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        芬太尼誘發(fā)大鼠痛覺(jué)過(guò)敏狀態(tài)下中央杏仁核區(qū)突觸磷酸化細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶對(duì)脊髓場(chǎng)電位變化研究

        2017-06-09 08:00:19陳健賀詩(shī)靜楊定中
        科教導(dǎo)刊 2017年10期
        關(guān)鍵詞:杏仁核芬太尼

        陳健++賀詩(shī)靜++楊定中

        摘 要 目的:探究在芬太尼誘發(fā)大鼠痛覺(jué)過(guò)敏狀態(tài)下給予突觸磷酸化細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶抑制劑干預(yù)中央杏仁核區(qū)后脊髓場(chǎng)電位的變化。方法:SD雄性大鼠(60~90 g),CeA立體定位置管后隨機(jī)分為三組(n = 6):對(duì)照組:皮下注射生理鹽水,CeA給予DMSO,記錄場(chǎng)電位; OIH組:皮下注射芬太尼建立OIH模型,待模型成功后記錄場(chǎng)電位;U0126組:OIH組記錄場(chǎng)電位后再在CeA給予U0126,并記錄場(chǎng)電位;芬太尼或生理鹽水注射后6.5h檢測(cè)機(jī)械痛閾和熱痛閾的變化。結(jié)果:大鼠在芬太尼處理6h后機(jī)械痛閾和熱痛閾降低(P<0.05);OIH組誘發(fā)場(chǎng)電位的峰面積對(duì)照組比較明顯增加(P<0.05),CeA區(qū)給予p-ERK抑制劑U0126可逆轉(zhuǎn)上述變化(P<0.05);結(jié)論:CeA區(qū)突觸磷酸化細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶可調(diào)制脊髓場(chǎng)電位的變化,在痛覺(jué)過(guò)敏的維持過(guò)程中發(fā)揮了重要作用。

        關(guān)鍵詞 場(chǎng)電位 痛覺(jué)過(guò)敏 杏仁核 芬太尼

        杏仁核在疼痛以及疼痛相關(guān)的情緒反應(yīng)中起著重要作用,有研究表明杏仁核CeLC區(qū)注射€%e受體興奮劑內(nèi)嗎啡肽(作用強(qiáng)于嗎啡的一種內(nèi)源性阿片)可產(chǎn)生痛覺(jué)過(guò)敏,該區(qū)域主要接受從脊髓背角經(jīng)臂旁核(PB)中繼的傷害性信息的傳入。而脊髓P-ERK在調(diào)制痛覺(jué)過(guò)敏中發(fā)揮重要作用。那么我們推測(cè)杏仁核中P-ERK在調(diào)制痛覺(jué)過(guò)敏中也發(fā)揮了作用,如何去證實(shí)這個(gè)猜想呢?Heinl等給大鼠靜脈注射芬太尼,撤藥后觀察到C纖維突觸投射的脊髓背角神經(jīng)元場(chǎng)電位發(fā)生了長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)(long term potentiation,LTP )現(xiàn)象,而LTP是研究痛覺(jué)過(guò)敏機(jī)制的重要細(xì)胞模型。因此,本研究選取杏仁核為靶區(qū),探究用芬太尼誘導(dǎo)大鼠痛覺(jué)過(guò)敏時(shí),干預(yù)杏仁核中P-ERK后,在脊髓背角淺層記錄場(chǎng)電位的變化情況,旨在探明痛覺(jué)過(guò)敏狀態(tài)杏仁核中P-ERK是否也發(fā)揮了重要作用,也為研究疼痛上行通路調(diào)制下行通路提供新的線(xiàn)索和思路。

