段志芳，邵 玲，李新昌

（肇慶學院生命科學學院，廣東 肇慶 526061）

外源抗氧化劑硫脲基苯甲酰基硫脲衍生物的合成及促植物生長作用

段志芳，邵 玲，李新昌

（肇慶學院生命科學學院，廣東 肇慶 526061）

以苯甲酸、芳氨基硫脲或單縮二氨基硫脲為原料，合成得到5個取代硫脲基苯甲?；螂逖苌?，經(jīng)紅外、質(zhì)譜、核磁共振氫譜和元素分析確認了化合物的結(jié)構(gòu)。測定其清除超氧自由基（O2-·）、羥自由基（·OH）和2，2- 二苯基-1-苦味?；杂苫―PPH·）的活性及總還原能力，并與維生素C的活性進行比較。以水稻和黃瓜幼苗為試材，用生長測試法、超氧歧化酶（SOD）活性測定法以及過氧化物酶（POD）活性測定法研究這些化合物作為外源抗氧化劑對植物的生長調(diào)節(jié)作用。結(jié)果表明，在測定濃度下，這些化合物均具有清除自由基活性，并對水稻和黃瓜幼苗的生長發(fā)育有促進作用，且能激起SOD和POD的活力。

苯甲?；螂澹缓铣?；抗氧化；植物生長調(diào)節(jié)

植物受到逆境脅迫時，會產(chǎn)生過量自由基，從而引發(fā)或加劇膜脂過氧化作用，造成細胞膜系統(tǒng)的損傷，嚴重時會導致植物細胞死亡［1-2］。應用外源抗氧化劑能減少自由基對有機體的毒害，提高植物的抗氧化能力，增強其抗逆能力，從而保護細胞［3-4］，如周萬海等［5］發(fā)現(xiàn)外源水楊酸（salicylic acid，SA）能調(diào)控苜蓿幼苗抗氧化保護系統(tǒng)，緩解鹽脅迫對苜蓿植株的傷害。

硫脲類化合物和苯甲?；螂孱惢衔锞哂袣⒕?、殺蟲、除草和調(diào)節(jié)植物生長等生物活性［6-8］，在農(nóng)藥學方面具有潛在的應用價值，如肖彩琴等［9］發(fā)現(xiàn)含?；螂宀闋柾苌飳﹄p子葉油菜籽的生長具有調(diào)節(jié)作用。目前尚未見對這兩類化合物抗氧化能力的研究。

鑒于不同活性的基團聚集于同一分子中能明顯改善化合物的生物活性，本試驗采用亞結(jié)構(gòu)連接法，將硫脲和苯甲?；螂鍍煞N結(jié)構(gòu)結(jié)合在同一分子中，以期實現(xiàn)活性成分的優(yōu)化疊加，為新農(nóng)藥篩選提供先導化合物。以苯甲酸為起始原料，通過酰氯化、無溶劑條件下與硫氰酸銨反應得到相應的中間體苯甲?；惲蚯杷狨ィ唤?jīng)分離分別與芳氨基硫脲或單縮二氨基硫脲發(fā)生加成反應得到目標化合物，產(chǎn)物經(jīng)EtOH或DMF/EtOH重結(jié)晶，采用紅外、質(zhì)譜、核磁共振氫譜和元素分析對其進行結(jié)構(gòu)鑒定，通過測定清除超氧自由基（O2-·）、羥自由基（·OH）和DPPH·及總還原能力研究了它們的抗氧化活性，并以水稻和黃瓜幼苗為試材，測定它們對植物的生長調(diào)節(jié)作用，初步研究此類化合物抗氧化活性與調(diào)節(jié)植物生長作用之間的對應關(guān)系。合成化合物結(jié)構(gòu)見圖1。

圖 1 合成化合物的結(jié)構(gòu)

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑

X-4顯微熔點測定儀（北京，溫度計未校正）；日本島津UV-2550型紫外可見分光光度計；德國Bruker AVANCE AV 400 超導脈沖傅里葉變換核磁共振譜儀；德國Elementar varioEL cube型元素分析儀；美國Nicolet FT-IR 6700型紅外光譜儀（KBr壓片）；美國Thermo公司DSQ質(zhì)譜儀（EI）；上海HH·B11·420-BS恒溫培養(yǎng)箱。二氯亞砜重蒸后使用，其他試劑均為國產(chǎn)分析純試劑，直接使用。

