段秀霞，施文正，邱偉強，方 兵，汪之和，江 敏

（1.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院/上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心，上海 201306；2.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 201306）

南美白對蝦多酚氧化酶的提取及其性質(zhì)研究

段秀霞1，施文正1，邱偉強1，方 兵1，汪之和1，江 敏2

（1.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院/上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心，上海 201306；2.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 201306）

以南美白對蝦為對象，研究了多酚氧化酶（PPO）分離提取工藝及其生化特性。在單因素試驗基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面試驗優(yōu)化了料液比、提取液pH值和浸提時間等因素提取南美白對蝦PPO的工藝，并對PPO的生化性質(zhì)進行分析。結(jié)果表明：液料比為2∶1、提取液體系pH值為8.0、浸提時間為3 h等條件下，提取的PPO具有最大酶活力為94.8 A/min·mL，所得回歸模型顯著（P＜0.0001），方程擬合性好（R2=0.9762），可用于預(yù)測南美白對蝦中PPO的提取；PPO酶促反應(yīng)動力學(xué)方程符合米氏方程，米氏常數(shù)Km為30.322 mmol/L，Vmax為0.281 A/min。PPO性質(zhì)研究將為南美白對蝦黑變抑制提供理論指導(dǎo)。

南美白對蝦；多酚氧化酶（PPO）；響應(yīng)面優(yōu)化；反應(yīng)動力學(xué)

我國是蝦類養(yǎng)殖大國，2015年淡水養(yǎng)殖產(chǎn)量為186.74萬t，比上年增長5.91%，其中南美白對蝦養(yǎng)殖產(chǎn)量為73.15萬t［1］。南美白對蝦具有肉質(zhì)鮮美、營養(yǎng)價值高等特點，是我國養(yǎng)殖的重要蝦品種［2］。但是，南美白對蝦在貯藏中較易發(fā)生黑變，目前研究認為這主要是因為在酶作用下，酪氨酸或其衍生物等水溶性色原素物質(zhì)被氧化形成黑色素［3］。國內(nèi)外大量研究表明，蝦體黑變與微生物作用無關(guān)，而與多酚氧化酶（Polyphenol oxidase，PPO）作用有關(guān)，PPO是一類含銅的氧化還原酶，廣泛存在于自然界中［4-6］。在有氧的條件下，酚酶會催化酚類物質(zhì)形成黑色醌類化合物［7］。研究發(fā)現(xiàn)，PPO是生物體合成黑色素所需的關(guān)鍵酶［8］。

目前，國外研究一般采用磷酸鹽緩沖液提取、以L-3，4-二羥基苯丙氨酸（L-3，4-dihydroxy-phenylalanine，L-DOPA）作為酶的底物進行PPO活性測定［9］，而國內(nèi)研究者大多采用Tris-HCl緩沖液提取、以鄰苯二酚作為反應(yīng)底物［10］。20世紀90年代以來，國內(nèi)外學(xué)者對不同原料中酚氧化酶的提取和純化進行了一系列研究，包括從植物錫蘭醋栗［11］和蕁麻葉［12］中提取多酚等。目前為止，國內(nèi)對蝦體中PPO的分離提取工藝優(yōu)化及其酶動力學(xué)性質(zhì)的報道也較少。黃萬有等［13］研究發(fā)現(xiàn)，凡納濱對蝦殼部與蝦肉均表現(xiàn)為頭部的PPO活性最大，所以本試驗選擇蝦頭作為研究對象，采用磷酸鹽緩沖液浸提法對南美白對蝦中PPO提取分離，并用十二烷基聚乙二醇醚（Brij-35）作為表面活性劑、L-DOPA作為酶反應(yīng)底物，確定較優(yōu)的提取工藝條件，為進一步開展蝦體防褐變研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

南美白對蝦購于上海市浦東新區(qū)古棕路農(nóng)貿(mào)市場，選取鮮活、大小均一、完整、體重在15.5（±1.0）g/尾的個體，流水清洗加冰猝死后用速凍機速凍，置于-80℃凍藏，待用。

