王 卉，尚慶茂，張志剛，張 瑩，李平蘭,*

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所，北京 100081）

解淀粉芽孢桿菌L-H15產(chǎn)促生物質(zhì)分析及發(fā)酵工藝優(yōu)化

王 卉1，尚慶茂2，張志剛2，張 瑩1，李平蘭1,*

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所，北京 100081）

植物根際促生菌可以分解轉(zhuǎn)化土壤中的有機(jī)質(zhì)和礦物質(zhì)，預(yù)防和控制農(nóng)作物病害，減少農(nóng)藥和化肥的使用，將其應(yīng)用于農(nóng)業(yè)被認(rèn)為是一種提高農(nóng)作物產(chǎn)量的新型方法。實(shí)驗(yàn)室分離篩選到一株優(yōu)良的解淀粉芽孢桿菌L-H15，通過(guò)前期L-H15全基因組測(cè)序的提示，考察L-H15能夠產(chǎn)生的促生物質(zhì)，并優(yōu)化其發(fā)酵工藝，開(kāi)發(fā)出高活性的固態(tài)菌劑。結(jié)果表明：解淀粉芽孢桿菌L-H15能夠產(chǎn)生相對(duì)表達(dá)量為65.53%的鐵載體；其產(chǎn)1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸脫氨酶的能力也較強(qiáng)，比活力測(cè)定結(jié)果為0.401 U/mg；采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)到該菌株亦能產(chǎn)生植物激素吲哚乙酸和細(xì)胞分裂素，產(chǎn)細(xì)胞分裂素的能力尤為顯著，可達(dá)到2.157 7×10－10mol/L；運(yùn)用氣相色譜-質(zhì)譜檢測(cè)出L-H15產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)中含有乙酰甲基原醇。這些因素均可有效刺激植物的生長(zhǎng)發(fā)育。采用Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化解淀粉芽孢桿菌L-H15的發(fā)酵工藝，L-H15的最佳發(fā)酵條件為：接種量8%、裝液量67.8%、發(fā)酵時(shí)間11.5 h、發(fā)酵溫度32 ℃、轉(zhuǎn)速196 r/min。此時(shí)，解淀粉芽孢桿菌L-H15活菌數(shù)最高可達(dá)到1.21×109CFU/mL。綜合評(píng)定，解淀粉芽孢桿菌L-H15是一株優(yōu)良的植物根際促生菌，具有廣闊的開(kāi)發(fā)成生物肥料的前景。

解淀粉芽孢桿菌L-H15；促生物質(zhì)；發(fā)酵工藝

隨著化肥、農(nóng)藥等的過(guò)量使用甚至濫用，造成了一系列的環(huán)境污染、土壤多樣性破壞、食品安全性降低等問(wèn)題。與此同時(shí)，植物根際促生菌以高效、環(huán)保、安全等諸多優(yōu)點(diǎn)受到人們的關(guān)注，根際促生菌可以分解轉(zhuǎn)化土壤中的有機(jī)質(zhì)和礦物質(zhì)，預(yù)防和控制農(nóng)作物病害，減少農(nóng)藥和化肥的使用，應(yīng)用根際促生菌被普遍認(rèn)為是一種發(fā)展綠色食品的有效手段[1-2]。隨著人們對(duì)根際促生菌研究的逐漸重視，越來(lái)越多的促生菌被運(yùn)用到科研中，并逐步深入到對(duì)促生菌作用機(jī)制、生理效應(yīng)的研究及制劑產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用。

植物根際促生菌L-H15，由實(shí)驗(yàn)室從草炭土育苗基質(zhì)中分離獲得并保存，經(jīng)鑒定其為解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）。對(duì)其進(jìn)行篩選時(shí)發(fā)現(xiàn)該菌株的固氮、溶磷、解鉀能力均很強(qiáng)，前期實(shí)驗(yàn)室對(duì)解淀粉芽孢桿菌L-H15的研究主要集中于L-H15可以產(chǎn)生抗菌脂肽來(lái)有效抑制植物病原菌，從而達(dá)到生物防治的目的。之后實(shí)驗(yàn)室對(duì)該菌株進(jìn)行了全基因組測(cè)序，發(fā)現(xiàn)L-H15存在其他促生長(zhǎng)因子有待進(jìn)一步研究，并具有開(kāi)發(fā)成微生物肥料廣泛應(yīng)用的潛力。本研究旨在探究解淀粉芽孢桿菌L-H15促生的特性，通過(guò)研究其能否產(chǎn)生對(duì)植物生長(zhǎng)具有促進(jìn)作用的因子，如鐵載體、植物激素、1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸（1-aminocyclopropane-1-carboxylate，ACC）脫氨酶和揮發(fā)性有機(jī)物質(zhì)（volatile organic compounds，VOCs），來(lái)揭示菌株L-H15的促生機(jī)制，并通過(guò)響應(yīng)面分析優(yōu)化該菌株的發(fā)酵工藝，為今后將其應(yīng)用于工廠化育苗和生物肥料生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