1.2 目標化合物的合成

苯氨基硫脲、對甲苯氨基硫脲、對氯苯氨基硫脲參照文獻［10］制備；苯乙酮單縮二氨基硫脲、對氯苯甲醛單縮二氨基硫脲參照文獻［11］制備；苯甲酰氯參照文獻［12］制備。

將5 mmol苯甲酰氯、7.5 mmol硫氰酸銨和1滴PEG400置于玻璃研缽中，混和均勻，室溫研磨5 min后，加入4.5 mmol芳氨基硫脲或單縮二氨基硫脲，繼續(xù)研磨10 min，固體用蒸餾水洗滌多次，再用無水乙醇洗滌，晾干后用EtOH或DMF/ EtOH重結(jié)晶，得化合物1。

N-苯硫脲基-N′-苯甲?；螂澹?a）：白色固體粉末，產(chǎn)率28.71%，m.p.252～254℃；1H NMR（400MHz，DMSO-d6）δ：13.73（s，1H，PhNH），11.77（s，1H，CONHCS），10.76（s，1H，CSNH），10.38（s，1H，NHCS），6.95～8.11（m，10H，Ar-H）；IR（KBr）ν：3341、3211、3111（NH），3027，3004，1678（C=O），1604，1510，1447，1322，1223、1170（C=S），1087，746，695；EI-MS m/z （%）：330（M+，1.01），296（2.81），135（44.02），105（100），77（67.04），65（3.99），51（10.06）；Anal. calcd. for C15H14N4OS2：C 54.54，H 4.24，N 16.97；found C 54.31，H 4.19，N 16.85。

N-對甲苯硫脲基-N′-苯甲?；螂澹?b）：白色固體粉末，產(chǎn)率33.64%，m.p.247～249℃；1H NMR（400MHz，DMSO-d6）δ：13.71（s，1H，PhNH），11.75（s，1H，CONHCS），10.64（s，1H，CSNH），10.29（s，1H，NHCS），7.17～7.99（m，9H，Ar-H），2.29（s，3H，-CH3）；IR（KBr）ν：3209、3152（NH），3014，1671（C=O），1579，1528，1452，1212、1163（C=S），1092，842，717，695，670；EI-MS m/z （%）：344（M+，0.07），175（11.69），149（39.01），102（17.11），105（100），77（57.49），51（10.85）；Anal. calcd. for C16H16N4OS2：C 55.81，H 4.65，N 16.28；found C 55.67 ，H 4.49，N 16.15。

N-對氯苯硫脲基-N′-苯甲?；螂澹?c）：淡黃色固體粉末，產(chǎn)率36.10%，m.p.278～280℃；1H NMR（400MHz，DMSO-d6）δ：13.73（s，1H，PhNH），11.78（s，1H，CONHCS），10.86（s，1H，CSNH），10.46（s，1H，NHCS），7.39～7.99（m，9H，Ar-H）；IR（KBr）ν：3334、3199、3157、3093（NH），3066，3007，1669（C=O），1603，1526，1450，1210、1161（C=S），1089，838，716，694，667；EI-MS m/z （%）：364（M+，0.02），330（3.84），237（2.82），195（9.67），177（3.39），169（34.05），122（14.71），111（17.82），105（100），77（57.49），65（3.94），51（10.85）；Anal. calcd. for C15H13ClN4OS2：C 49.38，H 3.57，N 15.36；found C 49.88，H 3.55，N 15.54。

N-對氯苯甲醛縮氨基硫脲基-N′-苯甲酰基硫脲（1d）：白色固體粉末，產(chǎn)率68.55%，m.p.210～212℃；1H NMR（400MHz，DMSO-d6）δ：13.50（s，1H，NHC=S），12.35（s，1H，C=SNHC=O），11.95（s，1H， =NNH），11.07（s，1H，C=SNH），8.16（s，1H，CH=N），7.53～8.01（m，9H，Ar-H）；IR（KBr） ν：3251、3158（NH），3004，1679（C=O），1594、1518、1459（Ar），1234、1166（C=S），1087，830，711，670；EI-MS m/z （%）：391（M+，0.09），228（3.14），196（7.77），138（10.70），122（6.00），111（19.10），105（100），89（5.99），77（50.94），51（10.24）；Anal. calcd. for C16H14ClN5OS2：C 49.03，H 3.58，N 17.88；found C 49.29，H 3.43，N 17.96。