主要試劑：磷酸二氫鈉（分析純）、磷酸氫二鈉（分析純）、氯化鈉（分析純）、L-DOPA（分析純）、Brij-35（分子生物學(xué)用）。

儀器設(shè)備：H2050R臺式高速冷凍離心機（湘儀離心機儀器有限公司）、AUW320電子分析天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）、超低溫保存箱（青島海爾股份有限公司）、UV-2450紫外分光光度計（日本津島公司）、均質(zhì)機（上海昂尼儀器儀表有限公司）、雷磁PHS-3C-型pH計（上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司）、DC-1015節(jié)能型智能恒溫槽（寧波新芝生物科技股份有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 測定波長優(yōu)選 以L-DOPA為底物采用分光光度法測定PPO的活性［14］。試驗方法經(jīng)修正為：在試管中加入1 mL 15 mmol/L的L-DOPA（用去離子水配制）、1 mL 0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 6.0）、1 mL去離子水，需要提前在25℃恒溫水浴10 min。倒入石英比色皿中先調(diào)零再加入0.3 mL上述粗酶液混合，用UV-2450紫外-可見分光光度計在260～700 nm波長范圍內(nèi)每隔2 nm進行掃描，確定PPO生成產(chǎn)物的最大吸收波長（λmax）。

1.2.2 PPO的提取與測定 PPO的提取在吳亮亮等［13-16］方法的基礎(chǔ)上進行修改，稱取半解凍的帶殼蝦頭5 g，與10 mL（液料比為2∶1）0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液（0.5 mol/L NaCl、0.2% Brij35，pH 7.5）混勻于離心管中，在冰水（4± 1℃）中靜置3 h，再于4℃、12 000 r/min下冷凍離心30 min。取其上清液，即得PPO粗酶液。將上述粗酶液置于25℃恒溫水浴，于最大吸收波長下檢測多巴色素的生成。在UV-2450紫外分光光度計于最大吸收波長下調(diào)0，選擇紫外-可見分光光度計動力學(xué)模塊，先調(diào)零再直接加入PPO粗酶液0.3 mL于比色皿中，該混合液作為酶反應(yīng)體系，混勻后立即測其吸光度，每隔10 s記錄1次，共測定10 min，選取吸光度A直線上升區(qū)間數(shù)據(jù)進行計算酶活，此階段屬于初速率反應(yīng)的酶促反應(yīng)階段，進而計算酶促反應(yīng)速率。

1.2.3 單因素試驗設(shè)計 （1）最適料液比的確定：稱取半解凍的帶殼蝦頭5 g與不同體積0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液（0.5 mol/L NaCl、0.2% Brij35，pH 7.5）混勻，設(shè)置液料比為1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1，具體實驗操作見1.2.2。（2）最適pH值的確定：稱取半解凍的帶殼蝦頭5 g，按上述最適料液比添加0.05 mol/L pH值不同的緩沖液混勻，設(shè)置磷酸鹽緩沖液pH值為6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0，具體實驗操作見1.2.2。（3）最適浸提時間的確定：稱取半解凍的帶殼蝦頭5 g，在上述最佳料液比和pH值條件下與0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液混勻，在4（± 1）℃靜置不同時間（設(shè)置作用時間為1、2、3、4、5 h），具體實驗操作見1.2.2。

1.2.4 響應(yīng)面法試驗設(shè)計 根據(jù)單因素試驗結(jié)果，采用Box-Benhenken Design設(shè)計試驗方案，選擇液料比、體系pH值和浸提時間3個對PPO活力影響較大的因素作為響應(yīng)面設(shè)計的變量，以酶活力Y作為響應(yīng)值，運用Design Expert 8.0軟件建立數(shù)學(xué)回歸模型進行優(yōu)化PPO的提取工藝，試驗因素和水平設(shè)計如表1所示。

