王 英 連亞軍△ 謝南昌 高延倫 金 迪

1)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院 鄭州 450052 2)河南平頂山第一人民院 平頂山 467000

線粒體Miro1蛋白對無鎂致癇海馬神經(jīng)元氧化應(yīng)激損傷的保護作用

王 英1)連亞軍1)△謝南昌1)高延倫2)金 迪1)

1)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院 鄭州 450052 2)河南平頂山第一人民院 平頂山 467000

目的 探討線粒體Miro1蛋白在體外顳葉癲癇模型中氧化應(yīng)激方面的保護作用及其機制。方法 原代培養(yǎng)新生24 h內(nèi)的SD大鼠海馬神經(jīng)元，通過無鎂細胞外液誘導(dǎo)體外癲癇模型。培養(yǎng)至14 d的海馬神經(jīng)元隨機分為對照組(CON)、無鎂誘導(dǎo)組(AE)、無鎂誘導(dǎo)+rAd轉(zhuǎn)染組(AE+rAdv)、無鎂誘導(dǎo)+rAd-Miro1轉(zhuǎn)染組(AE+rAd-Miro1)，CON組及AE組分別用正常細胞外液和無鎂細胞外液作用3 h后，更換為正常維持液，腺病毒轉(zhuǎn)染組于無鎂誘導(dǎo)48 h前轉(zhuǎn)染腺病毒,各組分別于造模后24 h終止細胞培養(yǎng)，采用Western blot法檢測細胞內(nèi)Miro1、ND6的表達，免疫熒光法檢測細胞內(nèi)ND6表達，比色法測定MDA、GSH的表達。結(jié)果 與CON組比較，AE組Miro1表達升高，ND6表達降低，MDA表達升高，GSH表達降低，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與AE組比較，AE+rAdv組Miro1表達升高，ND6表達降低，MDA表達升高，GSH表達降低，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；與AE組比較，AE+rAd-Miro1組Miro1、ND6表達升高，MDA表達降低，GSH表達升高，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論 線粒體蛋白Miro1對無鎂致癇海馬神經(jīng)元有保護作用，其機制可能與降低線粒體氧化應(yīng)激損傷,提高ND6、GSH蛋白表達，降低MDA蛋白表達有關(guān)。

Miro1；癲癇；線粒體移動；氧化應(yīng)激

癲癇是多種原因?qū)е碌哪X部神經(jīng)元高度同步化異常放電所致的臨床綜合征，長期、反復(fù)的癲癇發(fā)作嚴(yán)重降低患者的生活質(zhì)量，因而明確癲癇的發(fā)病機制及尋求新的治療靶點具有重要的現(xiàn)實意義。大量國內(nèi)外研究證實，癲癇過程中存在線粒體功能及結(jié)構(gòu)損傷[1-4]。線粒體移動可將受損線粒體逆行運動至胞體被降解和回收，同時將正常線粒體順向運動至神經(jīng)元的作用部位而發(fā)揮功能。正常的線粒體移動能夠保證細胞內(nèi)線粒體的正確分布，保證病理狀態(tài)下線粒體在細胞中占領(lǐng)正確的位置，以應(yīng)對病理損傷[5-8]。Miro1為線粒體銜接蛋白，在神經(jīng)細胞中通過免疫沉淀方法證實Miro1與Milton形成復(fù)合物并與Kinesin肌球重鏈(KHC)連接，調(diào)控線粒體沿微管的移動[9-10]。但到目前為止，線粒體移動異常在癲癇神經(jīng)元線粒體功能結(jié)構(gòu)受損中發(fā)揮何種作用，能否通過調(diào)控線粒體銜接蛋白Miro1進而調(diào)控線粒體移動而發(fā)揮神經(jīng)保護作用仍然未知。本研究利用體外培養(yǎng)海馬神經(jīng)元癲癇放電，構(gòu)建腺病毒真核表達質(zhì)粒干預(yù)Miro1表達，研究對線粒體氧化應(yīng)激損傷的影響，探討能否通過調(diào)控線粒體移動，減少線粒體氧化應(yīng)激損傷發(fā)揮癲癇神經(jīng)保護作用，為臨床癲癇的治療提供新靶點。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1 實驗動物：新生24 h以內(nèi)的SD大鼠，SPF級[鄭州大學(xué)動物實驗中心提供，許可證號SCxK(豫)2010-0002]。

