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        人腦挫裂傷早期HMGB1的表達(dá)變化特征

        2017-06-07 10:30:20賈利云姚安會李經(jīng)綸王本瀚
        關(guān)鍵詞:小鼠

        賈利云 姚安會 李經(jīng)綸 劉 偉 王本瀚△

        1)新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院 新鄉(xiāng) 453000 2)解放軍第153中心醫(yī)院神經(jīng)外科 鄭州 450042 3)鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 鄭州 450001

        人腦挫裂傷早期HMGB1的表達(dá)變化特征

        1,2)賈利云3)姚安會2)李經(jīng)綸2)劉 偉2)王本瀚2)△

        1)新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院 新鄉(xiāng) 453000 2)解放軍第153中心醫(yī)院神經(jīng)外科 鄭州 450042 3)鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 鄭州 450001

        目的 探討人腦挫裂傷早期HMGB1表達(dá)的變化特征。方法 收集人腦挫裂傷后不同時間點(diǎn)挫裂傷組織的標(biāo)本(正常組、6 h、12 h、24 h、72 h),4%多聚甲醛固定,冰凍切片,然后進(jìn)行免疫熒光染色,統(tǒng)計(jì)分析各時間點(diǎn)HMGB1的表達(dá)情況;同時將HMGB1與神經(jīng)元標(biāo)志物NeuN進(jìn)行共標(biāo),觀察人腦挫裂傷后早期神經(jīng)元損傷過程中從核內(nèi)向胞漿內(nèi)轉(zhuǎn)移的情況。結(jié)果 正常人腦組織的HMGB1表達(dá)主要集中在細(xì)胞核內(nèi),與正常組相比較,人腦挫裂傷組在傷后HMGB1陽性細(xì)胞數(shù)于12 h開始下降(P<0.05),并持續(xù)至72 h;而HMGB1從核內(nèi)轉(zhuǎn)移至胞漿內(nèi)的數(shù)目從6 h即開始增加(P<0.05),隨時間增加HMGB1也隨之大量轉(zhuǎn)移到胞漿中,在人腦挫裂傷后24 h 達(dá)到高峰(P<0.05)。人腦挫裂傷后早期,HMGB1主要表達(dá)在神經(jīng)元中(P>0.05),腦挫裂傷后神經(jīng)元的數(shù)目逐漸減少(P<0.05),而HMGB1從神經(jīng)元核內(nèi)轉(zhuǎn)移至胞漿的比例在6 h明顯增加(P<0.05),于24~72 h達(dá)到高峰(P<0.05)。結(jié)論 人腦挫裂傷后早期神經(jīng)元死亡或凋亡數(shù)目明顯增加,HMGB1陽性細(xì)胞數(shù)也在損傷后減少;而HMGB1神經(jīng)元從核內(nèi)轉(zhuǎn)移至胞漿的比例升高;HMGB1可能參與了腦挫裂傷后神經(jīng)元的死亡或凋亡。

