段秀霞，施文正，邱偉強(qiáng)，方 兵，汪之和，江 敏

（1.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院/上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心，上海 201306；2.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 201306）

南美白對(duì)蝦多酚氧化酶的提取及其性質(zhì)研究

段秀霞1，施文正1，邱偉強(qiáng)1，方 兵1，汪之和1，江 敏2

（1.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院/上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心，上海 201306；2.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 201306）

以南美白對(duì)蝦為對(duì)象，研究了多酚氧化酶（PPO）分離提取工藝及其生化特性。在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化了料液比、提取液pH值和浸提時(shí)間等因素提取南美白對(duì)蝦PPO的工藝，并對(duì)PPO的生化性質(zhì)進(jìn)行分析。結(jié)果表明：液料比為2∶1、提取液體系pH值為8.0、浸提時(shí)間為3 h等條件下，提取的PPO具有最大酶活力為94.8 A/min·mL，所得回歸模型顯著（P＜0.0001），方程擬合性好（R2=0.9762），可用于預(yù)測(cè)南美白對(duì)蝦中PPO的提?。籔PO酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)方程符合米氏方程，米氏常數(shù)Km為30.322 mmol/L，Vmax為0.281 A/min。PPO性質(zhì)研究將為南美白對(duì)蝦黑變抑制提供理論指導(dǎo)。

南美白對(duì)蝦；多酚氧化酶（PPO）；響應(yīng)面優(yōu)化；反應(yīng)動(dòng)力學(xué)

我國(guó)是蝦類(lèi)養(yǎng)殖大國(guó)，2015年淡水養(yǎng)殖產(chǎn)量為186.74萬(wàn)t，比上年增長(zhǎng)5.91%，其中南美白對(duì)蝦養(yǎng)殖產(chǎn)量為73.15萬(wàn)t［1］。南美白對(duì)蝦具有肉質(zhì)鮮美、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高等特點(diǎn)，是我國(guó)養(yǎng)殖的重要蝦品種［2］。但是，南美白對(duì)蝦在貯藏中較易發(fā)生黑變，目前研究認(rèn)為這主要是因?yàn)樵诿缸饔孟?，酪氨酸或其衍生物等水溶性色原素物質(zhì)被氧化形成黑色素［3］。國(guó)內(nèi)外大量研究表明，蝦體黑變與微生物作用無(wú)關(guān)，而與多酚氧化酶（Polyphenol oxidase，PPO）作用有關(guān)，PPO是一類(lèi)含銅的氧化還原酶，廣泛存在于自然界中［4-6］。在有氧的條件下，酚酶會(huì)催化酚類(lèi)物質(zhì)形成黑色醌類(lèi)化合物［7］。研究發(fā)現(xiàn)，PPO是生物體合成黑色素所需的關(guān)鍵酶［8］。

目前，國(guó)外研究一般采用磷酸鹽緩沖液提取、以L-3，4-二羥基苯丙氨酸（L-3，4-dihydroxy-phenylalanine，L-DOPA）作為酶的底物進(jìn)行PPO活性測(cè)定［9］，而國(guó)內(nèi)研究者大多采用Tris-HCl緩沖液提取、以鄰苯二酚作為反應(yīng)底物［10］。20世紀(jì)90年代以來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)不同原料中酚氧化酶的提取和純化進(jìn)行了一系列研究，包括從植物錫蘭醋栗［11］和蕁麻葉［12］中提取多酚等。目前為止，國(guó)內(nèi)對(duì)蝦體中PPO的分離提取工藝優(yōu)化及其酶動(dòng)力學(xué)性質(zhì)的報(bào)道也較少。黃萬(wàn)有等［13］研究發(fā)現(xiàn)，凡納濱對(duì)蝦殼部與蝦肉均表現(xiàn)為頭部的PPO活性最大，所以本試驗(yàn)選擇蝦頭作為研究對(duì)象，采用磷酸鹽緩沖液浸提法對(duì)南美白對(duì)蝦中PPO提取分離，并用十二烷基聚乙二醇醚（Brij-35）作為表面活性劑、L-DOPA作為酶反應(yīng)底物，確定較優(yōu)的提取工藝條件，為進(jìn)一步開(kāi)展蝦體防褐變研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

南美白對(duì)蝦購(gòu)于上海市浦東新區(qū)古棕路農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)，選取鮮活、大小均一、完整、體重在15.5（±1.0）g/尾的個(gè)體，流水清洗加冰猝死后用速凍機(jī)速凍，置于-80℃凍藏，待用。

