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        Q-PCR法檢測(cè)腺病毒基因治療產(chǎn)品中的復(fù)制型腺病毒

        2017-06-09 08:58:26于雷李永紅秦璽楊靖清饒春明
        生物技術(shù)通訊 2017年3期
        關(guān)鍵詞:標(biāo)準(zhǔn)產(chǎn)品檢測(cè)

        于雷,李永紅,秦璽,楊靖清,饒春明

        中國(guó)食品藥品檢定研究院,北京 100050

        Q-PCR法檢測(cè)腺病毒基因治療產(chǎn)品中的復(fù)制型腺病毒

        于雷,李永紅,秦璽,楊靖清,饒春明

        中國(guó)食品藥品檢定研究院,北京 100050

        目的:建立Q-PCR法檢測(cè)腺病毒基因治療產(chǎn)品中的復(fù)制型腺病毒(RCA)。方法:首先制備高純度的pXC1質(zhì)粒參考品(含有E1基因序列),紫外吸收法定量后經(jīng)過(guò)數(shù)學(xué)換算得到拷貝數(shù);然后比較染料法和探針?lè)ǖ撵`敏度,建立適用的Q-PCR檢測(cè)方法;最后用新建Q-PCR法定量測(cè)定腺病毒基因治療產(chǎn)品中的RCA。結(jié)果:pXC1質(zhì)粒參考品的拷貝數(shù)初步標(biāo)定為2.6×1010拷貝/μL;探針?lè)ǖ撵`敏度比染料法高1000倍;將pXC1質(zhì)粒參考品應(yīng)用于Q-PCR(探針?lè)ǎy(cè)定腺病毒基因治療產(chǎn)品中的RCA,標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=-1.416ln(x)+47.395,R2=0.9966,供試品的Cq值均位于標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)。結(jié)論:新建Q-PCR法適用于檢測(cè)腺病毒基因治療產(chǎn)品中的RCA,且結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

        腺病毒基因治療產(chǎn)品;復(fù)制型腺病毒;Q-PCR;pXC1質(zhì)粒

        病毒載體類(lèi)基因治療產(chǎn)品除選擇性復(fù)制的 溶瘤體病毒外,都是非復(fù)制型的,但是在病毒包裝過(guò)程中,病毒基因組可能與包裝細(xì)胞基因組經(jīng)過(guò)同源重組產(chǎn)生復(fù)制型病毒。出于安全有效、質(zhì)量可控的考慮,必須對(duì)該類(lèi)病毒進(jìn)行檢測(cè),以避免其在人體內(nèi)無(wú)控地自我復(fù)制,造成傷害,規(guī)避臨床隱患[1-4]。

        腺病毒是目前基因治療產(chǎn)品中最常用的病毒載體,其優(yōu)點(diǎn)在于易操作且產(chǎn)量高。作為載體的腺病毒是經(jīng)過(guò)改造的復(fù)制缺陷型,其復(fù)制必需基因E1區(qū)缺失,不能在除包裝細(xì)胞系(293、911、PERC6等)以外的細(xì)胞中復(fù)制增殖[5-7]。腺病毒類(lèi)基因治療產(chǎn)品中復(fù)制型腺病毒(replication-competent adenoviruses,RCA)的測(cè)定主要采用細(xì)胞培養(yǎng)法和Q-PCR法[8-14]。細(xì)胞培養(yǎng)法是首先將產(chǎn)品感染腺病毒載體毒性耐受的細(xì)胞株(如HeLa),用上清在A549細(xì)胞中連續(xù)傳代并檢測(cè)細(xì)胞病變數(shù)。該法的缺點(diǎn)是高滴度的腺病毒對(duì)細(xì)胞有毒性,可能會(huì)阻礙RCA的復(fù)制,造成假陰性,因此須感染大量細(xì)胞,且實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng),需數(shù)周時(shí)間。Q-PCR法則針對(duì)E1區(qū)序列設(shè)計(jì)引物,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,對(duì)RCA予以定量。但Q-PCR不能絕對(duì)定量,需要依賴(lài)標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行相對(duì)定量。本研究擬制備E1模板參考品,建立Q-PCR法定量測(cè)定腺病毒基因治療產(chǎn)品中的RCA。我們選擇含有E1基因的pXC1質(zhì)粒來(lái)制備模板標(biāo)準(zhǔn)品,首先制備高純度的pXC1質(zhì)粒參考品,紫外吸收法定量后經(jīng)過(guò)數(shù)學(xué)換算得到拷貝數(shù);然后比較染料法和探針?lè)ǖ撵`敏度,建立合適的Q-PCR檢測(cè)方法;最后將pXC1質(zhì)粒參考品用于Q-PCR定量測(cè)定腺病毒基因治療產(chǎn)品中的RCA。