        顱腦損傷;HMGB1;神經(jīng)元

        隨著現(xiàn)代化的進(jìn)程,交通及建筑業(yè)的發(fā)展,顱腦損傷的發(fā)生率越來越高,創(chuàng)傷性顱腦損傷(traumatic brain injury,TBI)是世界各地衛(wèi)生保健系統(tǒng)亟待解決的重大難題,已成為威脅人們健康的主要原因之一[1-2]。高遷移率組蛋白1(high-mobility group box 1,HMGB1)為19世紀(jì)70年代發(fā)現(xiàn)的一種在細(xì)胞核內(nèi)廣泛存在、序列高度保守的非組蛋白[3]。HMGB1最初只作為一種核內(nèi)蛋白研究其在細(xì)胞核內(nèi)的功能,包括參與核小體的構(gòu)建與功能、DNA的重組修復(fù)和復(fù)制、基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控等[4]。Wang等[5]首先發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞受到內(nèi)毒素等刺激后可以釋放HMGB1到細(xì)胞外,并作為一種炎癥介質(zhì)參與炎癥反應(yīng)的發(fā)生發(fā)展過程。釋放到胞外的HMGB1不僅可以參與各種炎癥性疾病,而且在腫瘤、病毒性疾病、創(chuàng)傷、再灌注損傷等的病理過程中也起著重要作用。HMGB1可以由壞死細(xì)胞的被動釋放或炎癥細(xì)胞(如巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞)的主動釋放[6]。研究發(fā)現(xiàn),TBI 后HMGB1 由壞死和損傷的神經(jīng)細(xì)胞釋放。釋放的HMGB1與細(xì)胞膜表面受體,如RAGE、Toll樣受體等模式識別受體結(jié)合,進(jìn)而激活免疫細(xì)胞釋放多種炎癥介質(zhì),一方面介導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡;另一方面,通過多種復(fù)雜的病理生理機(jī)制,對腦組織造成二次損傷,形成惡性循環(huán)[7-8]。以往關(guān)于HMGB1在腦挫裂傷后的研究多基于動物實(shí)驗(yàn),而且多集中在腦挫裂傷后炎癥反應(yīng)的形成機(jī)制方面。對人腦挫裂傷后早期HMGB1的表達(dá)變化,尤其是損傷后早期神經(jīng)元內(nèi)表達(dá)特點(diǎn)的研究甚少。為此,我們通過收集人腦挫裂傷后不同時間點(diǎn)手術(shù)標(biāo)本,分析人腦挫裂傷早期HMGB1的表達(dá)情況。

        1 資料和方法

        1.1 一般資料 納入標(biāo)準(zhǔn):經(jīng)顱腦CT 證實(shí)為腦挫裂傷,年齡30~60 歲且需手術(shù)治療的患者40 例。排除年齡較大或較小、存在其他器官復(fù)合傷患者8 例,32例患者納入實(shí)驗(yàn)樣本,其中男25例,女7例,年齡30~40 歲,平均31.34歲,標(biāo)本均為挫裂傷腦組織中心約3 cm 范圍內(nèi)的腦組織;正常腦組織5例(腦腫瘤手術(shù)暴露過程中行額極或顳極切除的腦組織),腦挫裂傷6 h組6例,腦挫裂傷12 h組8例,腦挫裂傷24 h組8例,腦挫裂傷72 h組5例。實(shí)驗(yàn)經(jīng)解放軍153醫(yī)院倫理委員會認(rèn)證通過,且均征得患者家屬同意,并簽署知情同意書。

        1.2 組織制備 將標(biāo)本取出后,用4%多聚甲醛(pH=7.4,4 ℃)固定。然后置于含25%蔗糖的0.1 mol/L PB溶液中,4 ℃保存,直至標(biāo)本沉底。用恒冷箱切片機(jī)(Leica,CM1900)行連續(xù)矢狀切片,片厚16 μm,-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

        1.3 主要試劑與儀器 一抗:兔抗人HMGB1單克隆抗體(Abcam,美國);小鼠抗人NeuN單克隆抗體(Millipore,美國);小鼠抗人GFAP單克隆抗體(Millipore,美國);山羊抗人Iba-1單克隆抗體(Abcam,美國);二抗:山羊抗兔FITC(中杉金橋,中國);山羊抗鼠TRITC(中杉金橋,中國);驢抗山羊CY3(Beyotime,中國);驢抗兔Alexa Fluor 488(Molecular Probes,美國);DAPI(Solarbio,中國);熒光顯微鏡:Olympus BX51。