主要試劑：磷酸二氫鈉（分析純）、磷酸氫二鈉（分析純）、氯化鈉（分析純）、L-DOPA（分析純）、Brij-35（分子生物學(xué)用）。

儀器設(shè)備：H2050R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（湘儀離心機(jī)儀器有限公司）、AUW320電子分析天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）、超低溫保存箱（青島海爾股份有限公司）、UV-2450紫外分光光度計(jì)（日本津島公司）、均質(zhì)機(jī)（上海昂尼儀器儀表有限公司）、雷磁PHS-3C-型pH計(jì)（上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司）、DC-1015節(jié)能型智能恒溫槽（寧波新芝生物科技股份有限公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 測(cè)定波長(zhǎng)優(yōu)選 以L-DOPA為底物采用分光光度法測(cè)定PPO的活性［14］。試驗(yàn)方法經(jīng)修正為：在試管中加入1 mL 15 mmol/L的L-DOPA（用去離子水配制）、1 mL 0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 6.0）、1 mL去離子水，需要提前在25℃恒溫水浴10 min。倒入石英比色皿中先調(diào)零再加入0.3 mL上述粗酶液混合，用UV-2450紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)在260～700 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)每隔2 nm進(jìn)行掃描，確定PPO生成產(chǎn)物的最大吸收波長(zhǎng)（λmax）。

1.2.2 PPO的提取與測(cè)定 PPO的提取在吳亮亮等［13-16］方法的基礎(chǔ)上進(jìn)行修改，稱(chēng)取半解凍的帶殼蝦頭5 g，與10 mL（液料比為2∶1）0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液（0.5 mol/L NaCl、0.2% Brij35，pH 7.5）混勻于離心管中，在冰水（4± 1℃）中靜置3 h，再于4℃、12 000 r/min下冷凍離心30 min。取其上清液，即得PPO粗酶液。將上述粗酶液置于25℃恒溫水浴，于最大吸收波長(zhǎng)下檢測(cè)多巴色素的生成。在UV-2450紫外分光光度計(jì)于最大吸收波長(zhǎng)下調(diào)0，選擇紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)動(dòng)力學(xué)模塊，先調(diào)零再直接加入PPO粗酶液0.3 mL于比色皿中，該混合液作為酶反應(yīng)體系，混勻后立即測(cè)其吸光度，每隔10 s記錄1次，共測(cè)定10 min，選取吸光度A直線(xiàn)上升區(qū)間數(shù)據(jù)進(jìn)行計(jì)算酶活，此階段屬于初速率反應(yīng)的酶促反應(yīng)階段，進(jìn)而計(jì)算酶促反應(yīng)速率。

1.2.3 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì) （1）最適料液比的確定：稱(chēng)取半解凍的帶殼蝦頭5 g與不同體積0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液（0.5 mol/L NaCl、0.2% Brij35，pH 7.5）混勻，設(shè)置液料比為1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1，具體實(shí)驗(yàn)操作見(jiàn)1.2.2。（2）最適pH值的確定：稱(chēng)取半解凍的帶殼蝦頭5 g，按上述最適料液比添加0.05 mol/L pH值不同的緩沖液混勻，設(shè)置磷酸鹽緩沖液pH值為6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0，具體實(shí)驗(yàn)操作見(jiàn)1.2.2。（3）最適浸提時(shí)間的確定：稱(chēng)取半解凍的帶殼蝦頭5 g，在上述最佳料液比和pH值條件下與0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液混勻，在4（± 1）℃靜置不同時(shí)間（設(shè)置作用時(shí)間為1、2、3、4、5 h），具體實(shí)驗(yàn)操作見(jiàn)1.2.2。

1.2.4 響應(yīng)面法試驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，采用Box-Benhenken Design設(shè)計(jì)試驗(yàn)方案，選擇液料比、體系pH值和浸提時(shí)間3個(gè)對(duì)PPO活力影響較大的因素作為響應(yīng)面設(shè)計(jì)的變量，以酶活力Y作為響應(yīng)值，運(yùn)用Design Expert 8.0軟件建立數(shù)學(xué)回歸模型進(jìn)行優(yōu)化PPO的提取工藝，試驗(yàn)因素和水平設(shè)計(jì)如表1所示。

表1 響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)因素與水平

1.2.5 底物濃度與反應(yīng)速率的關(guān)系及酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)研究 在PPO的最適提取工藝條件下，測(cè)定不同底物濃度（2、4、6、8、10、12、14、16、18、20 mmol/L L-DOPA溶液）條件下PPO的酶促反應(yīng)速率，然后采用雙倒數(shù)作圖法作圖，并計(jì)算出酶促動(dòng)力學(xué)常數(shù)Km、Vmax值，具體實(shí)驗(yàn)操作見(jiàn)1.2.2。