解淀粉芽孢桿菌L-H15（Bacillus amyloliquefaciens L-H15）由中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院應(yīng)用微生物研究室提供，分離于中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)草坪育苗基質(zhì)，專(zhuān)利保藏號(hào)為CGMCC No.8230。

鉻天青S（chrome azurol S，CAS）、2,4-二硝基苯肼國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；十六烷基三甲基溴化銨、1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸 美國(guó)Sigma公司；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)植物激素酶聯(lián)免疫試劑盒 寶如億生物技術(shù)有限公司；Tris、考馬斯亮藍(lán) 美國(guó)Amresco公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SCL-1300型垂直流潔凈工作臺(tái) 北京賽伯樂(lè)實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；DNP-9162型電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；UV-1800紫外分光光度計(jì) 上海美譜達(dá)儀器有限公司；QP2010 plus型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 L-H15促生特性

1.3.1.1 L-H15產(chǎn)鐵載體測(cè)定

CAS檢測(cè)液配制參照Schwyn等[3]的方法，采用雙層平板法培養(yǎng)菌株。下層平板將CAS檢測(cè)液在65 ℃水浴30 min，在該溫度按照5 mL CAS檢測(cè)液/100 mL 1%瓊脂的比例混合均勻；待下層平板完全凝固后，在其上覆蓋一層LB固體培養(yǎng)基作為上層平板。將活化好的解淀粉芽孢桿菌L-H15以10 μL/點(diǎn)接種，于28 ℃培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)72 h。觀察菌落的生長(zhǎng)情況及培養(yǎng)基顏色的變化。

采用CAS液體檢測(cè)法測(cè)定解淀粉芽孢桿菌L-H15產(chǎn)鐵載體產(chǎn)量。將L-H15菌液接種于MKB液體培養(yǎng)基，28 ℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)48 h。將上述搖床培養(yǎng)物在3 500 r/min離心15 min，取3 mL上清液與3 mL CAS檢測(cè)液混合均勻，室溫反應(yīng)1 h，以去離子水作為對(duì)照調(diào)零，測(cè)定630 nm波長(zhǎng)處的吸光度，記為As；以未接菌的MKB液體培養(yǎng)基上清液同法測(cè)定吸光度，記為Ar。鐵載體相對(duì)表達(dá)量計(jì)算如式（1）所示：

1.3.1.2 L-H15產(chǎn)植物激素測(cè)定

采用雙抗夾心酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定解淀粉芽孢桿菌L-H15分泌吲哚乙酸（indole acetic acid，IAA）和細(xì)胞分裂素（cytokinin，CTK）的能力。按照IAA、CTK、赤霉素酶聯(lián)免疫試劑盒的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.3.1.3 L-H15產(chǎn)ACC脫氨酶測(cè)定

ACC脫氨酶測(cè)定參照Adams等[4]的方法，將L-H15菌液懸浮于ADF培養(yǎng)液，28 ℃、200 r/min培養(yǎng)24 h，以誘導(dǎo)產(chǎn)生ACC脫氨酶，離心去除上清液，用0.1 mol/L Tris-HCl緩沖液（pH 7.6）洗滌菌體2 次。將菌體沉淀重新懸浮于600 μL的0.1 mol/L Tris-HCl緩沖液（pH 8.5）中，加入30 μL甲苯，高速振蕩30 s破碎細(xì)胞。將甲苯化菌液分為兩組各取200 μL，其中一組加入20 μL 0.5 mol/LACC，30℃水浴反應(yīng)15 min。在兩組處理中均加入1 mL 0.56 mol/L HCl，10 000 r/min離心2 min，吸取1 mL上清液，依次加入800 μL 0.56 mol/L HCl和300 μL 0.2% 2,4-二硝基苯肼，混合均勻后30 ℃反應(yīng)30 min，最后加入2 mL的2 mol/L NaOH用于顯色苯腙。以只含甲苯化菌液的處理組作為空白對(duì)照，以ACC-甲苯化菌液的處理組作為待測(cè)樣本，測(cè)定540 nm波長(zhǎng)處的吸光度。ACC脫氨酶活力（U）為反應(yīng)體系中1 min形成1 μmol α-丁酮酸的酶量，蛋白質(zhì)量濃度采用Bradford比色法測(cè)定，比活力計(jì)算如式（2）所示：