        1.4 免疫熒光染色 HMGB1與DAPI共標(biāo):取一套切片入無triton含1%胎牛血清的封閉液室溫封閉30 min,然后用0.01%的PBS(pH 7.4)浸洗3次,每次5 min。加入兔抗人HMGB1(1:200,Abcam)孵育,室溫過夜(16~24 h),0.01%的PBS清洗3次,每次5 min,然后加入相應(yīng)含有FITC標(biāo)記的山羊抗兔IgG(1:200)的二抗及DAPI(1:1 000)。37 ℃室溫避光2 h。之后用0.01%的PBS清洗后以50%甘油溶液封片;顯微鏡觀察并照片。HMGB1與神經(jīng)元標(biāo)記物NeuN或星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物GFAP或小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物Iba-1進(jìn)行雙標(biāo):取一套切片分A、B、C3組,入無triton含1%胎牛血清的封閉液室溫封閉30 min,然后用0.01%的PBS(pH 7.4)浸洗3次,5 min/次。A組加入兔抗人HMGB1(1:200,Abcam)和小鼠抗人NeuN(1:50,Millipore)孵育;B組加入兔抗人HMGB1(1:200,Abcam)和小鼠抗人GFAP(1:200,Millipore)孵育;C組加入兔抗人HMGB1(1:200,Abcam)和山羊抗人Iba-1(1:200,Abcam)孵育。室溫過夜(16~24 h),0.01%的PBS清洗3次,5 min/次,然后A組加入相應(yīng)含有FITC標(biāo)記的山羊抗兔IgG(1:200)及含有TRITC標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG(1:200)的二抗及DAPI(1: 1 000);B組加入相應(yīng)含有FITC標(biāo)記的山羊抗兔IgG(1:200)及含有TRITC標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG (1:200)的二抗及DAPI(1:1 000);C組加入相應(yīng)含有Alexa Fluor 488標(biāo)記的驢抗兔IgG(1:200)及含有CY3標(biāo)記的驢抗山羊IgG(1:200)的二抗及DAPI(1:1 000)。37 ℃室溫避光2 h。用0.01%的PBS清洗后以50%甘油溶液封片,并用熒光顯微鏡BX-51觀察,隨即選取4個視野進(jìn)行照相。

        1.5 結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn) 表達(dá)HMGB1的細(xì)胞:HMGB1與細(xì)胞標(biāo)記物NeuN、GFAP或Iba-1及細(xì)胞核標(biāo)記物DAPI三者共標(biāo)的細(xì)胞;從細(xì)胞核轉(zhuǎn)移至細(xì)胞漿的陽性細(xì)胞數(shù):HMGB1同時存在于核內(nèi)及胞漿內(nèi)的細(xì)胞數(shù)。選擇每張切片免疫反應(yīng)較強(qiáng)的區(qū)域,視野(×200)下觀察4個不重復(fù)視野,計(jì)數(shù)HMGB1染色細(xì)胞。計(jì)算表達(dá)在胞核中的HMGB1的細(xì)胞數(shù)、胞漿中的HMGB1細(xì)胞數(shù)、胞核胞漿共同表達(dá)HMGB1的細(xì)胞數(shù)。

        2 結(jié)果

        2.1 人腦挫裂傷后早期HMGB1的表達(dá) 通過對不同時間點(diǎn)腦挫裂傷組織進(jìn)行HMGB1與DAPI共標(biāo)染色,結(jié)果發(fā)現(xiàn),與正常組比較,HMGB1陽性的細(xì)胞數(shù)于人腦挫裂傷后12 h開始下降(P<0.05),并持續(xù)下降至72 h(P<0.05);而HMGB1從細(xì)胞核內(nèi)向胞漿轉(zhuǎn)移的比例在人腦挫裂傷后6 h 明顯增加(P<0.05),并逐漸升高,于人腦挫裂傷后24 h達(dá)到高峰(P<0.05),于72 h表達(dá)有所下降(P<0.05)。見圖1。

