申文熹，陳 功,2，唐 垚，汪冬冬，王 勇，伍亞龍，張紅梅，張 偉，朱 翔，李 恒,2，張其圣,2,*

不同鹽質量分數(shù)泡白菜發(fā)酵過程中乳酸菌群落結構的變化

申文熹1，陳 功1,2，唐 垚1，汪冬冬1，王 勇1，伍亞龍1，張紅梅1，張 偉1，朱 翔1，李 恒1,2，張其圣1,2,*

（1.四川東坡中國泡菜產業(yè)技術研究院，四川 眉山 620000；2.四川省食品發(fā)酵工業(yè) 研究設計院，四川 溫江 611130）

設計3 種不同鹽質量分數(shù)的泡白菜，包括低鹽（2%）、中鹽（5%）、高鹽（8%），利用可培養(yǎng)方法結合多種分子生物學手段研究其發(fā)酵過程中乳酸菌的群落結構。結果表明：鹽質量分數(shù)越低，乳酸菌增長速率越快。本研究從3 種不同鹽質量分數(shù)泡白菜發(fā)酵過程中分離篩選得到了563 株乳酸菌，并采 用16S rDNA測序、多重聚合酶鏈式反應、聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態(tài)性、API 50CH等多種不同的鑒定方法進行鑒 定，鑒定結果表明這563 株乳酸菌屬于5 個屬11 個種。結果表明，低鹽泡白菜發(fā)酵前期的優(yōu)勢菌為Lactococcus lactis、Lactobacillus pentosus和Leuconostoc，發(fā)酵后期則由Lactobacillus pentosus主導；中高鹽泡白菜發(fā)酵前期由Lactobacillus pentosus和Weissella主導，發(fā)酵后期主要由Lactobacillus pentosus完成。

泡白菜；鹽質量分數(shù)；乳酸菌；群落結構

中國泡菜歷史悠久，傳承千年，是我國典型的傳統(tǒng)發(fā)酵食品。泡菜以新鮮蔬菜為原料，在不同濃度食鹽水中泡漬，利用蔬菜表面自帶的微生物厭氧或兼性厭氧發(fā)酵而成[1]。我國泡菜種類繁多，不同類型泡菜的用鹽量差異很大，但因保藏的需要，泡菜的食鹽濃度一般較高，因此長期食用泡菜可能會導致人體食鹽攝入量增高。據(jù)統(tǒng)計，我國人均食鹽量攝入遠高于世界衛(wèi)生組織推薦的標準（5 g/d）[2]，而攝入食鹽過量，則可能會增加人體患心血管、高血壓等疾病的風險[3]。因此低鹽化泡菜越來越受到人們的青睞。然而眾所周知，食鹽作為泡菜的基本原料之一，不僅是賦予泡菜滋味的重要物質，而且還會直接影響泡菜發(fā)酵過程中微生物的群落結構；同時，也與泡菜微生物間的消長、底物消耗及代謝產物等有關，繼而直接或間接地影響泡菜的風味和品質[1]。

大量研究表明乳酸菌主導泡菜發(fā)酵[4]，研究泡菜發(fā)酵過程中乳酸菌的數(shù)量變化以及群落構成，有利于揭示泡菜發(fā)酵規(guī)律，發(fā)現(xiàn)潛在的有益微生物，是控制泡菜發(fā)酵品質和安全性的重要基礎工作。鹽度對泡菜發(fā)酵過程中乳酸菌的生長具有重要的影響，低鹽條件下乳酸菌快速生長繁殖，而高鹽條件對乳酸菌的生長有所抑制[1]，不同類型的乳酸菌其耐鹽性也不同，已有相關研究表明我國泡菜主要優(yōu)勢菌屬包括Leuconostoc、Lactobacillus等，而這些優(yōu)勢乳酸菌的耐鹽性具有較大差異，甚至同種不同株之間也有明顯差異[5-7]，這種耐鹽性的差異可能是導致發(fā)酵食品在發(fā)酵過程中的細菌群落結構差異的最直接原因，也可能是導致發(fā)酵品質差異的最主要影響因素之一[8-9]。

目前針對鹽度對泡菜發(fā)酵過程中乳酸菌群落結構的影響還少見報道。本研究模擬傳統(tǒng)泡白菜發(fā)酵，分別研究低鹽、中鹽和高鹽泡菜發(fā)酵過程中乳酸菌群落結構，采用可培養(yǎng)方法分離鑒定泡菜發(fā)酵過程中的乳酸菌，結合聚合酶鏈式反應-限制性片段長度多態(tài)性（polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP）、PCR[10-12]和API 50CH鑒定系統(tǒng)等多種方法對乳酸菌進行鑒定，對過去采用傳統(tǒng)16S rDNA[13-15]方法不易于區(qū)分的泡菜常見微生物菌種進行區(qū)分。本研究將為深入了解和控制泡菜發(fā)酵過程、并制備低鹽高活性的健康泡菜產品提供理論參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與菌株