表1 響應(yīng)面分析實驗因素與水平

1.2.5 底物濃度與反應(yīng)速率的關(guān)系及酶促反應(yīng)動力學(xué)研究 在PPO的最適提取工藝條件下，測定不同底物濃度（2、4、6、8、10、12、14、16、18、20 mmol/L L-DOPA溶液）條件下PPO的酶促反應(yīng)速率，然后采用雙倒數(shù)作圖法作圖，并計算出酶促動力學(xué)常數(shù)Km、Vmax值，具體實驗操作見1.2.2。

試驗數(shù)據(jù)采用Office 2013、Originpro 8.5和Design Expert 8.0軟件進行分析處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 PPO測定波長確定

從圖1可以看出，以L-DOPA為底物，反應(yīng)生成產(chǎn)物有兩個吸收峰，在477 nm處有一個較寬峰，而在305 nm處有一個細窄峰。477 nm處的吸收峰與José等［14］研究南美白對蝦PPO時選擇的最適吸收波長相近，這個可能是因為PPO氧化L-DOPA生成產(chǎn)物醌類物質(zhì)所引起的。305 nm在紫外光區(qū)域，這個吸收峰可能是由一些未參與反應(yīng)的底物產(chǎn)生。由此可見，PPO作用產(chǎn)物的最大吸收波長為477 nm，因此本試驗選擇477 nm作為反應(yīng)產(chǎn)物的測定波長。

圖1 PPO與底物L(fēng)-DOPA作用產(chǎn)物的吸收曲線

2.2 南美白對蝦PPO活力單因素試驗

2.2.1 液料比對PPO活力的影響 從圖2可以看出，PPO活力隨著液料比的增大先上升后下降。磷酸鹽溶液在提取過程中主要作用是溶解細胞膜，使蛋白質(zhì)溶解，PPO活力下降可能是因為酶有一定的結(jié)合位點，與底物接觸會達到一定的反應(yīng)極限，當(dāng)?shù)孜锪砍掷m(xù)增加就會阻礙反應(yīng)的繼續(xù)，或者是因為離子具有水合作用，降低了蛋白質(zhì)的溶解度。當(dāng)液料比為2∶1時，PPO活力最大為27.6 A/（min·mL）。因此，后續(xù)試驗選擇液料比2∶1。

圖2 液料比對PPO活力的影響

2.2.2 浸提時間對PPO活力的影響 從圖3可以看出，隨著浸提時間的增加，PPO活力先升高再逐漸降低，當(dāng)浸提時間為3 h時，PPO活力表現(xiàn)為最大（28.8 A/min·mL）。這可能是因為在提取前期PPO活力與浸提時間是成正比例增加的，但當(dāng)時間過長時，細胞中的蛋白質(zhì)被溶解出來，部分蛋白質(zhì)凝聚沉淀就有可能出現(xiàn)，導(dǎo)致PPO活力降低。結(jié)合上述試驗結(jié)果，后續(xù)試驗選擇浸提時間為3 h。

2.2.3 pH值對PPO活力的影響 從圖4可以看出，PPO活力隨著pH值的增加呈先逐漸升高再下降的趨勢，當(dāng)pH為8.0時達到最大值46.8 A/（min·mL）。當(dāng)pH值在6.0～7.0，PPO活力較小且不穩(wěn)定，這可能是因為在低酸性條件下酶活力不穩(wěn)定；當(dāng)pH值在7.0～8.0時，PPO活力隨著pH值的增加逐漸升高，可能是因為蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變，蛋白質(zhì)分子間的部分氫鍵被破壞，從而促使酶蛋白溶解，使酶活性增強；但當(dāng)pH值持續(xù)升高時，PPO活力慢慢降低，可能是因為堿性條件過強，使酶蛋白變性水解，使酶活力下降。因此，浸提液pH值選擇8.0較為合適。

圖3 浸提時間對PPO活力的影響

圖4 pH值對PPO活力的影響

2.3 南美白對蝦PPO活力響應(yīng)面試驗

根據(jù)單因素試驗確定的液料比為2∶1、pH值為8.0、浸提時間為3 h的結(jié)果，確定合適的因素和水平，采用Box-Benhenken Design設(shè)計響應(yīng)面試驗方案，17組響應(yīng)面試驗設(shè)計方案及結(jié)果見表2，采用Design Expert 8.0軟件對結(jié)果進行方差分析，結(jié)果見表3。