1．1．2 主要試劑：Neurobasal Medium(Gibco)、DMEM/F-12(Gibco)、特級胎牛血清(Gibco)、PBS 液(HyClone)、牛胰島素(Sigma)、L-多聚賴氨酸(Sigma)、胰蛋白酶(Sigma)、B27(Gibco)、 Glutamax-I谷氨酰胺(Gibco)、青鏈霉素混合液(北京索萊寶)；RIPA裂解液(碧云天)；兔抗大鼠NSE多克隆抗體(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)；山羊抗兔 IgG/Cy3 熒光二抗 (北京博奧森生物技術(shù)有限公司)；Dylight594標(biāo)記山羊抗兔熒光二抗(中杉金橋)；Anti- Miro1 antibody 抗體(abcam)；Anti-ND6抗體(santa cruz)；重組腺病毒真核表達質(zhì)粒及對照腺病毒載體(吉凱基因公司)；丙二醛(MDA)測試盒(南京建成生物工程研究所)，谷胱甘肽(GSH)測試盒(南京建成生物工程研究所)。

1．2 方法

1．2．1 原代海馬神經(jīng)元的培養(yǎng)：新生24 h內(nèi)的SD大鼠，常規(guī)消毒，斷頭取腦，置于加有預(yù)冷 PBS的培養(yǎng)皿中，分離雙側(cè)海馬，剔除表面血管，并剪成約 1 mm×1 mm×1 mm的組織塊，轉(zhuǎn)移至15 mL的離心管中，加入0.125% 的胰酶后，置于 37 ℃ 恒溫箱中消化15 min，期間每隔5 min輕微振蕩數(shù)次，消化完畢后，加入PBS洗滌并終止消化，1 500 r/min 離心5 min，棄上清，加入等量PBS溶液洗滌兩遍后加入種植液，吹打均勻制成細胞懸液。取少量細胞懸液用于臺盼藍染色計數(shù)，調(diào)整細胞密度為 5×105/mL，接種于6孔培養(yǎng)板中(預(yù)先以0.01% L-多聚賴氨包被)，每孔約 2 mL。置于37.5 ℃恒溫，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，等量換成維持液繼續(xù)培養(yǎng)，以后每3 d半量換維持液1次，并于倒置相差顯微鏡下觀察細胞生長情況，培養(yǎng)至 14 d的海馬神經(jīng)元可用于后續(xù)實驗。

1．2．2 NSE染色鑒定海馬神經(jīng)元：海馬神經(jīng)元在放置有爬片的24孔板中生長至14 d后，進行NSE鑒定。吸棄培養(yǎng)基，PBS 漂洗1遍，然后用4%多聚甲醛固定20 min，PBS漂遍,每次5 min；0.25%Triton穿孔15 min，吸棄Triton,PBS漂洗3次，每次5 min；1% BSA 室溫下封閉 30 min，加入兔抗大鼠NSE 多克隆抗體(稀釋200 倍)4 ℃過夜，TBST漂洗3次，每次5 min，加入山羊抗兔 IgG/Cy3 熒光二抗，以下操作步驟均需避光進行，37 ℃作用1 h；TBST漂洗3次，每次 5 min，5 μg/mL DAPI 染色2 min，吸棄DAPI，TBST漂洗，抗熒光猝滅封片劑封片，放入濕盒避光保存，擇期在熒光顯微鏡下觀察。400倍熒光顯微鏡下隨機選擇10個視野，以視野中陽性神經(jīng)元數(shù)目占觀察細胞總數(shù)的百分率為神經(jīng)元純度。