N-苯乙酮縮氨基硫脲基-N′-苯甲?；螂澹?e）：白色固體粉末，產(chǎn)率76.61%，m.p.198～200℃；1H NMR（400MHz，DMSO-d6）δ：13.90（d，J=8.0Hz，1H，NHC=S），11.99（s，1H，C=SNHC=O），11.40（s，1H，=NNH），11.26（d，J=7.8Hz，1H，C=SNH），7.45～8.02（m，10H，Ar-H），2.41（s，3H，CH3）；IR（KBr） ν：3433、3210、3084、3054（NH），3022，1668（C=O），1600、1520、1459（Ar），1234、1167（C=S），1087，850，713，691；EI-MS m/z （%）：371（M+，0.06），118（12.76），105（100），77（60.97），51（11.43）；Anal. calcd. for C17H17N5OS2：C 54.99，H 4.58，N 18.87；found C 55.08，H 4.32，N 18.73。

1.3 抗氧化活性試驗

新化合物抗氧化活性試驗參照文獻［13-14］進行，試樣濃度配制為1.0 mg/mL二甲亞砜溶液，其中羥自由基由Fe2+-H2O2-水楊酸體系產(chǎn)生，超氧自由基采用堿性條件下鄰苯三酚的自氧化產(chǎn)生，DPPH·自由基用無水乙醇配制使用，還原能力測定采用鐵氰化鉀還原法，并與常用抗氧化劑維生素C進行比較。

1.4 促植物生長試驗

取新化合物分別用少量二甲亞砜溶解，加入一滴乳化劑，用蒸餾水稀釋至10 ppm，空白對照用蒸餾水。對水稻和黃瓜幼苗的生長活性測試分別用生長測試法［15］、SOD活性測定法［16-17］以及POD活性測定法［18-19］，并與植物生長調(diào)節(jié)劑吲哚乙酸（IAA）進行比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 目標化合物的合成

將苯甲酰氯和硫氰酸銨在無溶劑條件下與催化劑PEG-400室溫研磨，然后加入芳氨基硫脲或單縮二氨基硫脲反應得到相應產(chǎn)物，反應過程中不使用有機溶劑，避免資源浪費和環(huán)境污染，具有操作簡單、反應條件溫和、環(huán)境友好等特點，為目標化合物的合成提供了一條綠色途徑。

2.2 目標化合物的譜圖分析

2.2.1 目標化合物的紅外譜圖分析 以化合物1c的紅外光譜為例，在3 066～3 334 cm-1處出現(xiàn)中等強度的吸收峰或強的寬峰，為 N-H伸縮振動特征吸收峰。在1 669 cm-1處出現(xiàn)的強吸收峰為C=O 的伸縮振動特征吸收峰。在3007 cm-1左右出現(xiàn)的吸收峰為苯環(huán)的 C-H 伸縮振動吸收峰，1 603、1 489、1 450 cm-1左右出現(xiàn)的峰為苯環(huán)骨架振動吸收峰。在 1581、1526 cm-1處出現(xiàn)的強、寬吸收峰為C-N 的伸縮振動和-NH-彎曲振動吸收峰，在1210、1161 cm-1處出現(xiàn)的中等強度吸收峰為 C＝S 的伸縮振動吸收峰，1265 cm-1處出現(xiàn)的強吸收峰為C-N-C 反對稱伸縮振動吸收峰，1090 cm-1處出現(xiàn)的中等強度吸收峰為C-N-C對稱伸縮振動吸收峰.