卷心白菜、食鹽購自眉山當?shù)厥袌觥?/p>

模式菌株Lactobacillus pentosus（1.2437）、Lactobacillus plantarum（1.2439）、Leuconostoc pseudomesenteroides（1.2503）、Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides（1.2138），購自中國普通微生物菌種保藏管理中心。

1.2 培養(yǎng)基與試劑

MRS液體培養(yǎng)基：蛋白胨10.0 g、牛肉粉5.0 g、酵母粉4.0 g、葡萄糖20.0 g、吐溫-80 1.0 mL、磷酸氫二鉀2.0 g、乙酸鈉5.0 g、檸檬酸三銨2.0 g、硫酸鎂0.2 g、硫酸錳0.05 g、蒸餾水1 000 mL，pH 6.2，121 ℃滅菌15 min；MRS固體培養(yǎng)基：在MRS液體培養(yǎng)基中加入瓊脂粉15.0 g、納他霉素0.1 g。

Bacterial DNA Isolation Kit、2×PCR Mix（Foregene Taq DNA聚合酶、dNTPs、Tris-HCl、KCl、MgCl2、膠回收試劑盒 成都福際生物技術公司；PCR引物（表1）成都擎科梓熙生物技術有限公司；無水乙醇 成都市科龍化工有限公司；瓊脂糖、Tasl酶 北京索萊寶科技有限公司。

表 1 PCR引物表Table 1 List of PCR primers

1.3 儀器與設備

手動單道移液器、DW-86W100超低溫冰箱、TGL-20BR臺式冷凍離心機、T960梯度PCR熱循環(huán)儀、IY04S-3E型凝膠成像分析系統(tǒng) 成都一科儀器設備有限公司；DHP-9080B恒溫培養(yǎng)箱、SW-CJ-1FD超凈工作臺、YM75Z75L不銹鋼立式壓力蒸汽滅菌器、DYCP-31DN瓊脂糖水平電泳儀、HH-4恒溫水浴鍋 成都智誠科靈儀器儀表有限責任公司；QL-901旋渦混合器 海門市其林貝爾儀器制造有限公司。

1.4 方法

1.4.1 泡白菜制作方法及取樣

純凈水燒開冷卻，將泡菜壇和新鮮卷心白菜清洗干凈，卷心白菜切好備用，稱取1 500 g切好的卷心白菜放入泡菜壇中，加入備好的純凈水1 500 mL，按平衡后低鹽（NaCl質量分數(shù)2%，下同）、中鹽（5%）、高鹽（8%）泡制，25 ℃恒溫發(fā)酵。分別于0、1、3、5、7 d和10 d取泡菜發(fā)酵液進行分析，取樣時先將泡菜輕輕搖勻，取周邊4 個點和中間2 個樣進行混合。

1.4.2 pH值與總酸含量的測定

采用pH計測定泡菜發(fā)酵液的pH值，總酸含量采用酸堿滴定法，總酸含量以乳酸計。

1.4.3 乳酸菌活菌計數(shù)

采用微量移液器吸取1 mL發(fā)酵液至9 mL含0.85%NaCl的無菌生理鹽水中，梯度稀釋；選取3 個適宜稀釋度，吸取0.1 mL的稀釋液加入MRS平板中，涂布棒均勻涂布平板，每個稀釋度3 個平行；37 ℃培養(yǎng)48 h后選取菌落數(shù)在30～300之間的平板記錄菌落數(shù)。

1.4.4 乳酸菌分離與鑒定

1.4.4.1 乳酸菌分離純化與保存

按菌落形態(tài)差異（形態(tài)、顏色、大小、凸起度、干濕度、透明度、邊緣）挑選菌落于MRS平板上劃線（三區(qū)劃線），并記錄該菌株與平板上的相似菌株數(shù)量；將菌株反復純化3～4 次后，進行革蘭氏染色與接觸酶實驗，篩選出革蘭氏陽性、接觸酶陰性的無芽孢純培養(yǎng)物；將篩選出的菌株于MRS液體培養(yǎng)基中置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱里活化18～24 h，與甘油溶液1∶1（V/V）的比例添加到甘油管中（甘油最終體積分數(shù)20%），并于－80 ℃超低溫冰箱中保存。

