]Tsao M S,Aviel-Ronen S,Ding K,et al.Prognostic and predictive importance of p53 and ras for adjuvant chemotherapy in non-small cell lung cancer[J].J Clin Oncol,2007,25(33):5240-5247.

[9]Winton T,Livingston R,Johnson D,et al.Vinorelbine plus cisplatin vs.observation in resected non-smallcell lung cancer[J].N Engl J Med,2005,352(25):2589-2597.

[10]Pao W,Wang T Y,Riely G J,et al.KRAS mutations and primary resistance of lung adenocarcinomas to gefitinib or erlotinib[J].PLoS Med,2005,2(1):e17.

[11]Eberhard D A,Johnson B E,Am ler L C,et al.Mutations in the epidermalgrowth factor receptor and K-ras are predictive and prognostic indicators innonsmall cell lung cancers treated with chemotherapy alone and in combinationwith erlotinib[J].J Clin Oncol,2005,23(25):5900-5909.

[12]Ahrendt S A,Decker P A,Alawi E A,et al.Cigarette smoking is strongly associated with mutation of the K-ras gene in patients with primary adenocarcinoma of the lung[J].Cancer,2001,92(6):1525-1530.

[13]Riely G J,Kris M G,Rosenbaum D,et al.Frequency and distinctive spectrumof KRAS mutations in never smokers with lung adenocarcinoma[J].Clin Cancer Res,2008,14(18):5731-5734.

Construction of Hum an K-ras Eukaryotic Expression Vector and its Biological Function Research

CHEN Si-Yu1,CUI Yue2,HONG Tian3,LI Ling3,JIN Shuai1,HUANG Jun3, YOU Wen-Ye1,HAN Xiao4,YE Qi-Nong2*,LIU Yang1*,WANG Yu-Qi1*

1.PLA General Hospital,Beijing 100853;2.Capital Normal University,Beijing 100048;3.Beijing Institute of Biotechnology,Beijing 100850;4.Jinzhou Medical University,Jinzhou 121000;China

*Co-corresponding authors,WANG Yu-Qi,E-mail:wyq301@qq.com;LIU Yang,E-mail:sunny301x@sina.com;YE Qi-Nong,E-mail:yeqn66@yahoo.com

Objective:To construct the eukaryotic expression vector of humanK-raslabeled with Myc tag and preliminary detect the biological function of the expression product Myc-K-ras.Methods:HumanK-rasgene was obtained from human mammary gland cDNA library by PCR and cloned into pXJ-40 vector.After the eukaryotic expression vector mediated expression of Myc-K-ras was observed in the human kidney 293T cells lines.The interactions of the K-ras with Raf1-RBD were identified by GST-pull-down assay.Results:The DNA fragment of about 570 bp was amplified from human mammary gland cDNA library by PCR,K-raseukaryotic expression vector labeled with Myc was constructed and the expression of human K-ras protein was detected by Western blot in the human kidney 293T cells lines.Myc-K-ras fusion protein of about 21 kD was induced and identified by SDSPAGE analysis,its activity was consistent with the report.Conclusion:The results has laid foundation for the further study on the function ofK-ras.

Q78

A

1009-0002（2017）03-0324-04

10.3969/j.issn.1009-0002.2017.03.016

2016-12-13

國(guó)家自然科學(xué)基金（81472589，31100604）

陳思禹（1991-），男，碩士研究生，（E-mail）15608407432@163.com；崔越（1991-），男，本科生，（E-mail）1091279576@qq.com；二者為共同第一作者

王鈺琦，（E-mail）wyq301@qq.com；劉陽(yáng)，（E-mail）sunny301x@sina.com；葉棋濃，（E-mail）yeqn66@yahoo.com