2.2.2 目標化合物的氫核磁共振譜圖分析 以化合物1c的核磁氫譜為例，可以看到4個N-H的共振吸收峰（單峰），與其化學環(huán)境相符合。O=CNHC=S中N-H中的氫原子處在-C=S-的正屏蔽區(qū)，化學位移比NHC=S位于高場。由于-NHCS-中的H原子易與分子中的羰基（C=O）上的氧原子形成六元環(huán)的分子內(nèi)氫鍵，產(chǎn)生較強的去屏蔽效應，使H原子電子云密度降低，其抗磁性屏蔽效應減小，從而導致核磁共振信號移向低場。

2.2.3 目標化合物的質(zhì)譜圖分析 以化合物1c的質(zhì)譜圖為例，該化合物的分子離子峰很弱，其他離子峰可以得到較好的解釋，其中質(zhì)荷比為330的離子峰形成的可能途徑見圖2。

圖2 質(zhì)荷比為330的離子峰形成的可能途徑

表1 化合物 1a～1e和維生素C在1.0 mg/mL濃度下抗氧化活性

2.3 目標化合物體外抗氧化活性

測定了新化合物清除超氧自由基（O2-·）、羥自由基（·OH）和2，2-二苯基-1-苦味酰基自由基（DPPH·）的活性及總還原能力，并同維生素C（Vc）抗氧化活性進行了比較。試驗過程中選用了多個濃度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)低濃度時，清除自由基效果較弱，高濃度時化合物在測定體系中的溶解度小，清除自由基效果也較弱，為便于比較，選用濃度為1.0 mg/mL時的試驗結(jié)果。從表1可以看出，這些化合物均具有清除自由基活性，其中N-對氯苯硫脲基-N′-苯甲?；螂澹?c）和N-對氯苯甲醛縮氨基硫脲基-N′-苯甲酰基硫脲（1d）清除超氧自由基（O2-·）、羥自由基（·OH）及總還原能力均較強，可以作為抗氧化劑使用，但其抗氧化活性弱于Vc。

2.4 目標化合物促植物生長活性

為測定新化合物對植物的生物活性作用，分別以水稻和黃瓜幼苗為試驗材料，用la～le 5個化合物所配制的溶液進行一個星期培養(yǎng)，然后用生長測試法、超氧歧化酶（SOD）活性測定法以及過氧化物酶（POD）活性測定法測定相應指標，結(jié)果如圖3～6所示。

圖3、圖4生長測試法結(jié)果表明，用5種目標化合物溶液培養(yǎng)的水稻和黃瓜幼苗的重量、株高以及根長明顯比蒸餾水培養(yǎng)的有所增加。由此可知，這5種新型的硫脲基苯甲?；螂寤衔飳λ竞忘S瓜幼苗的生長均有促進作用，其中化合物N-對氯苯硫脲基-N′-苯甲酰基硫脲（1c）和化合物N-對氯苯甲醛縮氨基硫脲基-N′-苯甲?；螂澹?d）對水稻幼苗的作用較為明顯，化合物N-對氯苯硫脲基-N′-苯甲酰基硫脲（1c）和化合物N-苯乙酮縮氨基硫脲基-N′-苯甲?；螂澹?e）對黃瓜幼苗的作用是較為明顯的。

根據(jù)圖5、圖6結(jié)果，用5種目標化合物溶液培養(yǎng)的水稻和黃瓜幼苗SOD、POD總活性均明顯提高。其中化合物N-對氯苯硫脲基-N′-苯甲?；螂澹?c）和化合物N-對氯苯甲醛縮氨基硫脲基-N′-苯甲酰基硫脲（1d）對水稻幼苗SOD、POD的增強作用較為明顯，化合物N-對氯苯硫脲基-N′-苯甲?；螂澹?c）和化合物N-苯乙酮縮氨基硫脲基-N′-苯甲?；螂澹?e）對黃瓜幼苗SOD、POD的增強作用較為明顯，且超過IAA（吲哚乙酸）的效果。

圖3 目標化合物對水稻幼苗根長、株高和重量的作用

圖5 目標化合物對水稻和黃瓜幼苗SOD活性的影響

圖6 目標化合物對水稻和黃瓜幼苗POD活性的影響

由以上試驗結(jié)果可以看出，5個新化合物對水稻和黃瓜幼苗的生長發(fā)育均有促進作用，且能增強幼苗體內(nèi)SOD和POD的活力，其中化合物N-對氯苯硫脲基-N′-苯甲酰基硫脲（1c）對水稻和黃瓜幼苗促生長活性作用均較為明顯。