1.4.4.2 乳酸菌16S rDNA測序

采用試劑盒提取乳酸菌DNA，－20 ℃保存?zhèn)溆?。PCR體系（50 μL）：2×PCR Mix 25 μL、模板DNA 1.5 μL、引物27F（10 μmol/L）和1492R（10 μmol/L）各2 μL，加雙重蒸餾水補充至50 μL。反應條件：95 ℃預熱10 min；93 ℃變性30 s，65 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，循環(huán)10 個周期；接著93 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，循環(huán)10 個周期；然后，93 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，循環(huán)10 個周期；最后72 ℃復延伸5 min。PCR擴增產物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，目標條帶為1 500 bp左右。將符合16S rDNA片段大?。? 500 bp左右）的PCR擴增產物送成都擎科梓熙生物技術有限公司測序，測序結果利用BLAST軟件在GenBank數(shù)據(jù)庫中進行比對，下載相似度較高的模式菌株序列，用MEGA 5.05軟件中的Neighbor-Joining法進行1 000 次步長計算構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.4.4.3 多重PCR

以提取的乳酸菌總D N A為模板，使用引物paraF、pentF、planF和pREV進行多重PCR擴增。PCR體系（50 μL）：引物paraF、pentF和pREV終濃度0.25 μmol/L，planF終濃度0.12 μmol/L，DNA模板3 μL，2×PCR Mix 25 μL，加雙重蒸餾水補充至50 μL。反應條件：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30 個循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min。將PCR產物于2%瓊脂糖凝膠上電泳，凝膠成像系統(tǒng)拍照。目標條帶為318 、218 bp或107 bp左右。采用膠回收試劑盒對目標條帶進行回收，純化后的PCR產物采用2%瓊脂糖電泳檢測，凝膠成像系統(tǒng)拍照，根據(jù)電泳條帶判別：植物乳酸菌318 bp、戊糖乳桿菌218 bp、類植物乳桿菌107 bp。 1.4.4.4 乳桿菌鑒定

API 50CH試劑條用于鑒定區(qū)分乳桿菌。

1.4.4.5 PCR-RFLR鑒定

用于區(qū)分Leuconostoc mesenteroides和Leuconostoc pseudomesenteroides，使用引物LeuF、LeuR進行PCR擴增。PCR體系：引物各2.5 μL（10 μmol/L），2×PCR Mix 25 μL，總DNA 1.5 μL，加雙重蒸餾水補充至50 μL。反應條件：94 ℃預熱5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30 個循環(huán)；72 ℃復延伸7 min。PCR擴增產物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，目標條帶為976 bp左右。

RFLR采用Tasl酶進行酶切反應。酶切反應體系：PCR產物10 μL，10×Buffer B 2 μL，Tasl酶2 μL，ddH2O 18 μL。反應條件：65 ℃水浴2 h。產物采用2%瓊脂糖電泳檢測，凝膠成像系統(tǒng)拍照。

2 結果與分析

2.1 不同鹽質量分數(shù)泡白菜發(fā)酵過程中pH值和總酸變化規(guī)律

圖 1 不同鹽質量分數(shù)泡白菜發(fā)酵過程中pH值和總酸變化Fig. 1 Dynamic changes in pH and acidity during Paocai fermentation with different salt concentrations

發(fā)酵過程中pH值是微生物在特定的環(huán)境下代謝活動的綜合指標，是一項重要的發(fā)酵參數(shù)，它對微生物的生長和代謝產物的形成有重要的影響[3]。一般將泡菜總酸積累達到0.4～0.8 g/100 mL時，即認為泡菜成熟，風味最佳，可食用。不同鹽質量分數(shù)泡白菜發(fā)酵過程中pH值和總酸變化規(guī)律如圖1所示。泡白菜發(fā)酵10 d的過程中，低鹽與高鹽相比，pH值下降速率更快，總酸上升速率也更快，且含量更高。若以總酸0.4 g/100 mL認定為泡白菜成熟，則低鹽（2%）、中鹽（5%）、高鹽（8%）泡白菜成熟期分別為3、5、7 d。這種現(xiàn)象可能是由于食鹽溶液具有較高的滲透壓，能抑制一些有害微生物的活動，但乳酸菌在此種狀態(tài)下也會受到一定程度的抑制[14]，鹽質量分數(shù)越高，這種抑制作用越大，從而導致鹽質量分數(shù)較高的泡白菜發(fā)酵速率緩慢，總酸較低鹽質量分數(shù)泡白菜低。

2.2 不同鹽質量分數(shù)泡白菜發(fā)酵過程中乳酸菌數(shù)量變化

圖 2 不同鹽質量分數(shù)泡白菜發(fā)酵過程中乳酸菌的菌體濃度變化Fig. 2 Dynamic changes in of lactic acid bacteria counts during Paocai fermentation with different salt concentrations