1．2．3 造模分組：海馬神經(jīng)元培養(yǎng)至14 d，隨機分為對照組、無鎂誘導(dǎo)組、無鎂誘導(dǎo)+rAdv轉(zhuǎn)染組、無鎂誘導(dǎo)+rAd-Miro1轉(zhuǎn)染組,對照組用正常細胞外液培養(yǎng)3 h后，更換為正常維持液繼續(xù)培養(yǎng), 無鎂誘導(dǎo)組以無鎂細胞外液作用3 h后，更換為正常維持液，其中無鎂誘導(dǎo)+rAdv轉(zhuǎn)染組、無鎂誘導(dǎo)+rAd-Miro1轉(zhuǎn)染組于無鎂誘導(dǎo)48 h前分別轉(zhuǎn)染用維持液稀釋好后的不表達任何外源基因的對照腺病毒載體(rAdv)、表達大鼠Miro1基因的重組腺病毒真核表達質(zhì)粒(rAd-Miro1)并分別于造模后24 h終止細胞培養(yǎng)，用于后續(xù)試驗。

1．2．4 western blot 法檢測：Miro1、ND6蛋白表達變化 提取各組海馬神經(jīng)元蛋白，BCA法測蛋白濃度，調(diào)整上樣量，每個泳道保證總蛋白量相等。SDS-PAGE 凝膠電泳(上層膠80V30 min；下層膠120V60 min)，電泳結(jié)束后將膠上的蛋白質(zhì)條帶轉(zhuǎn)移到PVDF膜上(半干轉(zhuǎn))，5% 脫脂奶粉封閉3 h。一抗孵育，兔抗大鼠Miro1(1∶1 000)，兔抗大鼠ND6 (1∶200)，4 ℃ 冰箱過夜。TBST洗膜每次10 min，共3次，洗膜后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔 IgG(1∶5 000)，室溫搖床緩慢孵育1 h，ECL顯影成像重復(fù)3次。采用ImageJ測定條帶光密度，以目的蛋白與相應(yīng)內(nèi)參條帶光密度比值作為目的蛋白的相對表達量。

1．2．5 免疫熒光法檢測ND6蛋白表達變化：海馬神經(jīng)元在放置有爬片的24孔板中生長至14 d后，吸棄培養(yǎng)基，PBS漂洗3遍，然后用4%多聚甲醛固定15 min，PBS 漂洗 3 遍，每次3 min；0.5%Triton X-100(PBS配制 )室溫通透20 min，吸棄Triton，PBS浸洗玻片3次，每次3 min，吸水紙吸干PBS，在玻片上滴加正常胎牛血清，室溫封閉30 min；吸水紙吸掉封閉液，不洗，每張玻片滴加足夠量的稀釋好的Anti-ND6抗體，并放入濕盒，4 ℃孵育過夜。PBST 浸洗爬片3次，每次3 min，吸水紙吸干爬片上多余液體后滴加稀釋好的Dylight594標(biāo)記山羊抗兔熒光二抗，濕盒中20～37 ℃孵育1 h，PBST浸洗爬片3次，每次3 min(注意：從加熒光二抗起，后面所有操作步驟都盡量在較暗處進行)。滴加DAPI避光孵育5 min，對標(biāo)本進行染核，PBST 5 min×4次洗去多余的DAPI，用吸水紙吸干爬片上的液體，用含抗熒光淬滅劑的封片液封片，然后在熒光顯微鏡下觀察采集圖像。運用ImageProPlus(IPP)圖像處理分析軟件分析，以累積光密度IOD(integrated optical density)作為目的蛋白的相對表達量。

1．2．6 比色法測：MDA、GSH蛋白濃度 提取各組海馬神經(jīng)元蛋白，離心取上清液，分別于532 nm、420 nm處，1 cm光徑，蒸餾水調(diào)零比色測各管OD值，計算MDA、GSH蛋白濃度。

2 結(jié)果

2．1 原代大鼠海馬神經(jīng)元形態(tài)學(xué)特征 倒置差相顯微鏡下觀察到海馬神經(jīng)元培養(yǎng)至14 d時海馬神經(jīng)元體積變大，樹突及軸突清晰可見，細胞之間聯(lián)系緊密(見圖1)。