        1 材料與方法

        動(dòng)物選擇及分組。由湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心提供的SPF級(jí)健康雄性SD大鼠18只,體重60~100 g,在室溫條件下自由攝食和飲水,光照與黑暗時(shí)間為12 h:12H。實(shí)驗(yàn)前在老鼠中央杏仁核立體定位置管,之后采用隨機(jī)數(shù)字表法分為3組(n=6):對(duì)照組1:皮下注射生理鹽水,CeA給予DMSO,記錄場(chǎng)電位;對(duì)照組2:皮下注射生理鹽水,CeA給予U0126 1.5nmol,并記錄場(chǎng)電位;OIH組:頸部皮下注射芬太尼(湖北宜昌人福藥業(yè)有限責(zé)任公司),每次60 €%eg/kg,注射4次,每次間隔時(shí)間15 min,總給藥劑量240 €%eg/kg,制備大鼠痛覺(jué)過(guò)敏模型,待模型成功后記錄場(chǎng)電位;U0126組:OIH組記錄場(chǎng)電位后再在CeA給予U0126 1.5nmol,并記錄場(chǎng)電位;U0126購(gòu)于美國(guó)Cayman chemical公司,臨用前溶于含50% DMSO的生理鹽水中。

        杏仁核CeLC區(qū)立體定位置管給藥。大鼠腹腔注射濃度為10%的水合氯醛(3 ml/kg)完全麻醉后將其固定在腦立體定位儀(Stoelting公司,美國(guó))上,腦部皮膚消毒后暴露顱骨前囟和矢狀縫并在右側(cè)杏仁核區(qū)(參考大鼠腦立體定位圖譜坐標(biāo):前囟后2.0mm,中線(xiàn)旁開(kāi)4.2 mm,顱骨下7.5 mm)植入帶管芯的套管(中國(guó)深圳市瑞沃德生命科技有限公司),迅速用牙膠骨水泥固定套管并縫合皮膚。手術(shù)后至少恢復(fù)一周,測(cè)痛確認(rèn)恢復(fù)完全,以排除手術(shù)干擾。將注射內(nèi)管一端用PE管連接微量注射器針頭,另一端插入固定好的導(dǎo)管里,用微量泵緩慢給藥(0.3 €%el,0.1 €%el/min),完成注射后停留5min,使藥物充分彌散后拔出注射內(nèi)管并裝上導(dǎo)管帽。

        疼痛行為學(xué)檢測(cè)。于OIH模型建立前及芬太尼或生理鹽水注射6.5h后測(cè)機(jī)械痛和熱痛。行為學(xué)采用Von Frey絲(North Coast公司,美國(guó))測(cè)定大鼠的機(jī)械痛閾。先將大鼠靜置于特制的籠內(nèi)30 min 使其適應(yīng)環(huán)境,再用不同壓力的von Frey絲垂直作用在鼠足掌面上,陽(yáng)性反應(yīng)(大鼠出現(xiàn)抬足或舐足行為),計(jì)算50%機(jī)械縮足反應(yīng)閾。采用BME-410C型熱痛刺激儀(CAMS公司,中國(guó))測(cè)定大鼠熱痛閾。先把大鼠放入有機(jī)玻璃箱內(nèi)適應(yīng)30 min,透過(guò)玻璃板底部用熱輻射源照射大鼠左足掌正中間區(qū)域。熱痛閾為自動(dòng)記錄縮足反應(yīng)的潛伏期,為了免造成輻射損傷截止時(shí)間設(shè)為15s。每次照射間隔至少5 min,重復(fù)至少3次,最后取平均值。