泡菜發(fā)酵由乳酸菌主導，乳酸菌菌體濃度和種類對泡菜的成熟期與風味物質 的形成有重要影響。不同鹽質量分數(shù)泡白菜發(fā)酵過程中乳酸菌數(shù)量的變化規(guī)律如圖2所示。乳酸菌呈先上升后略有下降趨于平穩(wěn)的趨勢；低鹽（2%）泡白菜乳酸菌從第0天開始迅速增多，在第3天達到最大值（7.88±0.04）（lg（CFU/mL）），逐漸趨于平穩(wěn)；中高鹽（5%、8%）泡白菜在0～1 d處于延滯期，其后開始快速增殖；5%鹽質量分數(shù)泡白菜在第3天達到最大值（7.67±0.04）（lg（CFU/mL）），8%鹽質量分數(shù)泡白菜在第7天達到最大值（7.26±0.06）（lg（CFU/mL））；泡白菜發(fā)酵過程中，鹽質量分數(shù)越低，乳酸菌的生長速率越快，尤其在第1天，2%鹽質量分數(shù)泡白菜乳酸菌菌體濃度與5%、8%鹽質量分數(shù)具有極顯著差異（P＜0.01），這可能是由于高鹽高滲透壓環(huán)境對乳酸菌的存活率有一定抑制作用。熊濤等[1]的研究也顯示了相似的規(guī)律。

2.3 不同鹽質量分數(shù)泡白菜發(fā)酵過程中乳酸菌的分離鑒定

本研究從不同鹽質量分數(shù)、不同發(fā)酵階段泡白菜樣品中共分離到563 株革蘭氏陽性，接觸酶陰性和無芽孢的乳酸菌；采用16S rDNA測序方法進行初步鑒定，測序結果通過BLAST軟件在NCBI數(shù)據(jù)庫中比對，下載同源性高的模式菌株，使用軟件Mega5.05構建系統(tǒng)發(fā)育樹。Devereux等[16]認為當16S rDNA的序列同源性不低于97%時可以認為是同一屬，同源性不低于98%時則可以認為是同一個種。如圖3所示，563 株乳酸菌被鑒定為5 個屬，分別是明串珠菌屬（Leuconostoc）、乳球菌屬（Lactococcus）、魏斯氏菌屬（Weissella）、乳桿菌屬（Lactobacillus）和腸球菌屬（Enterococcus）。其中1R2等菌株與乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）的幾個亞種的模式菌株序列同源性高于99%，故認定為Lactococcus lactis；腸球菌屬中分離鑒定出2 個種，其中0R14鑒定為Enterococcus gallinarym，3R9鑒定為海氏腸球菌（Enterococcus hirae）；乳桿菌屬中7R11等2 株乳酸菌鑒定為短乳桿菌（Lactobacillus brevis）；魏斯氏菌屬中1S2R2等菌株被鑒定為食竇魏斯氏菌（Weissella cibaria），5R13等菌株鑒定為赫倫魏斯氏菌（Weissella hellenica），5R9等菌株鑒定為類腸膜魏斯氏菌（Weissella paramesenteroides）；3R2等菌株鑒定為檸檬明串珠菌（Leuconostoc citreum）。

圖 3 不同鹽質量分數(shù)泡白菜中乳酸菌系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 3 Phylogenetic tree for lactic acid bacteria isolated from Paocai prepared with different salt concentrations

圖 4 多重PCR瓊脂糖凝膠電泳圖Fig. 4 Agarose gel electrophoresis of multiplex PCR products

從系統(tǒng)發(fā)育樹中可以發(fā)現(xiàn)，7R8等菌株與戊糖乳桿菌（Lactobacillus pentosus）、植物乳桿菌（Lactobacillus p l a n t a r u m）和類植物乳桿菌（L a c t o b a c i l l u s paraplantarum）模式菌株的序列同源性均很高，16S rDNA測序方法無法鑒定到種。因此，本實驗采用多重PCR方法將其區(qū)分開，即使用引物paraF、pentF、planF和pREV進行多 重PCR擴增[10-11]。瓊脂糖凝膠電泳檢測結果如圖4所示，泳道1為模式菌株Lactobacillus plantarum CGMCC 1.2439，PCR目標產物長度為318 bp；而泳道2為模式菌株Lactobacillus pentosus CGMCC 1.2437，PCR目標產物長度218 bp；泳道3～7為待測菌株，目標產物長度均為218 bp，因而可以將這幾株菌鑒定為Lactobacillus pentosus。本研究進一步采用API 50CH糖發(fā)酵實驗對上述結果進行驗證，并得到了同樣的結果。