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Office 2013、Originpro 8.5和Design Expert 8.0軟件進(jìn)行分析處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 PPO測(cè)定波長(zhǎng)確定

從圖1可以看出，以L-DOPA為底物，反應(yīng)生成產(chǎn)物有兩個(gè)吸收峰，在477 nm處有一個(gè)較寬峰，而在305 nm處有一個(gè)細(xì)窄峰。477 nm處的吸收峰與José等［14］研究南美白對(duì)蝦PPO時(shí)選擇的最適吸收波長(zhǎng)相近，這個(gè)可能是因?yàn)镻PO氧化L-DOPA生成產(chǎn)物醌類(lèi)物質(zhì)所引起的。305 nm在紫外光區(qū)域，這個(gè)吸收峰可能是由一些未參與反應(yīng)的底物產(chǎn)生。由此可見(jiàn)，PPO作用產(chǎn)物的最大吸收波長(zhǎng)為477 nm，因此本試驗(yàn)選擇477 nm作為反應(yīng)產(chǎn)物的測(cè)定波長(zhǎng)。

圖1 PPO與底物L(fēng)-DOPA作用產(chǎn)物的吸收曲線(xiàn)

2.2 南美白對(duì)蝦PPO活力單因素試驗(yàn)

2.2.1 液料比對(duì)PPO活力的影響 從圖2可以看出，PPO活力隨著液料比的增大先上升后下降。磷酸鹽溶液在提取過(guò)程中主要作用是溶解細(xì)胞膜，使蛋白質(zhì)溶解，PPO活力下降可能是因?yàn)槊赣幸欢ǖ慕Y(jié)合位點(diǎn)，與底物接觸會(huì)達(dá)到一定的反應(yīng)極限，當(dāng)?shù)孜锪砍掷m(xù)增加就會(huì)阻礙反應(yīng)的繼續(xù)，或者是因?yàn)殡x子具有水合作用，降低了蛋白質(zhì)的溶解度。當(dāng)液料比為2∶1時(shí)，PPO活力最大為27.6 A/（min·mL）。因此，后續(xù)試驗(yàn)選擇液料比2∶1。

圖2 液料比對(duì)PPO活力的影響

2.2.2 浸提時(shí)間對(duì)PPO活力的影響 從圖3可以看出，隨著浸提時(shí)間的增加，PPO活力先升高再逐漸降低，當(dāng)浸提時(shí)間為3 h時(shí)，PPO活力表現(xiàn)為最大（28.8 A/min·mL）。這可能是因?yàn)樵谔崛∏捌赑PO活力與浸提時(shí)間是成正比例增加的，但當(dāng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)時(shí)，細(xì)胞中的蛋白質(zhì)被溶解出來(lái)，部分蛋白質(zhì)凝聚沉淀就有可能出現(xiàn)，導(dǎo)致PPO活力降低。結(jié)合上述試驗(yàn)結(jié)果，后續(xù)試驗(yàn)選擇浸提時(shí)間為3 h。

2.2.3 pH值對(duì)PPO活力的影響 從圖4可以看出，PPO活力隨著pH值的增加呈先逐漸升高再下降的趨勢(shì)，當(dāng)pH為8.0時(shí)達(dá)到最大值46.8 A/（min·mL）。當(dāng)pH值在6.0～7.0，PPO活力較小且不穩(wěn)定，這可能是因?yàn)樵诘退嵝詶l件下酶活力不穩(wěn)定；當(dāng)pH值在7.0～8.0時(shí)，PPO活力隨著pH值的增加逐漸升高，可能是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變，蛋白質(zhì)分子間的部分氫鍵被破壞，從而促使酶蛋白溶解，使酶活性增強(qiáng)；但當(dāng)pH值持續(xù)升高時(shí)，PPO活力慢慢降低，可能是因?yàn)閴A性條件過(guò)強(qiáng)，使酶蛋白變性水解，使酶活力下降。因此，浸提液pH值選擇8.0較為合適。

圖3 浸提時(shí)間對(duì)PPO活力的影響

圖4 pH值對(duì)PPO活力的影響

2.3 南美白對(duì)蝦PPO活力響應(yīng)面試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)確定的液料比為2∶1、pH值為8.0、浸提時(shí)間為3 h的結(jié)果，確定合適的因素和水平，采用Box-Benhenken Design設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)方案，17組響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果見(jiàn)表2，采用Design Expert 8.0軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行方差分析，結(jié)果見(jiàn)表3。

