曹蕾　馬揚光　施小明

【摘 要】 介紹了熒光定量PCR儀（ABI7500）操作規(guī)程，總結(jié)了其日常維護和注意事項，為其使用提供指導(dǎo)。

【關(guān)鍵詞】 熒光定量PCR儀 操作規(guī)程 維護

熒光定量PCR儀將PCR熱循環(huán)，熒光檢測和各種應(yīng)用分析軟件結(jié)合在一起，可以動態(tài)觀察PCR每一循環(huán)各反應(yīng)管中PCR擴增產(chǎn)物逐漸增加的情況。

1 原理介紹

實時熒光定量PCR技術(shù)，是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進行定量分析的方法[1]。

熒光染料法：熒光染料能特異性摻人DNA雙鏈，發(fā)出熒光信號，而不摻入雙鏈中的染料分子不發(fā)出熒光信號，從而保證熒光信號的增加與PCR產(chǎn)物增加完全同步[1]。

熒光探針法：探針的5 端標(biāo)記熒光報告基團 （reporter R） 3 端標(biāo)記淬滅基團（quencher Q），探針完整時，報告基團發(fā)射的熒光信號被淬滅基團吸收；PCR擴增時，Taq酶的5-3外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號，即每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物的形成完全同步[1] [2]。

通常，熒光擴增曲線可分為三個階段，即熒光背景信號階段、熒光信號指數(shù)擴增階段和平臺期。在熒光信號指數(shù)擴增階段，PCR產(chǎn)物量的對數(shù)值與起始模板量之間存在線性關(guān)系，因此可以在該階段進行定量分析。為了便于對所檢測樣本進行比較，在指數(shù)期需要設(shè)定一個熒光信號的閾值。熒光信號由本底進入指數(shù)增長階段的閾值所對應(yīng)的循環(huán)次數(shù)稱為ct值。模板的ct值與其起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多，則ct值越小。利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品及其相應(yīng)的ct值可繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線，測得未知樣品的Ct值后，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線便可準(zhǔn)確計算出該樣品的起始拷貝數(shù)[3]。

2 操作規(guī)程

2.1 開機

2.1.1 依次打開電腦顯示器和電腦主機的電源開關(guān)，進入Windows界面。

2.1.2 接著打開AB7500儀器電源開關(guān)，預(yù)熱10分鐘。

2.1.3 點擊SDS軟件。

2.2 檢測

2.2.1 選擇File-New-新建，在New Document Wizard窗口中，從Assay下拉列表中選擇反應(yīng)類型：相對定量，絕對定量，等位基因鑒別或陽性陰性實驗，從Container下拉列表中選擇反應(yīng)板類型，在Default Plate Name中輸入反應(yīng)板文件名，點擊Next，選擇需要添加到反應(yīng)板文件的探針，點擊Next，為每個孔指定探針和任務(wù)，單擊Finish。

2.2.2 在Well Inspector-View-Well Inspector中輸入樣品名。

2.2.3 運行相應(yīng)的反應(yīng)類型程序，選擇Instrument設(shè)定PCR條件。

2.2.4 點擊Save下拉菜單下的Save As，輸入文件名，點擊save，關(guān)閉設(shè)置界面。

2.2.5 按壓儀器托盤上的按壓位，待托盤彈出后，將所需檢測反應(yīng)板放入檢測孔位，再次按壓托盤使其滑入儀器，點擊Start開始檢測。

2.3 結(jié)果分析

PCR反應(yīng)結(jié)束后自動保存結(jié)果，對擴增曲線進行分析，選擇Analysis-Analysis Settings 選擇Auto Ct，軟件自動為每個反應(yīng)空生成基線和閾值，也可根據(jù)分析后圖像調(diào)節(jié)Baseline的Start值、End值，Threshold值，點擊Analyze進行再次分析。

2.4 關(guān)機

實驗結(jié)束后取出反應(yīng)管（切勿打開管蓋），順序關(guān)閉AB7500軟件、定量PCR儀電源，關(guān)閉電腦

3 日常清潔維護[4]

3.1 每周用無絨布塊蘸取75%酒精清潔儀器的表面。

3.2 每周使用75%酒精浸泡反應(yīng)管托架（晾干后放回儀器內(nèi)）。

3.3 每月執(zhí)行一次背景校準(zhǔn)

3.4 每半年檢查燈具狀態(tài)。在7500 Software中，選擇Instrument-Lamp Status/Replacement以確定鹵素?zé)舻臓顟B(tài)：Condition顯示 Good 表示燈具工作良好，不需更換鹵素?zé)?；顯示Failed表示鹵素?zé)粢褖?，需更換； Change Soon表示燈具使用超過2000小時，建議將更換。

3.5在PCR儀運行之前或期間，7500 Software可能顯示警告，按警告要求進行目標(biāo)區(qū)（ROI）校正、背景校準(zhǔn)、光學(xué)校準(zhǔn)、染料校準(zhǔn)、RNase P儀器驗證試驗等。

參考文獻

[1] 鐘江華，張光萍，柳小英.實時熒光定量PCR技術(shù)的研究進展與應(yīng)用[J].氨基酸和生物資源，2011，33（2）：68～72.

[2] 蘭靜，李秋根.實時熒光定量PCR技術(shù)理論研究及其在醫(yī)學(xué)方面的應(yīng)用[J].南昌大學(xué)學(xué)報（醫(yī)學(xué)版），2011，51（10）：97～100.

[3] 王志平.熒光定量PCR技術(shù)的原理與應(yīng)用[J].渭南師范學(xué)院學(xué)報，2012，27（10）：61～64.

[4] 魏建新. ABI7500 型熒光定量PCR儀的使用維護及故障排除[J]. 中國衛(wèi)生檢驗雜志， 2015，25（21）：3780～3781.