圖 5 PCR-RFLR瓊脂糖凝膠電泳圖Fig. 5 Agarose gel electrophoresis for PCR-RFLR analysis

通過16S rDNA序列比對和構建系統(tǒng)發(fā)育樹發(fā)現(xiàn) ，5R2、3R18等菌株與腸膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides），假腸膜明串珠菌（Leuconostoc pseudomesenteroides）區(qū)分不開，因此，本實驗采用PCRRFLR[12]方法將其鑒定到種。實驗結果如圖5所示，泳道1為模式菌株Leuconostoc pseudomesenteroides CGMCC 1.2503，泳道2為模式菌株CGMCC 1.2138，泳道3～5為待鑒定樣品，其條帶與泳道2一致，故將其鑒定為Leuconostoc mesenteroides。

2.4 不同鹽質量分數(shù)泡白菜發(fā)酵過程中乳酸菌群落結構的變化

不同鹽質量分數(shù)泡白菜發(fā)酵過程中乳酸菌菌群的相對豐度如圖6所示，發(fā)酵前期乳酸菌種類較豐富，隨著發(fā)酵的進行，后期乳酸菌種類減少，發(fā)酵7 d以后僅存在Lactobacillus；本實驗結果表明，鹽質量分數(shù)對泡白菜發(fā)酵過程中的乳酸菌群落結構有顯著影響，鹽質量分數(shù)低的泡白菜中，乳酸菌菌群多樣性與高鹽度泡白菜相比較為豐富；Lactobacillus pentosus作為優(yōu)勢菌，出現(xiàn)在3 種不同鹽質量分數(shù)泡白菜發(fā)酵的各個階段（0～10 d）；此外，Lactococcus lactis、Leuconostoc、Weissella等均出現(xiàn)在發(fā)酵前期階段，而后期階段主要由Lactobacillus主導，其中Lactobacillus pentosus相對豐度較高。2%鹽質量分數(shù)泡白菜分離鑒定出5 個屬，即8 種乳酸菌，分別為Lactobacillus pentosus、Lactobacillus plantarum、Lactococcus lactis、Leuconostoc mesenteroides、Leuconostoc citreum、Weissella paramesenteroides、Weissella cibaria、E. gallinarym；5%鹽質量分數(shù)泡白菜也分離到5 個屬的乳酸菌：Lactobacillus pentosus、Lactobacillus plantarum、Lactococcus lactis、Leuconostoc citreum、Weissella hellenica、Weissella paramesenteroides、Weissella cibaria、Lactobacillus brevis、Enterococcus hirae；而8%鹽質量分數(shù)的泡白菜僅分離到2 個屬的5 種乳酸菌，分別為Lactobacillus pentosus、Weissella hellenica、Weissella paramesenteroides、Weissella cibaria、Lactobacillus brevis。

圖 6 不同鹽質量分數(shù)泡白菜發(fā)酵液樣品中分離的乳酸菌群落構成Fig. 6 Abundance of lactic acid bacteria isolated from Paocai prepared with different salt concentrations

2.5 不同鹽質量分數(shù)泡白菜發(fā)酵過程中優(yōu)勢乳酸菌的數(shù)量變化

不同鹽質量分數(shù)對泡白菜發(fā)酵過程中乳酸菌的種類和數(shù)量有很大影響，將乳酸菌鑒定結果根據(jù)相似菌株數(shù)進行溯源，分析鹽質量分數(shù)對泡白菜發(fā)酵過程中優(yōu)勢乳酸菌數(shù)量變化的影響（圖7）。在2%鹽質量分數(shù)泡白菜發(fā)酵過程中，占優(yōu)勢的乳酸菌主要有4 類，由圖7A可知，Lactobacillus pentosus變化趨勢與乳酸菌總數(shù)的變化趨勢相近。發(fā)酵0～1 d，由Lactobacillus pentosus、Leuconostoc和Lactococcus lactis主導，且Lactococcus lactis菌落總數(shù)上升速率最快，在發(fā)酵1 d時數(shù)量達到最大，但在1 d后菌落總數(shù)迅速下降。在發(fā)酵1～5 d時，優(yōu)勢乳酸菌有Lactobacillus和Leuconostoc，其中Lactobacillus pentosus占主導，而Leuconostoc在發(fā)酵5 d后消失。在發(fā)酵5～10 d，僅存在Lactobacillus pentosus和Lactobacillus plantarum，而Lactobacillus pentosus的菌落總數(shù)始終比Lactobacillus plantarum高一個數(shù)量級。在5%（圖7B）和8%（圖7C）鹽質量分數(shù)泡菜發(fā)酵過程中的優(yōu)勢乳酸菌有兩類，均為Lactobacillus pentosus和Weissella，而Weissella在發(fā)酵5 d之后消失；5%鹽質量分數(shù)泡菜發(fā)酵0～1 d時，Weissella菌落總數(shù)略高于Lactobacillus pentosus，而發(fā)酵1 d以后由Lactobacillus pentosus占主導；當8%鹽質量分數(shù)泡菜發(fā)酵0～3 d時，Weissella菌落總數(shù)達到最高，之后的發(fā)酵過程由Lactobacillus pentosus主導。本實驗表明，2%鹽質量分數(shù)泡白菜的前期發(fā)酵主要由Lactococcus lactis、Lactobacillus pentosus和Leuconostoc啟動并完成，發(fā)酵后期由Lactobacillus pentosus主導；而5%和8%鹽質量分數(shù)泡白菜發(fā)酵前期由Lactobacillus pentosus和Weissella共同主導，發(fā)酵后期則主要由Lactobacillus pentosus完成。