根據(jù)相應(yīng)的方案進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，將相應(yīng)方案得到的17組數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到以酶活力Y為目標(biāo)函數(shù)的二次回歸方程模型：

響應(yīng)面軟件方差分析結(jié)果（表3）顯示，一次項(xiàng)A的回歸系數(shù)差異顯著，說(shuō)明液料比對(duì)提取的PPO活力差異顯著；一次項(xiàng)中B的回歸系數(shù)差異極顯著，說(shuō)明pH值對(duì)提取的PPO活力的影響極顯著；一次項(xiàng)中C的回歸系數(shù)差異較為顯著，說(shuō)明浸提時(shí)間對(duì)提取的PPO活力有較顯著影響；交互項(xiàng)中AB、AC的回歸系數(shù)顯著，說(shuō)明液料比與pH值、液料比與浸提時(shí)間的交互項(xiàng)對(duì)PPO活力有顯著影響。從方差分析顯著性檢驗(yàn)結(jié)果可以看出，該模型的回歸系數(shù)差異極顯著，失擬項(xiàng)系數(shù)不顯著，表明該方程對(duì)實(shí)驗(yàn)有較好的擬合性。

運(yùn)用響應(yīng)面設(shè)計(jì)軟件，參照回歸方程做出響應(yīng)面曲線(xiàn)，根據(jù)響應(yīng)面曲線(xiàn)的形狀，分析考察浸提溶液體系液料比、pH值、浸提處理時(shí)間對(duì)PPO活力的影響，結(jié)果見(jiàn)圖5。由圖5可知，液料比、浸提時(shí)間和pH值的交互作用都較顯著。運(yùn)用軟件進(jìn)行分析優(yōu)化，得到提取PPO的理論最優(yōu)工藝條件為液料比2.88∶1、pH值8.20、浸提時(shí)間3.39 h，該條件下PPO活力為90.7 A/（min·mL），提取PPO的回歸模型顯著性較好（R2=0.9762），擬合性也較好?？紤]到實(shí)驗(yàn)的實(shí)際可操作性，將上述提取參數(shù)修正為液料比2∶1、pH值8.0、浸提時(shí)間3 h。本實(shí)驗(yàn)測(cè)得的南美白對(duì)蝦PPO活力比呂艷芳等［16］研究中測(cè)得的PPO活力〔47.18 A/（min·mL）〕提高了近1倍。

在修正方案的條件下對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，做3組平行，提取的PPO活力為94.8 A/（min·mL），與預(yù)測(cè)值相比誤差為4.52%，兩者非常接近，表明該工藝穩(wěn)定可行，可用于預(yù)

測(cè)PPO的提取效果。

表2 響應(yīng)面設(shè)計(jì)方案及結(jié)果

表3 影響PPO活力的方差分析

圖5 液料比、pH值和浸提時(shí)間對(duì)PPO活力的影響

2.4 底物濃度與反應(yīng)速率的關(guān)系及酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)

從圖6可以看出，底物濃度與PPO酶促反應(yīng)速率有著直接關(guān)系，當(dāng)?shù)孜餄舛葹?～10 mmol/L時(shí)，酶促反應(yīng)速率隨底物濃度增加基本呈直線(xiàn)上升的趨勢(shì)，符合酶動(dòng)力學(xué)一級(jí)反應(yīng)曲線(xiàn)；當(dāng)?shù)孜餄舛冗_(dá)到10～16 mmol/L時(shí)，酶促反應(yīng)速率持續(xù)增加基本達(dá)到最大值，符合酶動(dòng)力學(xué)混合級(jí)反應(yīng)曲線(xiàn)；當(dāng)反應(yīng)速率達(dá)到最大值時(shí)，底物濃度繼續(xù)增加，酶促反應(yīng)速率基本不再變化，符合酶動(dòng)力學(xué)零級(jí)反應(yīng)曲線(xiàn)，說(shuō)明酶蛋白已達(dá)到飽和狀態(tài)，再進(jìn)一步增加底物也不能提高酶促反應(yīng)速率。由此可見(jiàn)，底物濃度與PPO酶促反應(yīng)速率關(guān)系基本遵循米氏方程的酶促動(dòng)力學(xué)性質(zhì)。

