胡建鋒++尹松梅++謝雙鋒++聶大年++李益清

[摘要]目的 探討丙戊酸（VPA）對耐三尖杉酯堿的HL-60細(xì)胞（HL-60/HT）耐藥性的影響。方法 選擇遞增壓力培養(yǎng)法建立HL-60/HT細(xì)胞株。分為三組，Ara-C組、VPA組、VPA+Ara-C組，采用MTT法測定使用各組藥物后敏感細(xì)胞、耐藥細(xì)胞增殖情況的變化，同時測定丙戊酸對HL-60/HT細(xì)胞耐藥性的改變，用流式細(xì)胞儀檢測敏感的HL-60細(xì)胞及HL-60/HT細(xì)胞的細(xì)胞周期。結(jié)果 丙戊酸與Ara-C合用可明顯抑制HL-60、HL-60/HT細(xì)胞生長，抑制率高于丙戊酸或Ara-C單獨(dú)的作用（q=1.37、1.51）。結(jié)論 丙戊酸能夠抑制HL-60、HL-60/HT細(xì)胞生長，可與Ara-C發(fā)揮協(xié)同作用，降低白血病細(xì)胞的耐藥性。

[關(guān)鍵詞]丙戊酸；HL-60/HT細(xì)胞；白血病

[中圖分類號] R733.7 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1674-4721（2017）04（c）-0067-03

[Abstract]Objective To explore the impact of Valproic Acid （VPA） on drug resistance of HL-60 cells（HL-60/HT） resistant harringtonine.Methods HL-60/HT cell strain was established by incremental pressure culture and divided into 3 groups：Ara-C group，VPA group and VPA+Ara-C group.MTT method was used to determine the change of proliferation of sensitive cells and drug resistant cells after using drug.The change of VPA resistance in HL-60/HT cells was determinated simultaneously.The cell cycle of seneitive HL-60 cells and HL-60/HT cells were detected by flow cytometry.Results VPA in combination with Ara-C can obviously inhibit the growth of HL-60 and HL-60/HT cell，and the inhibition rate was higher than that of VPA or Ara-C alone （q=1.37，1.51）.Conclusion VPA can inhibit the growth of HL-60 and HL-60/HT cell.It can play a synergistic role with Ara-C and reduce the drug resistance of leukemia cells.

[Key words]Valproic acid；HL-60/HT cell；Leukemia

白血病的主要治療方法是聯(lián)合化療，據(jù)統(tǒng)計(jì)60%～70%的患者經(jīng)聯(lián)合化療后癥狀緩解，但短期內(nèi)易復(fù)發(fā)，主要原因是白血病細(xì)胞固有或獲得的多藥耐藥性[1-6]。本研究旨在探討VPA對耐三尖杉酯堿（HT）的HL-60細(xì)胞（HL-60/HT細(xì)胞）耐藥性的影響。

1材料與方法

1.1 試劑與材料

RPMI1640培養(yǎng)基（LM-R1641/500）、二甲基亞砜（DMSO）（20161020 AR）購自博升生物公司；四氮唑藍(lán)（MTT）（B00718301）、VPA（B 2016110402）為貝斯特試劑公司產(chǎn)品；胎牛血清（13011-8611）購自杭州四季青公司；淋巴細(xì)胞分離液（E501064-0001）、D-Hank液（160922-1）購自上海生工生物工程公司；HT（20161006002）、Ara-C（20161120001）為Pharmacia & Upjohn公司產(chǎn)品；RNA酶（160910-2）、碘化丙啶（PI）（161104-1）購自上海華聯(lián)制藥有限公司。HL-60細(xì)胞自中山大學(xué)藥學(xué)院引進(jìn)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及耐藥株的建立

HL-60細(xì)胞接種于 RPMI1640 完全培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，每2 天換液1次，細(xì)胞4～5 d傳代1次。

采用極限稀釋法篩選耐藥的細(xì)胞克隆，具體方法為：取處于對數(shù)增長期的HL-60細(xì)胞，用遞增壓力選擇培養(yǎng)法建立HL-60/HT耐藥細(xì)胞株。開始時HT的濃度為0.005 μg/ml，培養(yǎng)2 d后換液并洗去藥物，無藥物環(huán)境中培養(yǎng)2 d。以此濃度培養(yǎng)3次后，將藥物濃度改為0.01 μg/ml，并逐漸加大HT濃度。5個多月后，培養(yǎng)出HL-60/HT耐藥細(xì)胞，采用MTT法檢測細(xì)胞對藥物的半數(shù)抑制濃度（IC50），確認(rèn)耐藥細(xì)胞。

1.3 對耐藥細(xì)胞和敏感細(xì)胞增殖抑制率的檢測

設(shè)Ara-C作用HL-60細(xì)胞組和HL-60/HT細(xì)胞組、VPA作用HL-60細(xì)胞組和HL-60/HT細(xì)胞組、VPA+Ara-C作用HL-60細(xì)胞組和HL-60/HT細(xì)胞組，分別用MTT法分別測定Ara-C組、VPA組、VPA+Ara-C組對HL-60/HT細(xì)胞和HL-60細(xì)胞的增殖抑制率。將重懸細(xì)胞濃度調(diào)整為1×105/ml，以每孔200 μl接種于96孔平板，置37℃、5%CO2環(huán)境中孵育24 h。然后向每孔中加Ara-C或VPA或VPA+Ara-C。兩種細(xì)胞均設(shè)置無細(xì)胞培養(yǎng)液組和無藥對照組。48 h后加入20 μl MTT（終濃度為5 g/L），繼續(xù)孵育4 h，去除培養(yǎng)液，加DMSO 150 μl，振蕩10 min混勻，以無細(xì)胞培養(yǎng)液組調(diào)零，用酶標(biāo)儀分別測定595 nm和492 nm處的吸光度值（A值）。不同條件下每次均設(shè)8個平行孔，重復(fù)3次。細(xì)胞生長抑制率=（無藥對照組A值均值-實(shí)驗(yàn)組A值均值）/無藥對照組A值均值×100%。用直線回歸法計(jì)算各種藥物的IC50。