圖 7 不同鹽質量分數(shù)泡白菜發(fā)酵過程中優(yōu)勢乳酸菌的數(shù)量變化Fig. 7 Microbial counts of dominant lactic acid bacteria isolated from Paocai prepared with different salt concentrations

3 結 論

本研究通過解析低鹽（2%）、中鹽（5%）、高鹽（8%）3 種不同鹽質量分數(shù)條件下發(fā)酵的泡白菜中乳酸菌的群落結構，采用多種分子生物學和生化鑒定手段（16S rDNA測序、多重PCR、PCR-RFLR、API鑒定系統(tǒng)）將乳酸菌鑒定至種水平。本研究結果表明，食鹽用量對泡白菜自然發(fā)酵過程中乳酸菌的數(shù)量以及菌群結構都具有較顯著的影響。鹽質量分數(shù)低的泡白菜，其發(fā)酵過程中乳酸菌快速啟動發(fā)酵，菌落總數(shù)迅速增長，表現(xiàn)出更快的總酸積累以及pH值下降。若以總酸含量0.4%認定為泡白菜成熟，則低鹽（2%）、中鹽（5%）、高鹽（8%）泡白菜成熟期分別為3、5、7 d，說明食鹽對乳酸菌的存活率有一定抑制作用。鹽質量分數(shù)低的泡白菜中，乳酸菌的種類也比高鹽發(fā)酵泡白菜中的乳酸菌更為豐富，2%、5%鹽質量分數(shù)泡白菜分 離到5 個屬的乳酸菌，而8%鹽質量分數(shù)泡白菜僅分離到2 個屬的乳酸菌。菌株Lactococcuslactis和Leuconostoc未能在高鹽（8%）泡白菜中分離到，可能與菌株的耐鹽性有關。低鹽泡白菜由Lactococcus lactis、Lactobacillus pentosus和Leuconostoc啟動 發(fā)酵，發(fā)酵后期由Lactobacillus pentosus主導；中高鹽泡白菜由Lactobacillus pentosus和Weissella啟動發(fā)酵 ，發(fā)酵后期則由Lactobacillus pentosus主導。

[1] 熊濤, 李軍波, 彭飛, 等. 鹽濃度對傳統(tǒng)自然發(fā)酵圓白菜的菌系結構和代謝的影響[J]. 食品科學, 2015, 36(11): 172-176. DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201511033.

[2] DU S, BATIS C, WANG H, et al. Understanding the patterns and trends of sodium intake, potassium intake, and sodium to potassium ratio and their effect on hypertension in China[J]. The American Journal of Clinical Nutrition, 2014, 99(2): 334-343. DOI:10.3945/ ajcn.113.059121.

[3] DOYLE M E, GLASS K A. Sodium reduction and its effect on food safety, food quality, and human health[J]. Comprehensive Reviews in Food Science andFood Safety, 2010, 9(1): 44-56. DOI:10.1111/ j.1541-4337.2009.00096.x.

[4] 付莎莉, 陳安均, 蒲彪, 等. 食鹽濃度對傳統(tǒng)四川泡菜發(fā)酵過 程中乳酸菌菌相的影響[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè), 2013, 39(8): 102-107.

[5] SO M, LEE Y, KIM H, et al. An influence of salt concentrations on growth rates of lactic acid bacteria isolated from Kimchi[J]. Journal of the Korean Society of Food Science and Nutrition, 1996, 9(9): 341-347. DOI:10.4315/0362-028X-64.8.1145.