        2.2 人腦挫裂傷后早期HMGB1的表達(dá)主要在神經(jīng)元 于各時間點(diǎn),進(jìn)行HMGB1與神經(jīng)元標(biāo)記物NeuN或星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物GFAP或小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物Iba-1免疫熒光染色;對表達(dá)HMGB1的神經(jīng)元數(shù)目與總HMGB1陽性細(xì)胞數(shù)進(jìn)行比較,結(jié)果發(fā)現(xiàn),人腦挫裂傷早期HMGB1主要表達(dá)在神經(jīng)元,各組間無明顯差異(P>0.05)。見圖2。

        圖1 人腦挫裂傷后HMGB1陽性細(xì)胞數(shù)及轉(zhuǎn)移至胞漿內(nèi)比例(免疫熒光染色,×200) 1A、1B、1C:正常組;2A、2B、2C:腦挫裂傷6 h;3A、3B、3C:腦挫裂傷12 h;4A、4B、4C:腦挫裂傷24 h;5A、5B、5C:腦挫裂傷72 h(A、B、C分別為DAPI、HMGB1、Merge;注:HMGB1染為綠色,DAPI染為藍(lán)色);6A:HMGB1陽性細(xì)胞數(shù)統(tǒng)計(jì)圖,與正常組比較,*P<0.05;6B:HMGB1轉(zhuǎn)移至胞漿陽性細(xì)胞比例統(tǒng)計(jì)圖,與正常組比較,*P<0.05,與前一組比較,#P<0.05

        圖2 人腦挫裂傷后HMGB1表達(dá)的細(xì)胞分布(免疫熒光染色,×200) A為人腦挫裂傷后24 h NeuN與HMGB1共標(biāo)(HMGB1染為綠色,NeuN染為紅色);B為人腦挫裂傷后24 h GFAP與HMGB1共標(biāo)(HMGB1染為綠色,GFAP染為紅色);C為人腦挫裂傷后24 h Iba-1與HMGB1共標(biāo)(HMGB1染為綠色,Iba-1染為紅色);D人腦挫裂傷后不同時間點(diǎn)神經(jīng)元表達(dá)HMGB1的比例

        2.3 HMGB1在神經(jīng)元表達(dá)的特點(diǎn) 將人腦挫裂傷后早期不同時間點(diǎn)的組織切片進(jìn)行HMGB1、NeuN及DAPI的免疫熒光染色,結(jié)果發(fā)現(xiàn),人腦挫裂傷后神經(jīng)元的數(shù)目逐漸減少(P<0.05);而HMGB1從神經(jīng)元核內(nèi)向胞漿轉(zhuǎn)移的比例在傷后6 h明顯增加(P<0.05),并逐漸升高,于人腦挫裂傷后24~72 h達(dá)到高峰(P<0.05)。見圖3。

        圖3 人腦挫裂傷后不同時間點(diǎn)HMGB1神經(jīng)元表達(dá)情況(免疫熒光染色,×200) 1A、1B、1C:正常組;2A、2B、2C:腦挫裂傷后6 h;3A、3B、3C:腦挫裂傷12 h;4A、4B、4C:腦挫裂傷24 h;5A、5B、5C:腦挫裂傷72 h(A為HMGB1與DAPI共標(biāo),B為NeuN與DAPI共標(biāo),C為三者M(jìn)erge共標(biāo);注:HMGB1染為綠色;NeuN染為紅色;DAPI染為藍(lán)色);箭頭所示:HMGB1轉(zhuǎn)移至胞漿外,神經(jīng)元與其共標(biāo)。6A:神經(jīng)元HMGB1陽性統(tǒng)計(jì)圖,與正常組比較,*P<0.05;6B:神經(jīng)元陽性細(xì)胞中HMGB1轉(zhuǎn)移至胞漿比例統(tǒng)計(jì)圖,與正常組比較,*P<0.05,與前一組比較,#P<0.05