        1 材料與方法

        1.1 材料

        pXC1質(zhì)粒購(gòu)自Biovector公司;高純度質(zhì)粒DNA提取試劑盒購(gòu)自Invitrogen公司;病毒基因組DNA提取試劑盒購(gòu)自Solarbio公司;Power SYBR Green PCR Master Mix、Luminaris Color Probe qPCR Master Mix購(gòu)自Thermo Fisher公司;熒光定量PCR儀為T(mén)hermo Fisher公司產(chǎn)品。

        染料法引物up(5'-GGGTCCGGTTTCTATGCC AA-3')、down(5'-CCGTATTCCTCCGGTGATAATG-3'),探針?lè)ㄒ?035F(5'-TCCGGTCCTTCTAAC ACACCTC-3')、1105R(5'-ACGGCAACTGGTTTAA TGGG-3'),探針TGAGATACACCCGGTGGTCCCGC(5-FAM,3-BHQ1)均由六合通公司合成。腺病毒基因治療樣品P53、內(nèi)皮抑素(endo)、IFN-γ和葡萄糖激酶(GCK)由本科室留存。

        1.2 質(zhì)粒參考品的制備

        pXC1質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞,挑選單克隆,DNA測(cè)序驗(yàn)證,取生長(zhǎng)過(guò)夜的菌液,用高純度質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒,紫外吸收法測(cè)定濃度。

        1.3 染料法

        PCR體系(10μL):上、下游引物(5μmol/L)各1μL,2×Power SYBR Green PCR Master Mix 5μL,模板2μL,去離子水1μL。PCR程序:95℃ 10 min;50個(gè)循環(huán)(95℃ 10 s,60℃ 10 s,72℃ 10 s)。

        1.4 探針?lè)?/p>

        PCR體系(10μL):上下游引物(5μmol/L)各1μL,探針(1.6μmol/L)1μL,2×Luminaris Color Probe qPCR Master Mix 5μL,模板2μL。PCR程序:50℃ 2 min,95℃ 10 min;50個(gè)循環(huán)(95℃ 15 s,60℃ 10 min)。

        1.5 病毒基因組DNA的提取

        參照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行,所有操作在生物安全柜中進(jìn)行。

        2 結(jié)果

        2.1 pXC1質(zhì)粒參考品的制備和初步標(biāo)定

        pXC1質(zhì)粒測(cè)序驗(yàn)證與理論序列完全一致。將提取的pXC1質(zhì)粒用去離子水稀釋至1/50,測(cè)定D260nm、D280nm值,計(jì)算DNA濃度,結(jié)果見(jiàn)表1。經(jīng)過(guò)換算,得到該pXC1質(zhì)粒參考品的拷貝數(shù)為2.6×1010拷貝/μL。

        表1 紫外吸收法測(cè)定結(jié)果及計(jì)算

        2.2 染料法和探針?lè)ū容^

        用染料法和探針?lè)▽?duì)pXC1質(zhì)粒參考品進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果見(jiàn)表2。探針?lè)ǖ淖畹蜋z測(cè)限為52.0拷貝/μL,而探針?lè)ǖ淖畹蜋z測(cè)限僅為5.20×104拷貝/μL,前者的靈敏度比后者高1000倍。因此,選用探針?lè)z測(cè)腺病毒基因治療產(chǎn)品中的RCA。

        2.3 腺病毒基因治療產(chǎn)品中RCA的測(cè)定

        用pXC1質(zhì)粒參考作為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,對(duì)腺病毒基因治療產(chǎn)品進(jìn)行RCA測(cè)定。首先將pXC1質(zhì)粒分別稀釋至2.6×102、2.6×103、2.6× 104、2.6×105、2.6×106、2.6×107拷貝/μL,將檢測(cè)結(jié)果繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到線性回歸方程y=-1.416ln(x)+47.395,R2=0.9966。圖1A為標(biāo)準(zhǔn)品和供試品的擴(kuò)增曲線,圖1B為標(biāo)準(zhǔn)曲線。將幾種待測(cè)腺病毒基因治療樣品P53、內(nèi)皮抑素、IFN-γ和葡萄糖激酶測(cè)得的Cq值帶入公式,計(jì)算樣品中RCA的拷貝數(shù),結(jié)果見(jiàn)表3。