2．2 海馬神經(jīng)元純度測定 海馬神經(jīng)元培養(yǎng)至14 d，經(jīng)神經(jīng)元特異性烯醇化酶 NSE 染色鑒定，純度為90%以上(見圖2)。

圖1 倒置相差顯微鏡下觀察到體外培養(yǎng)7 d的海馬神經(jīng)元形態(tài) 圖2 培養(yǎng)至7 d的海馬神經(jīng)元NSE免疫熒光染色

2．3 WesternBlot檢測各組海馬神經(jīng)元中Miro1及ND6蛋白表達的變化

2．3．1 Western Blot檢測至癇后24 h細胞內(nèi)Miro1蛋白表達情況：與CON組比較，AE組、AE+rAdv組、AE+rAd-Miro1組大鼠海馬神經(jīng)元在致癇后24 h細胞內(nèi)Miro1表達升高，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與AE組比較，AE+rAdv組大鼠海馬神經(jīng)元在致癇后24 h細胞內(nèi)Miro1表達升高，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，AE+rAd-Miro1組大鼠海馬神經(jīng)元在致癇后24 h細胞內(nèi)Miro1表達升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖3。

2．3．2 Western Blot檢測至癇后24 h細胞內(nèi)ND6蛋白表達情況：與CON組比較，AE組、AE+rAdv組、AE+rAd-Miro1組大鼠海馬神經(jīng)元細胞內(nèi)ND6表達降低，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與AE組比較，AE+rAdv組大鼠海馬神經(jīng)元在至癇后24 h細胞內(nèi)ND6表達降低，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，AE+rAd-Miro1組大鼠海馬神經(jīng)元在至癇后24 h細胞內(nèi)ND6表達升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖3。

圖3 4組大鼠海馬神經(jīng)元中Miro1及ND6的表達情況

2．3．3 免疫熒光法檢測ND6蛋白表達變化：培養(yǎng)至14 d海馬神經(jīng)元進行免疫熒光染色，胞質(zhì)及樹突軸突呈紅色熒光，細胞核呈藍色熒光(見圖4)。運用ImageProPlus(IPP) 圖像處理分析軟件分析，以累積光密度IOD(integrated optical density)作為ND6蛋白的相對表達量，其結(jié)果與Western Blot檢測至癇后24 h細胞內(nèi)ND6蛋白表達情況一致。見表1。

圖4 培養(yǎng)至14 d各組海馬神經(jīng)元免疫熒光染色。A：CON組；B：AE組；C：AE+rAdv組；D：AE+ rAd-Miro1組

組別nND6相對表達量CON組51646976.38±142960.39AE組5364597.40±31805.07AE+rAdv組5286507.90±33900.71AE+rAdMiroshRNA組51065793.88±123058.66F值218.07P值<0.001

注：與CON組比較，*P<0.05；與AE組比較，#P>0.05，##P<0.05

2．3．4 比色法檢測各組海馬神經(jīng)元中MDA及GSH蛋白表達的變化：見表2。

表2 各組海馬神經(jīng)元中MDA及GSH蛋白表達的變化 (±s)

注：與CON組比較，*P<0.05；與AE組比較，#P>0.05，##P<0.05

3 討論

癲癇發(fā)作中腦部神經(jīng)元的高度同步化異常放電，引起呼吸鏈電子漏出活性氧(reactive oxygen species，ROS)產(chǎn)生增加，造成線粒體氧化應(yīng)激損傷，大量受損線粒體堆積，導(dǎo)致神經(jīng)元對癇性損傷更敏感，形成惡性循環(huán)[11]。Miro1突變會抑制線粒體運輸，導(dǎo)致線粒體聚集成簇，并形成絲狀線粒體[12]。線粒體移動、分布的改變會影響線粒體呼吸功能，且與多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病密切相關(guān)，因此，及時清除受損線粒體和維持線粒體正常功能至關(guān)重要。