        3 討論

        HMGB1是一個普遍存在且高度保守的蛋白,在細(xì)胞內(nèi),HMGB1能與DNA結(jié)合,通過調(diào)節(jié)染色質(zhì)架構(gòu)發(fā)揮調(diào)控翻譯,修復(fù)和重組的作用[9-10]。最近研究表明、HMGB1可以被氧化而發(fā)揮多種作用,包括亞細(xì)胞定位、調(diào)控DNA、細(xì)胞因子、調(diào)控免疫等多種作用[4]。雖然HMGB1主要存在細(xì)胞內(nèi),但在細(xì)胞受到刺激、細(xì)胞死亡、凋亡,組織缺氧及缺血/再灌注時,HMGB1可以被釋放到胞漿及細(xì)胞外[9]。早期大量研究表明,TBI可引起細(xì)胞壞死、凋亡、炎癥反應(yīng)等多種病理生理變化[11]。Wang等通過小鼠實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),HMGB1參與了蛛網(wǎng)膜下腔出血導(dǎo)致的神經(jīng)元死亡。鄧必高等[12]研究發(fā)現(xiàn),異丙酚可以影響大鼠內(nèi)毒素腦損傷后的HMGB1表達(dá)。黃海英等[13]研究表明,通過臍帶血檢測HMGB1可以對在妊娠高血壓產(chǎn)婦的新生兒腦損傷程度進(jìn)行判斷。我們的研究發(fā)現(xiàn),HMGB1在人腦挫裂傷后早期從核內(nèi)轉(zhuǎn)移至胞漿的比例逐漸增高,于傷后24 h達(dá)到高峰。Gao等[14]研究發(fā)現(xiàn),HMGB1在小鼠腦挫裂傷后6 h表達(dá)明顯下降,而在2 d后其表達(dá)恢復(fù)至正常水平。而我們的研究同樣發(fā)現(xiàn),HMGB1在人腦挫裂傷后6 h表達(dá)開始下降,然而其下降一直維持至72 h。同時,我們發(fā)現(xiàn),人腦挫裂傷后早期HMGB1主要表達(dá)在神經(jīng)元,且隨著損傷時間的延長,神經(jīng)元的數(shù)目在明顯下降,而HMGB1從細(xì)胞核轉(zhuǎn)移至胞漿的比例卻明顯增高。HMGB1作為致炎因子在顱腦損傷后的病理變化中起重要作用,顱腦損傷后,細(xì)胞水腫、缺氧、炎癥反應(yīng)、壞死、凋亡等多種病理變化均可促使HMGB1的轉(zhuǎn)移及釋放,而釋放的HMGB1又可以參與到顱腦損傷的繼發(fā)性損傷中[14-15]。我們推測HMGB1參與了人腦挫裂傷后早期神經(jīng)元的凋亡或死亡,其具體機(jī)制仍需進(jìn)一步深入研究。

        [1] Helmick KM,Spells CA,Malik SZ,et al.Traumatic brain injury in the US military:epidemiology and key clinical and research programs[J].Brain Imaging Behav,2015,9(3):358-366.

        [2] Voss JD,Connolly J,Schwab KA,et al.Upda-te on the Epidemiology of Concussion/Mild Traumatic Brain Injury[J].Curr Pain Heada-che Rep,2015,19(7):32.

        [3] Read CM,Cary PD,Crane-Robinson C,et al.Solution structure of a DNA-binding domain from HMG1[J].Nucleic Acids Res,1993,21(15):3 427-3 436.

        [4] Gougeon ML,Melki MT,Saidi H.HMGB1,an alarmin promoting HIV dissemination and latency in dendritic cells[J].Cell Death Differ,2012,19(1):96-106.

        [5] Wang H,Bloom O,Zhang M,et al.HMG-1 as a late mediator of endotoxin lethality in mice[J].Science,1999,285(5 425):248-251.

        [6] Scaffidi P,Misteli T,Bianchi ME.Release of chromatin protein HMGB1 by necrotic cells triggers inflammation[J].Nature,2002,418(6 894):191-195.