        表2 染料法和探針?lè)z測(cè)結(jié)果

        3 討論

        Q-PCR法的靈敏度理論上可以達(dá)到單拷貝,但是我們實(shí)驗(yàn)中的檢測(cè)限僅為52.0拷貝,分析原因可能有以下兩個(gè)方面:①質(zhì)粒的純度,由于質(zhì)粒提取以后沒(méi)有經(jīng)過(guò)進(jìn)一步的純化,里面可能混雜著大量基因組DNA碎片,使紫外吸收法所測(cè)數(shù)值偏高,實(shí)際拷貝數(shù)比計(jì)算得到的拷貝數(shù)要低;②質(zhì)粒的空間結(jié)構(gòu),大部分質(zhì)粒是緊密折疊的,使模板序列未能充分暴露,PCR不完全。所以,要制備E1DNA標(biāo)準(zhǔn)品,需要純度更高的線性DNA序列。我們目前正在研究使用純化的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物作為模板,即設(shè)計(jì)引物PCR擴(kuò)出高特異性的E1基因DNA片段,然后選擇電泳回收或HPLC進(jìn)行純化,獲得高純度的模板標(biāo)準(zhǔn)品。對(duì)模板標(biāo)準(zhǔn)品拷貝數(shù)的標(biāo)定,考慮使用更加準(zhǔn)確的液滴式數(shù)字PCR替代現(xiàn)有的紫外吸收法。

        表3 腺病毒基因治療產(chǎn)品中RCA測(cè)定結(jié)果

        圖1 標(biāo)準(zhǔn)曲線法檢測(cè)腺病毒基因治療產(chǎn)品中的RCA

        從腺病毒基因治療產(chǎn)品的檢測(cè)結(jié)果來(lái)看,幾種樣品的Cq值均位于標(biāo)準(zhǔn)曲線內(nèi),說(shuō)明該法是適用的,且結(jié)果可靠。AD-P53-01和AD-P53-02為同一廠家不同批次的產(chǎn)品,結(jié)果相近。AD-GCK-1、AD-GCK-2和AD-GCK-3為同一樣品,ADGCK-1病毒基因組DNA的提取在生物安全柜中進(jìn)行,而AD-GCK-2和AD-GCK-3在普通實(shí)驗(yàn)室環(huán)境中進(jìn)行,后者測(cè)得結(jié)果高出前者數(shù)百倍,考慮是被環(huán)境中野生型腺病毒污染,因此該操作必須在生物安全柜中進(jìn)行,所用試劑和耗材也必須是無(wú)腺病毒污染的,以避免假陽(yáng)性結(jié)果出現(xiàn)。

        Q-PCR所測(cè)定的是E1基因序列,供試品可能由于生產(chǎn)工藝等問(wèn)題存在殘留的含有E1基因序列的包裝細(xì)胞DNA碎片,如果僅依賴(lài)Q-PCR方法可能造成假陽(yáng)性結(jié)果。目前有報(bào)道使用感染性PCR法來(lái)測(cè)定復(fù)制型腺病毒,該方法將細(xì)胞法和Q-PCR法相結(jié)合,先將供試品用細(xì)胞法培養(yǎng)一段時(shí)間使RCA得到擴(kuò)增,再用Q-PCR法進(jìn)行檢測(cè),此法在縮短了實(shí)驗(yàn)周期的同時(shí)還增加了靈敏度。但是,任何依賴(lài)于Q-PCR的方法都需要準(zhǔn)確可靠的標(biāo)準(zhǔn)品。因此我們下一步的計(jì)劃是以純化的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物DNA片段作為模板,并使用數(shù)字定量PCR方法進(jìn)行標(biāo)定,建立更加準(zhǔn)確可靠的參考品,用于Q-PCR法定量檢測(cè)基因治療產(chǎn)品中的RCA。目前美國(guó)FDA建議的RCA限量為<1個(gè)RCA/3×1010病毒顆粒,國(guó)內(nèi)相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)還不完善,需要充分考察相關(guān)產(chǎn)品后制定合適的標(biāo)準(zhǔn)。QPCR定量檢測(cè)RCA方法的建立,有助于相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)的確立,對(duì)腺病毒基因治療產(chǎn)品的安全性和生產(chǎn)工藝穩(wěn)定性評(píng)價(jià)具有重要意義。

        [1]李永紅.基因治療藥物的質(zhì)量控制[C]//中國(guó)藥學(xué)會(huì). 2016年生物技術(shù)藥物理化特性分析與質(zhì)量研究技術(shù)研討會(huì)資料匯編.北京:2016.