根據(jù)相應(yīng)的方案進行實驗，將相應(yīng)方案得到的17組數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合，得到以酶活力Y為目標(biāo)函數(shù)的二次回歸方程模型：

響應(yīng)面軟件方差分析結(jié)果（表3）顯示，一次項A的回歸系數(shù)差異顯著，說明液料比對提取的PPO活力差異顯著；一次項中B的回歸系數(shù)差異極顯著，說明pH值對提取的PPO活力的影響極顯著；一次項中C的回歸系數(shù)差異較為顯著，說明浸提時間對提取的PPO活力有較顯著影響；交互項中AB、AC的回歸系數(shù)顯著，說明液料比與pH值、液料比與浸提時間的交互項對PPO活力有顯著影響。從方差分析顯著性檢驗結(jié)果可以看出，該模型的回歸系數(shù)差異極顯著，失擬項系數(shù)不顯著，表明該方程對實驗有較好的擬合性。

運用響應(yīng)面設(shè)計軟件，參照回歸方程做出響應(yīng)面曲線，根據(jù)響應(yīng)面曲線的形狀，分析考察浸提溶液體系液料比、pH值、浸提處理時間對PPO活力的影響，結(jié)果見圖5。由圖5可知，液料比、浸提時間和pH值的交互作用都較顯著。運用軟件進行分析優(yōu)化，得到提取PPO的理論最優(yōu)工藝條件為液料比2.88∶1、pH值8.20、浸提時間3.39 h，該條件下PPO活力為90.7 A/（min·mL），提取PPO的回歸模型顯著性較好（R2=0.9762），擬合性也較好。考慮到實驗的實際可操作性，將上述提取參數(shù)修正為液料比2∶1、pH值8.0、浸提時間3 h。本實驗測得的南美白對蝦PPO活力比呂艷芳等［16］研究中測得的PPO活力〔47.18 A/（min·mL）〕提高了近1倍。

在修正方案的條件下對實驗結(jié)果進行驗證，做3組平行，提取的PPO活力為94.8 A/（min·mL），與預(yù)測值相比誤差為4.52%，兩者非常接近，表明該工藝穩(wěn)定可行，可用于預(yù)

測PPO的提取效果。

表2 響應(yīng)面設(shè)計方案及結(jié)果

表3 影響PPO活力的方差分析

圖5 液料比、pH值和浸提時間對PPO活力的影響

2.4 底物濃度與反應(yīng)速率的關(guān)系及酶促反應(yīng)動力學(xué)試驗

從圖6可以看出，底物濃度與PPO酶促反應(yīng)速率有著直接關(guān)系，當(dāng)?shù)孜餄舛葹?～10 mmol/L時，酶促反應(yīng)速率隨底物濃度增加基本呈直線上升的趨勢，符合酶動力學(xué)一級反應(yīng)曲線；當(dāng)?shù)孜餄舛冗_到10～16 mmol/L時，酶促反應(yīng)速率持續(xù)增加基本達到最大值，符合酶動力學(xué)混合級反應(yīng)曲線；當(dāng)反應(yīng)速率達到最大值時，底物濃度繼續(xù)增加，酶促反應(yīng)速率基本不再變化，符合酶動力學(xué)零級反應(yīng)曲線，說明酶蛋白已達到飽和狀態(tài)，再進一步增加底物也不能提高酶促反應(yīng)速率。由此可見，底物濃度與PPO酶促反應(yīng)速率關(guān)系基本遵循米氏方程的酶促動力學(xué)性質(zhì)。

2.5 米氏常數(shù)及最大反應(yīng)速率

經(jīng)響應(yīng)面試驗優(yōu)化PPO較優(yōu)提取工藝條件，在此條件下測定PPO的酶動力學(xué)常數(shù)，以雙倒數(shù)作圖法得到圖7，可知PPO的米氏常數(shù)Km為30.322 mmol/L，最大反應(yīng)速率Vmax為0.281 A/min，這與呂艷芳等［16］研究中測得的結(jié)果相比米氏常數(shù)較小、最大反應(yīng)速率較大，說明PPO和該底物之間的親和能力較強。