        [7] Okuma Y,Liu K,Wake H,et al.Glycyrrhizin inhibits traumatic brain injury by reducing HMGB1-RAGE interaction[J].Neuropharmacology,2014,85:18-26.

        [8] Stahel PF.Expression of HMGB1 and RAGE in rat and human brains after traumatic brain injury[J].J Trauma Acute Care Surg,2012,73(3):782-783.

        [9] Harris HE,Andersson U,Pisetsky DS.HMGB1:a multifunctional alarmin driving autoimmune and inflammatory disease[J].Nat Rev Rheumatol,2012, 8(4):195-202.

        [10] Ueda T,Yoshida M.HMGB proteins and transcriptionalregulation[J].Biochim Biophys Acta,2010,1 799(1/2): 114-118.

        [11] Park E,Bell JD,Baker AJ.Traumatic brain injury:can the consequences be stopped?[J].CMAJ,2008,178(9): 1 163-1 170.

        [12] 鄧必高,但伶,李煒,等.異丙酚對大鼠內(nèi)毒素腦損傷蛋白質(zhì)絡(luò)氨酸激酶和高遷移率族蛋白B-1表達(dá)的影響[J].中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志,2014,24(29):29-33.

        [13] 黃海英,陳尚明,劉永華,等.NSE和HMGB1在妊娠高血壓病產(chǎn)婦的新生兒腦損傷中的診斷價值[J].江蘇醫(yī)藥,2016,42(1):44-46.

        [14] Gao TL,Yuan XT,Yang D,et al.Expression of HMGB1 and RAGE in rat and human brains after traumatic brain injury[J].J Trauma Acute Care Surg,2012,72(3):643-649.

        [15] Zou JY,Crews FT.Release of neuronal HMGB1 by ethanol through decreased HDAC activity activates brain neuroimmune signaling[J].PLoS One,2014,9(2):e87 915.

        (收稿2016-12-27)

        The features of HMGB1 expression in early traumatic brain injury

        LiuLeizhen*,JiaLiyun,YaoAnhui,LiJinglun,LiuWei,WangBenhan

        *XinxiangMedicalCollege,Xinxiang453000,China

        Objective To explore the features of high-mobility group box 1(HMGB1)expression in early traumatic brain injury(TBI).Methods We collected traumatic brain tissues induced by traumatic brain injury at different time point(6 h,6 h,12 h,24 h and 72 h)and normal brain tissues which were fixed by 4% paraformaldehyde.After performing frozen section and using immunofluorescent staining,we statistically analyzed the expression of HMGB1.At the same time,we observed the transferring situation from cell nucleus to cytoplasm in the process of early traumatic brain injury by marking HMGB1 and neuronal specific marker(NeuN).Results HMGB1 expression of normal brain tissues was concentrated in nucleus.The number of HMGB1 positive cells in traumatic brain tissues was decreased at 12 h(P<0.05),which lasted to 72 h.The number of HMGB1 transferring from cell nucleus to cytoplasm was increased at 6 h(P<0.05)and reach the peak at 24 h after traumatic brain injury(P<0.05),which showed that with the prolonged time,the more number of HMGB1 transferred to cytoplasm.In early traumatic brain injury,HMGB1 mainly expressed in neurons(P>0.05)which were decreased gradually(P<0.05).We also found the number of HMGB1 transferring from nucleus to cytoplasm was significantly increased at 6 h(P<0.05),and peaked at 24~72 h(P<0.05).Conclusion The number of neurons’ death or apoptosis was decreased after TBI in human,and number of HMGB1 positive cells was also decreased.The ratio of HMGB1 transferring from nucleus into cytoplasm was significantly increased.HMGB1 may participate in the neurons’ death or apoptosis.

        Traumatic brain injury;High mobility group box 1;Neuron

        全軍青年基金項(xiàng)目(14QNP029)

        R-332

        A

        1673-5110(2017)09-0017-05

        △通訊作者:王本瀚,E-mail:wangbenhan@sina.com

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