3 結(jié)論與討論

植物生長調(diào)節(jié)劑是用于調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育的一類農(nóng)藥，使用合成的化學調(diào)節(jié)劑來控制植物生長已成為一種新的農(nóng)業(yè)技術(shù)，被廣泛應用于大田作物、經(jīng)濟作物、果樹、林木、蔬菜、花卉等各個方面，其研究及在生產(chǎn)上的應用是近代植物生理學及農(nóng)業(yè)科學的重大進展之一。此類物質(zhì)在研發(fā)過程中，因涉及到植物的生長過程，所需周期較長，存在不足之處。本論文首次研究苯甲?；螂孱愅庠纯寡趸瘎χ参锷硖匦缘挠绊懀跓o溶劑條件下由苯甲?；惲蚯杷狨ヅc芳氨基硫脲或單縮二氨基硫脲發(fā)生加成反應得到5個相應的硫脲基苯甲酰基硫脲衍生物，具有操作簡單、反應條件溫和和環(huán)境友好等特點，為此類型化合物提供了一條綠色合成途徑。經(jīng)紅外、質(zhì)譜、核磁共振氫譜和元素分析確認了新化合物的結(jié)構(gòu)。體外測定了這些新化合物清除超氧自由基（O2-·）、羥自由基（·OH）和DPPH·自由基的活性及還原能力。并采用生長測試法、SOD活性測定法以及POD活性測定法比較它們對水稻和黃瓜幼苗的促生長作用。結(jié)果表明，在測定濃度下，這些化合物均具有體外清除自由基活性，其中N-對氯苯硫脲基-N′-苯甲?；螂澹?c）和N-對氯苯甲醛縮氨基硫脲基-N′-苯甲?；螂澹?d）清除超氧自由基（O2-·）、羥自由基（·OH）及總還原能力均較強。這些化合物對水稻和黃瓜幼苗的生長均有促進作用，并能提高SOD和POD的活性，其中化合物N-對氯苯硫脲基-N′-苯甲?；螂鍖Χ咦饔镁^為明顯（1c）。結(jié)果表明，該類化合物體外抗氧化能力與促植物生長作用之間可能有一定相關(guān)性。該研究結(jié)果既提供了一種綠色合成方法，為設計與合成活性更高的?；螂寤衔锓肿犹峁├碚撘罁?jù)，又可以通過體外抗氧化試驗結(jié)果篩選出有效化合物，用于植物生長調(diào)節(jié)劑的開發(fā)，可以減輕試驗量，縮短農(nóng)藥開發(fā)周期。

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（責任編輯 白雪娜）

Synthesis of thiourea benzoylthiourea derivatives as exogenous antioxidants and their plant growth- promoting effects

DUAN Zhi-fang，SHAO Ling，LI Xin-chang
（College of Life Science，Zhaoqing University，Zhaoqing 526061，China）

Five thiourea benzoylthiourea derivatives were synthesized by using benzoic acid，arylthiosemicarbazide or thiosemicarbazones as raw materials. Their structures were characterized by UV，IR，1H-NMR and MS. Their scavenging effects on the superoxide radical（O2-·），hydroxyl radical（·OH） and DPPH· radical and their total reduction capacity were compared with ascorbic acid（Vc） as the reference material. As exogenous antioxidants，their promoting effects on plant growth of rice and cucumber were tested by the methods of growth test，superoxide dismutase（SOD） and peroxidase（POD） activity determination. The results showed that at the determinated concentration，these compounds all had scavenging effects on these radicals，and also could promote the growth of rice and cucumber，at the same time increase their SOD and POD activity.

benzoylthiourea； synthesis； antioxidant activity； plant growth regulator

S482.8

A

1004-874X（2017）03-0113-07

2016-12-29

廣東省科技計劃項目（2014A030304070）

段志芳（1973-），女，博士，副教授，E-mail：zhaoqing606@126.com

段志芳，邵玲，李新昌.外源抗氧化劑硫脲基苯甲?；螂逖苌锏暮铣杉按僦参锷L作用［J］.廣東農(nóng)業(yè)科學，2017，44（3）：113-119.