圖6 底物濃度與PPO反應(yīng)速率的關(guān)系

圖7 PPO的雙倒數(shù)圖

3 結(jié)語

目前研究表明PPO在蝦褐變中有較重要的催化作用，對其進行研究有助于揭示蝦褐變機理，并對蝦體黑變的控制提供理論指導(dǎo)。本試驗在單因素試驗基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面試驗對料液比、pH值和提取時間進行了優(yōu)化，結(jié)果表明，液料比、pH值、提取時間各因素及其二次項和交互作用對PPO的提取有顯著影響。綜合考慮實際操作各方面的因素，用磷酸鹽緩沖液提取南美白對蝦中PPO的較優(yōu)工藝條件為：液料比2∶1（mL/g），提取體系pH為8.0，浸提處理時間為3 h，此條件下提取的PPO活力為94.8 A/（min·mL）；本試驗以磷酸鹽緩沖液為提取液、L-DOPA為酶反應(yīng)底物、Brij-35為表面活性劑所測的PPO活力比Tris-HCl作為緩沖液、鄰苯二酚作為酶反應(yīng)底物提高了近1倍；米氏方程參數(shù)為Km30.322 mmol/L、Vmax0.281 A/min。這與呂艷芳等［16］研究結(jié)果相比，酶促最大反應(yīng)速率增大，米氏常數(shù)較小，說明PPO與L-DOPA的親和能力較強，結(jié)果可以為南美白對蝦褐變抑制和PPO性質(zhì)研究提供參考。試驗中未對酶活力的抑制劑及激活劑等進行研究，將在后續(xù)研究中開展相關(guān)研究，通過控制PPO活力抑制蝦體黑變，為防蝦黑變提供理論依據(jù)。

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（責(zé)任編輯 張輝玲）

Extraction and characteristics of polyphenol oxidase from white shrimp

DUAN Xiu-xia1，SHI Wen-zheng1，QIU Wei-qiang1，F(xiàn)ANG Bing1，WANG Zhi-he1，JIANG Min2
（1. College of Food Science and Technology，Shanghai Ocean University / Shanghai Engineering Research Center of Aquatic Product Processing and Preservation， Shanghai 201306，China；2. College of Fisheries and Life Science，Shanghai Ocean University，Shanghai 201306，China）

The optimization of extraction and biological characteristics of polyphenol oxidase （PPO） of white shrimp （Penaeus vannamei） were studied. The experimental factors and levels were determined by single factor experiments. Response surface methodology was used to explore the effects of solid-liquid ratio，pH and extraction time on PPO activity. The results showed that the optimal extraction conditions were as follows: the solid-liquid ratio was 2∶1，pH was 8.0 and the extraction time was 3.0 h. Under the optimal extractions，the PPO activity could reach 94.8 A/min·mL. Regressive model of extracted PPO was significant （P＜0.0001） and better fitting （R2=0.9762），it could be used to predict the PPO extraction. The kinetic equation of enzyme reaction was consistent with Michaelis Menten equation. The Kmwas 30.322 mmol/L and Vmaxwas about 0.281 A/min. Study on properties of PPO could provide theoretical guidance for white shrimp anti-melanosis technology.

white shrimp；polyphenol oxidase；response surface；kinetics

TS254

A

1004-874X（2017）03-0136-07

2016-11-08

國家“十二五”科技支撐計劃項目（2015BAD17B01）；上海市蝦類現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)項目（2014-5）；上海市高校知識服務(wù)平臺項目（ZF1206）

段秀霞（1990-），女，在讀碩士生，E-mail：1176914428@qq.com

施文正（1975-），男，博士，副教授，E-mail：wzshi@shou.edu.cn

段秀霞，施文正，邱偉強，等.南美白對蝦多酚氧化酶的提取及其性質(zhì)研究［J］.廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，44（3）：136-142.