        場(chǎng)電位記錄。采用10%水合氯醛(3ml/kg)腹腔注射麻醉大鼠,固定于定向儀(江灣Ⅰ型C 第二軍醫(yī)大學(xué) 中國(guó))上。暴露脊髓腰膨大(T13-L1做椎板切除手術(shù)),用玻璃電極游離左側(cè)坐骨神經(jīng),記錄時(shí)用雙極氯化銀電極刺激坐骨神經(jīng)。暴露的多余的神經(jīng)組織用浸潤(rùn)0.9%生理鹽水的紗布覆蓋。用玻璃電極進(jìn)行細(xì)胞外記錄,電極深度在脊髓表面下0.1-0.5mm。采用ME-100微電極放大器和BL-420E+生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)(成都泰盟科技有限公司 中國(guó))處理和存儲(chǔ)數(shù)據(jù)。以C-纖維誘發(fā)場(chǎng)電位的幅值和面積作為參數(shù)。給予單方波(25V,0.5ms,5min-1)刺激坐骨神經(jīng)誘發(fā)脊髓背角場(chǎng)電位。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后處死大鼠(過(guò)量水合氯醛)。

        統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。采用Graphpad prism6軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,計(jì)量資料用均數(shù)€北曜疾睿?€?)表示,多組比較采用單因素方差分析,組間比較采用t檢驗(yàn),同組不同時(shí)間比較采用配對(duì)t 檢驗(yàn),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        2 結(jié)果

        對(duì)照組與OIH組比較,OIH組6h、7h時(shí)機(jī)械痛閾和熱痛閾均降低(P<0.05)。見(jiàn)表1。

        與對(duì)照組相比,OIH組場(chǎng)電位的峰面積增加(P<0.05);從杏仁核置管裝置給予U0126干預(yù)后記錄到的場(chǎng)電位峰面積與OIH狀態(tài)時(shí)相比較顯著降低(P<0.05)。見(jiàn)圖1。

        3 討論

        臨床鎮(zhèn)痛和麻醉常用阿片類(lèi)藥物,芬太尼是臨床麻醉常用且鎮(zhèn)痛效果也很顯著的阿片類(lèi)藥物之一。有研究表明,芬太尼在用于鎮(zhèn)痛和麻醉時(shí)會(huì)引起痛覺(jué)敏感性增強(qiáng),即芬太尼誘導(dǎo)的痛覺(jué)過(guò)敏(OIH)。

        Chu等的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明外周及脊髓機(jī)制不足以來(lái)解釋OIH現(xiàn)象,我們推測(cè)OIH與疼痛上行通路有關(guān),杏仁核作為疼痛上行通路的重要節(jié)點(diǎn)之一,有研究表明杏仁核中P-ERK與痛覺(jué)過(guò)敏有關(guān),而OIH狀態(tài)下C纖維突觸投射的脊髓背角神經(jīng)元的場(chǎng)電位發(fā)生了長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)(long term potentiation,LTP)現(xiàn)象。本研究采用皮下注射芬太尼(60ug/kg),每隔15min一次,共4次,累積藥量240ug/kg,建立OIH模型。結(jié)果顯示,與對(duì)照組比較,OIH組機(jī)械痛閾和熱痛閾均降低,說(shuō)明OIH模型是成功的。在OIH模型上,通過(guò)特制的導(dǎo)管裝置靶向給予P-ERK抑制劑U0126至杏仁核區(qū)干預(yù)后,記錄C纖維突觸投射的脊髓背角神經(jīng)元場(chǎng)電位。結(jié)果顯示,與對(duì)照組比較OIH組場(chǎng)電位峰面積增加(P < 0.05);OIH組給予U0126后場(chǎng)電位峰面積顯著降低(P < 0.05)。

        綜上所述, OIH狀態(tài)下杏仁核中P-ERK參與調(diào)制脊髓場(chǎng)電位的變化,即參與調(diào)制OIH,對(duì)OIH的維持有一定的作用。但我們相信OIH的發(fā)生絕不是單個(gè)因子的作用,在杏仁核以及其它疼痛傳導(dǎo)的節(jié)點(diǎn)如PAG、RVM、PB等還有很多參與疼痛調(diào)節(jié)的因子如NMDA受體系統(tǒng)、Ⅰ型代謝型谷氨酸受體5、PKA等,它們對(duì)OIH的作用尚不明確,需要進(jìn)一步的試驗(yàn)去探究。

        *通訊作者:楊定中

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