前多種神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病的發(fā)病機制都涉及線粒體移動，如帕金森病(Parkinson's disease, PD)相關(guān)蛋白PINK1/Parkin通路可以作用于線粒體移動蛋白Miro，受損線粒體的不正常運輸是PD致病原因的可能性之一[13]。結(jié)合本實驗結(jié)果，無鎂致癇后海馬神經(jīng)元Miro1反應(yīng)性增高，表明Miro1蛋白介導(dǎo)的線粒體運輸參與海馬神經(jīng)元致癇過程。致癇過程氧化應(yīng)激產(chǎn)物增加，Miro1介導(dǎo)的線粒體運動在一定程度上保護了神經(jīng)元正常功能，但增加的ROS可導(dǎo)致mtDNA損傷和mtDNA缺失，引起局部線粒體功能受損，最終導(dǎo)致氧化反應(yīng)與抗氧化反應(yīng)失衡，神經(jīng)元氧化應(yīng)激損傷加重。轉(zhuǎn)染 rAd-Miro1病毒后海馬神經(jīng)元 Miro1蛋白表達顯著增加，致癇海馬神經(jīng)元氧化應(yīng)激損傷降低，進而說明Miro1對致癇海馬神經(jīng)元發(fā)揮保護作用。

ND6蛋白為線粒體呼吸鏈酶復(fù)合體Ⅰ亞基， ND6蛋白的損傷破壞NADH氧化，進一步增加自由基產(chǎn)生[14-15]。線粒體呼吸鏈酶復(fù)合體Ⅰ活性下降,導(dǎo)致呼吸耗氧量下降,從而引起線粒體呼吸功能的障礙。本研究表明，無鎂致癇后海馬神經(jīng)元ND6蛋白表達降低，其可能的原因是致癇過程產(chǎn)生的ROS損傷線粒體DNA，導(dǎo)致其編碼的ND6蛋白產(chǎn)生減少，ROS也可對線粒體復(fù)合體亞基造成直接損傷，導(dǎo)致ND6蛋白表達減少。提高miro1表達后，致癇海馬神經(jīng)元中ND6表達升高，表明Miro1介導(dǎo)的線粒體移動對維持線粒體正常功能，發(fā)揮致癇神經(jīng)元的保護作用至關(guān)重要。

線粒體是活性氧ROS產(chǎn)生的主要場所，又是 ROS 作用最敏感的部位。ROS 通過氧化線粒體心磷脂、線粒體DNA 和線粒體重要的蛋白質(zhì)對線粒體造成氧化損傷[16]。MDA 是脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的產(chǎn)物，其含量可反映脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的程度，并間接反映引起脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的自由基水平。GSH是一種抗氧化劑，清除細胞內(nèi)氧自由基，抗脂質(zhì)氧化，保護細胞膜的完整性。結(jié)合本實驗，無鎂致癇后海馬神元中MDA表達升高，GSH表達降低，線粒體產(chǎn)生氧化應(yīng)激損傷。轉(zhuǎn)染 rAd-Miro1病毒后，MDA蛋白表達降低，GSH蛋白表達升高。表明提高Miro1表達后，致癇海馬神經(jīng)元脂質(zhì)過氧化物減少，抗氧化物水平增高，氧化應(yīng)激損傷減輕。線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅰ和Ⅲ負責(zé)產(chǎn)生O2-，本實驗中致癇海馬神經(jīng)元線粒體復(fù)合體Ⅰ亞基ND6蛋白受損，產(chǎn)生氧自由基增多可能是加重氧化應(yīng)激損傷的原因。提高Miro1表達后線粒體功能障礙減輕，表明Miro1介導(dǎo)的線粒體移動可能通過保護線粒體呼吸鏈復(fù)合體功能，減少脂質(zhì)過氧化物生成，增加抗氧化物酶類水平發(fā)揮神經(jīng)保護作用。但此研究僅通過測定神經(jīng)元細胞中Miro1的表達變化來推測其保

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(收稿2017-03-11)

國家自然科學(xué)基金(52110754)

R-332

A

1673-5110(2017)09-0039-05

△通訊作者：連亞軍，E-mail:lianyajun369@sina.com