2.5 米氏常數(shù)及最大反應(yīng)速率

經(jīng)響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化PPO較優(yōu)提取工藝條件，在此條件下測(cè)定PPO的酶動(dòng)力學(xué)常數(shù)，以雙倒數(shù)作圖法得到圖7，可知PPO的米氏常數(shù)Km為30.322 mmol/L，最大反應(yīng)速率Vmax為0.281 A/min，這與呂艷芳等［16］研究中測(cè)得的結(jié)果相比米氏常數(shù)較小、最大反應(yīng)速率較大，說(shuō)明PPO和該底物之間的親和能力較強(qiáng)。

圖6 底物濃度與PPO反應(yīng)速率的關(guān)系

圖7 PPO的雙倒數(shù)圖

3 結(jié)語(yǔ)

目前研究表明PPO在蝦褐變中有較重要的催化作用，對(duì)其進(jìn)行研究有助于揭示蝦褐變機(jī)理，并對(duì)蝦體黑變的控制提供理論指導(dǎo)。本試驗(yàn)在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面試驗(yàn)對(duì)料液比、pH值和提取時(shí)間進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果表明，液料比、pH值、提取時(shí)間各因素及其二次項(xiàng)和交互作用對(duì)PPO的提取有顯著影響。綜合考慮實(shí)際操作各方面的因素，用磷酸鹽緩沖液提取南美白對(duì)蝦中PPO的較優(yōu)工藝條件為：液料比2∶1（mL/g），提取體系pH為8.0，浸提處理時(shí)間為3 h，此條件下提取的PPO活力為94.8 A/（min·mL）；本試驗(yàn)以磷酸鹽緩沖液為提取液、L-DOPA為酶反應(yīng)底物、Brij-35為表面活性劑所測(cè)的PPO活力比Tris-HCl作為緩沖液、鄰苯二酚作為酶反應(yīng)底物提高了近1倍；米氏方程參數(shù)為Km30.322 mmol/L、Vmax0.281 A/min。這與呂艷芳等［16］研究結(jié)果相比，酶促最大反應(yīng)速率增大，米氏常數(shù)較小，說(shuō)明PPO與L-DOPA的親和能力較強(qiáng)，結(jié)果可以為南美白對(duì)蝦褐變抑制和PPO性質(zhì)研究提供參考。試驗(yàn)中未對(duì)酶活力的抑制劑及激活劑等進(jìn)行研究，將在后續(xù)研究中開(kāi)展相關(guān)研究，通過(guò)控制PPO活力抑制蝦體黑變，為防蝦黑變提供理論依據(jù)。

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（責(zé)任編輯 張輝玲）

Extraction and characteristics of polyphenol oxidase from white shrimp

DUAN Xiu-xia1，SHI Wen-zheng1，QIU Wei-qiang1，F(xiàn)ANG Bing1，WANG Zhi-he1，JIANG Min2
（1. College of Food Science and Technology，Shanghai Ocean University / Shanghai Engineering Research Center of Aquatic Product Processing and Preservation， Shanghai 201306，China；2. College of Fisheries and Life Science，Shanghai Ocean University，Shanghai 201306，China）

The optimization of extraction and biological characteristics of polyphenol oxidase （PPO） of white shrimp （Penaeus vannamei） were studied. The experimental factors and levels were determined by single factor experiments. Response surface methodology was used to explore the effects of solid-liquid ratio，pH and extraction time on PPO activity. The results showed that the optimal extraction conditions were as follows: the solid-liquid ratio was 2∶1，pH was 8.0 and the extraction time was 3.0 h. Under the optimal extractions，the PPO activity could reach 94.8 A/min·mL. Regressive model of extracted PPO was significant （P＜0.0001） and better fitting （R2=0.9762），it could be used to predict the PPO extraction. The kinetic equation of enzyme reaction was consistent with Michaelis Menten equation. The Kmwas 30.322 mmol/L and Vmaxwas about 0.281 A/min. Study on properties of PPO could provide theoretical guidance for white shrimp anti-melanosis technology.

white shrimp；polyphenol oxidase；response surface；kinetics

TS254

A

1004-874X（2017）03-0136-07

2016-11-08

國(guó)家“十二五”科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2015BAD17B01）；上海市蝦類(lèi)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)項(xiàng)目（2014-5）；上海市高校知識(shí)服務(wù)平臺(tái)項(xiàng)目（ZF1206）

段秀霞（1990-），女，在讀碩士生，E-mail：1176914428@qq.com

施文正（1975-），男，博士，副教授，E-mail：wzshi@shou.edu.cn

段秀霞，施文正，邱偉強(qiáng)，等.南美白對(duì)蝦多酚氧化酶的提取及其性質(zhì)研究［J］.廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，44（3）：136-142.