[6] BAUTISTA-GALLEGO J, ARROYO-L?PEZ F, DUR?NQUINTANA M, et al. Individual effects of sodium, potassium, calcium, and magnesium chloride salts on Lactobacillus pentosus and Saccharomyces cerevisiae growth[J]. Journal of Food Protection, 2008, 71(7): 1412-1421. DOI:10.4315/0362-028X-71.7.1412.

[7] ROMERO-GIL V, BAUTISTA-GALLEGO J, RODR?GUEZ-G?MEZ F, et al. Evaluating the individual effects of temperature and salt on table olive related microorganisms[J]. Food Microbiology, 2013, 33(2): 178-184. DOI:10.1016/j.fm.2012.09.015.

[8] LEE S H, JUNG J Y, JEON C O. Microbial successions and metabolite changes during fermentation of salted shrimp (saeu-jeot) with different salt concentrations[J]. PLoS ONE, 2014, 9(2): 90-115. DOI:10.1016/ j.fm.2013.01.009.

[9] JUNG J Y, LEE S H, JEON C O. Kimchi microflora: history, current status, and perspectives for industrial kimchi production[J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2014, 98(6): 2385-2393. DOI:10.1007/s00253-014-5513-1.

[10] LUCENA-PADR?S H, CABALLERO-GUERRERO B, MALDONADO-BARRAG?N A, et al. Microbial diversity and dynamics of Spanish-style green table-olive fermentations in large manufacturing companies through culture-dependent techniques[J]. Food Microbiology, 2014, 42: 154-165. DOI:10.1016/ j.fm.2014.03.020.

[11] TORRIANI S, FELIS G E, DELLAGLIO F. Differentiation of Lactobacillus plantarum, L. pentosus, and L. paraplantarum by recA gene sequence analysis and multiplex PCR assay with recA genederived primers[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2001, 67: 3450-3454. DOI:10.1128/AEM.67.8.3450-3454.2001.

[12] JANG J, KIM B, LEE J, et al. A rapid method for identification of typical Leuconostoc species by 16S rDNA PCR-RFLP analysis[J]. Journal of Microbiological Methods, 2003, 55(1): 295-302. DOI:10.1016/S0167-7012(03)00162-3.

[13] HARUTA S, KONDO M, NAKAMURA K, et al. Microbial community changes during organic solid waste treatment analyzed by double gradient-denaturing gradient gel electrophoresis and fluorescence in situ hybridization[J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2002, 60(1/2): 224-231. DOI:10.1007/s00253-002-1074-9.

[14] 陳希. 蔬菜低鹽腌制微生物群落多樣性的分析[D]. 寧波: 寧波大學, 2011: 1-53.

[15] LANE D. 16S/23S rRNA sequencing. Nucleic acid techniques in bacterial systematics[M]. New York: John Wiley and Sons, 1991: 125-175.

[16] DEVEREUX R, HE S H, DOYLE C L, et al. Diversity and origin of Desulfovibrio species: phylogenetic definition of a family[J]. Journal of Bacteriology, 1990, 172(7): 3609-3619. DOI:10.1128/ jb.172.7.3609-3619.1990.

[17] 楊瑞鵬, 趙學慧. 酸泡菜發(fā)酵過程中乳酸菌區(qū)系的研究[J]. 中國調味品, 1991(1): 8-10.

[18] 翁佩芳, 陳希, 沈錫權, 等. 榨菜低鹽腌制細菌群落多樣性的分析[J]. 中國農業(yè)科學, 2011, 45(2): 338-345. DOI:10.3864/ j.issn.0578-1752.2012.02.016.

[19] YAN P M, XUE W D, TAN S S, et al. Effect of inoculating lactic acid bacteria starter cultures on the nitrite concentration of fermenting Chinese paocai[J]. Food Control, 2008, 19(1): 50-55. DOI:10.1016/ j.foogcont.2007.02.008.

[20] 田偉, 張琦, 鄧珍珍, 等. 利用 16S rRNA分析傳統(tǒng)四川發(fā)酵泡菜中的細菌多樣性[J]. 食品科學, 2013, 34(17): 215-218. DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201317046.

[21] YU J, GAO W, QING M J, et al. Identification and characterization of lactic acid bacteria isolated from traditional pickles in Sichuan, China[J]. The Journal of General and Applied Microbiology, 2012, 58(3): 163-172. DOI:10.2323/jgam.58.163.

[22] ZHOU J Z, JIANG Y H, DENG Y, et al. Random sampling process leads to overestimation of β-diversity of microbial communities[J]. mBio, 2013, 4(3): 50-55. DOI:10.1128/mBio.00324-13.