        [2]李永紅,饒春明.基因治療藥物的質(zhì)量控制分析方法[C]//中國(guó)藥學(xué)會(huì).2013年中國(guó)藥學(xué)大會(huì)暨第十三屆中國(guó)藥師周論文集.南寧:2013.

        [3]Schalk J A,de Vries C G,Orzechowski T J,et al.A rapid and sensitive assay for detection of replicationcompetent adenoviruses by a combination of microcarrier cell culture and quantitative PCR[J].J Virol Methods,2007,145(2):89-95.

        [4]Marzio G,Kerkvliet E,Bogaards J A,et al.A replication-competent adenovirus assay for E1-deleted Ad35 vectors produced in PER.C6 cells[J].Vaccine,2007,25 (12):2228-2237.

        [5]李?lèi)?ài)玲.腺病毒載體在基因治療研究中的應(yīng)用[J].陜西農(nóng)業(yè)科學(xué),2012,(5):103-104.

        [6]王素華.腺病毒載體及其在基因治療中的應(yīng)用[J].中國(guó)畜牧獸醫(yī),2009,(9):119-121.

        [7]田博,吳彬,逯南南,等.基因治療用腺病毒載體研究進(jìn)展[J].科技信息(學(xué)術(shù)研究),2007,(9):74-75.

        [8]Zhang W W,Koch P E,Roth J A.Detection of wildtype contamination in a recombinant adenoviral preparation by PCR[J].Biotechniques,1995,18(3):444-447.

        [9]Rola A,Przybylski M,Dzieciatkowski T,et al.Detection of human adenoviruses with real-time PCR assay using TaqMan fluorescent probes[J].Med Dosw Mikrobiol,2007,59(4):371-377.

        [10]Ma L,Bluyssen H A,De Raeymaeker M,et al.Rapid determination of adenoviral vector titers by quantitative real-time PCR[J].J Virol Methods,2001,93(1-2): 181-188.

        [11]Uchida E,Sato K,Iwata A,et al.An improved method for detection of replication-competent retrovirus in retrovirus vector products[J].Biologicals,2004,32(3): 139-146.

        [12]Ko G,Jothikumar N,Hill V R,et al.Rapid detection of infectious adenoviruses by mRNA real-time RTPCR[J].J Virol Methods,2005,127(2):148-153.

        [13]Ishii-Watabe A,Uchida E,Iwata A,et al.Detection of replication-competent adenoviruses spiked into recombinant adenovirus vector products by infectivity PCR[J].Mol Ther,2003,8(6):1009-1016.

        [14]Marzio G,Kerkvliet E,Bogaards J A,et al.A replication-competent adenovirus assay for E1-deleted Ad35 vectors produced in PER.C6 cells[J].Vaccine,2007,25 (12):2228-2237.

        Detection of Rep lication-Competent Adenoviruses in Adenoviral Gene Therapy Products by Q-PCR

        YU Lei,LI Yong-Hong,QIN Xi,YANG Jing-Qing,RAO Chun-Ming*

        National Institutes for Food and Drug Control,Beijing 100050,China

        *Corresponding author,E-mail:raocm@nifdc.org.cn

        Objective:To develop a Q-PCR method to detect replication-competent adenoviruses(RCA)in adenoviral gene therapy products.Methods:Highly purified pXC1 plasmid(containingE1gene)reference was prepared, the potency was determined by UV method,and the copy number was calculated by mathematical transformation. The sensitivity of SYBR Green method and probe method were compared to determine the appropriate Q-PCR. RCA in adenoviral gene therapy products were detected by newly established Q-PCR method.Results:The copy number of pXC1 plasmid reference was preliminarily calibrated to be 2.6×1010copies perμL;the sensitivity of probe method was 1000 times higher than SYBR Green method.pXC1 plasmid reference was applied to detect RCA in adenoviral gene therapy products by Q-PCR,the regression equation wasy=-1.416ln(x)+47.395,R2= 0.9966,and the Cq values of test samples were located within the scope of standard curve.Conclusion:The developed Q-PCR with high sensitivity is suitable to detect RCA in adenoviral gene therapy products,and its accuracy and reliability are validated.

        adenoviral gene therapy products;replication-competent adenoviruses(RCA);Q-PCR;pXC1 plasmid

        Q78

        A

        1009-0002(2017)03-0352-04

        10.3969/j.issn.1009-0002.2017.03.022

        2017-04-20

        于雷(1984-),女,助理研究員,(E-mail)yulei@nifdc.org.cn;李永紅(1972-),男,研究員,(E-mail)liyh@nifdc.org.cn;并列第一作者

        饒春明,(E-mail)raocm@nifdc.org.cn

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