[23] 關倩倩. 我國傳統(tǒng)發(fā)酵泡菜菌系結構及其消長規(guī)律研究[D]. 南昌:南昌大學, 2012: 1-30.

[24] STACKEBRANDT E, GOEBEL B M. Taxonomic note: a place for DNA-DNA reassociation and 16S rRNA sequence analysis in the present species definition in bacteriology[J]. International Journal of Systematic Bacteriology, 1994, 44(4): 846-849. DOI:10.1099/00207713-44-4-846.

[25] HELENA L P, JOSE R B. Diversity and enumeration of halophilic a nd alkaliphilic bacteria in Spanish-style green table-olive fermentations[J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2016, 53: 53-62. DOI:10.1016/j.fm.2015.09.006.

[26] 楊瑞, 張偉, 徐小會. 泡菜發(fā)酵過程中主要化學成分變化規(guī)律的研究[J]. 食品工業(yè)科技, 2005, 26(2): 95-98. DOI:1002-03 06(2005)02-0095-04.

[27] 鄯晉曉. 四川泡菜菌系分離、篩選及發(fā)酵劑的研究[D]. 重慶: 西南大學, 2008: 1-44.

[28] 何玲, 李勤振. 漿水芹菜發(fā)酵過程中優(yōu)勢菌群的分離、鑒定及變化[J].食品科技, 2010, 35(5): 36-40. DOI:1005-9989(2010)05-0036-05.

[29] XIONG T, GUAN Q Q, SONG S H, et al. Dynamic changes of lactic acid bacteria flora during Chinese sauerkraut fermentatio n[J]. Food Control, 2012, 26(1): 178-181. DOI:10.1016/j.foodcont.2012.01.027. [30] PLENGVIDHYA V, BREIDT F, LU Z J, et al. DNA fingerprinting of lactic acid bacteria in sauerkraut fermentations[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2007, 73(23): 7697-7702. DOI:10.1128/ AEM.01342-07.

Community Dynamics of Lactic Acid Bacteria during the Fermentation Process of Chinese Paocai with Different Salt Concentrations

SHEN Wenxi1, CHEN Gong1,2, TANG Yao1, WANG Dongdong1, WANG Yong1, WU Yalong1, ZHANG Hongmei1, ZHANG Wei1, ZHU Xiang1, LI Heng1,2, ZHANG Qisheng1,2,*
(1. Sichuan Dongpo Chinese Paocai Industrial Technology Research Institute, Meishan 620000, China; 2. Sichuan Academy of Food and Fermentation Industries, Wenjiang 611130, China)

The microbial community of lactic acid bacteria isolated from Chinese Paocai prepared with different salt concentrations (2%, moderate 5% and 8%), was assessed by cultivable methods and various molecular biology methods. The results showed that lactic acid bacteria in Paocai brine exhibited faster growth rate at lower salt concentration during the fermentation process. A total of 563 lactic acid bacteria were isolated from Paocai brines fermented with different salt concentrations and identified by 16S rDNA sequencing analysis, multiplex-PCR method, and PCR-FRLP analyses. The i solates were identified to belong to 11 species of 5 genera respectively. Lactococcus lactis, Lactobacillus pentosus and Leuconostoc were found to be the dominant flora in Paocai samples during the early stage of fermentation with lower salt concentration (2%) while Lactobacillus pentosus dominated the late fermentation stage. Furthermore, Lactobacillus pentosus and Weissella were the most abundant isolates from Paocai brine during the early stage of fermentation with 5% and 8% salt concentrations, but the major microbes involved in the late fermentation stage were still Lactobacillus pentosus.

Chinese Paocai; salt concentration; lactic acid bacteria; microbial community

10.7506/spkx1002-6630-201710018

TS201.3

A

1002-6630（2017）10-0105-07

申文熹, 陳功, 唐垚, 等. 不同鹽質量分數(shù)泡白菜發(fā)酵過程中乳酸菌群落結構的變化[J]. 食品科學, 2017, 38(10): 104-110.

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201710018. http://www.spkx.net.cn

SHEN Wenxi, CHEN Gong, TANG Yao, et al. Community dynamics of lactic acid bacteria during the fermentation process of Chinese Paocai with different salt concentrations[J]. Food Science, 2017, 38(10): 104-110. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201710018. http://www.spkx.net.cn

2016-08-09

四川省重大科技支撐項目（NZ20160007；2013NZ0055）；“十二五”國家科技支撐計劃項目（2012BAD31B04）

申文熹（1992—），女，助理工程師，本科，研究方向為食品微生物。E-mail：1053037646@qq.com

*通信作者：張其圣（1983—），男，高級工程師，博士，研究方向為發(fā)酵工程。E-mail：bigbeastone@163.com