1.3.1.4 L-H15產(chǎn)VOCs測(cè)定

將培養(yǎng)好的1 mL解淀粉芽孢桿菌L-H15置于20 mL頂空瓶?jī)?nèi)，采用65 μm PDMS/DVB萃取頭，樣品置于40 ℃條件下平衡40 min后，將萃取頭插入頂空瓶中萃取30 min，最后將萃取頭拔出并置于250 ℃的進(jìn)樣口中解吸2 min。色譜柱型號(hào)DB-WAX（30 m×0.25 mm，0.25 μm），柱溫箱初始溫度40 ℃，進(jìn)樣口溫度250 ℃，不分流進(jìn)樣，載氣流速1 mL/min，柱溫箱升溫程序?yàn)?0 ℃保持3 min，5 ℃/min升至120 ℃，10 ℃/min升至200 ℃，保持5 min。離子源溫度200 ℃，傳輸線(xiàn)溫度250 ℃，采用Scan模式采集信號(hào)，掃描范圍m/z 35～500。

1.3.2 L-H15的液態(tài)發(fā)酵

1.3.2.1 培養(yǎng)條件單因素試驗(yàn)

挑取新鮮解淀粉芽孢桿菌L-H15單菌落，接種于LB液體培養(yǎng)基，37 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)過(guò)夜；8 000 r/min離心10 min，所得菌體用0.85%的NaCl溶液漂洗3 次，并將菌液調(diào)至107CFU/mL備用。裝液量：按照500 mL容量瓶的20%、30%、40%、50%、60%、70%和80%裝液；接種量：接種上述處理好的107CFU/mL的L-H15菌懸液，接種量設(shè)定為2%、4%、6%、8%和10%；發(fā)酵時(shí)間：設(shè)定每隔6、9、12、15、18 h測(cè)定L-H15的活菌數(shù)；發(fā)酵溫度：將L-H15發(fā)酵溫度調(diào)節(jié)為28、32、36、40、44 ℃；轉(zhuǎn)速：調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速為120、150、180、210、240 r/min。

1.3.2.2 Plackett-Burman試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，從各因素的最大響應(yīng)區(qū)間中選擇高低兩個(gè)水平，利用Design-Expert 8.0軟件設(shè)計(jì)Plackett-Burman試驗(yàn)，對(duì)裝液量、接種量、發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度、轉(zhuǎn)速5 個(gè)因素進(jìn)行考察，響應(yīng)值為OD600nm。

1.3.2.3 最陡爬坡試驗(yàn)

根據(jù)Plackett-Burman試驗(yàn)所得顯著因素及效應(yīng)值，設(shè)計(jì)最陡爬坡試驗(yàn)的方向和步長(zhǎng)。所選擇的顯著因素若效應(yīng)值為正，則梯度方向增加；若效應(yīng)值為負(fù)，則梯度方向減少。步長(zhǎng)根據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)果分析確定，以此達(dá)到快速、經(jīng)濟(jì)逼近最佳區(qū)域的目的。

1.3.2.4 Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)

由最陡爬坡試驗(yàn)的拐點(diǎn)確定響應(yīng)中心點(diǎn)及接近響應(yīng)值區(qū)域因素的取值范圍，設(shè)計(jì)Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)。以裝液量、發(fā)酵時(shí)間、轉(zhuǎn)速3 個(gè)因素為自變量，以O(shè)D600nm為響應(yīng)值，生成等高線(xiàn)圖和響應(yīng)面圖，獲得最優(yōu)的發(fā)酵參數(shù)。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

本研究所得數(shù)據(jù)用Excel 2010和SPSS 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，置信度為95%（α=0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 L-H15促生特性

2.1.1 產(chǎn)鐵載體能力

將解淀粉芽孢桿菌L-H15在CAS固體雙層平板上進(jìn)行檢測(cè)，培養(yǎng)48 h后，如圖1所示，待測(cè)菌株在上層LB培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好，并在下層的CAS檢測(cè)平板上產(chǎn)生了橘黃色顯色圈，此為典型的鐵載體螯合暈圈；空白對(duì)照仍保持藍(lán)色。結(jié)果說(shuō)明，解淀粉芽孢桿菌L-H15可以分泌鐵載體，且根據(jù)暈圈直徑的大小可以推測(cè)L-H15產(chǎn)生的鐵載體含量較高。

圖 1 鐵載體雙層平板顯色Fig. 1 Coloration of siderophore on double-layer plate

將解淀粉芽孢桿菌L-H15在MKB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h，空白對(duì)照和L-H15處理組的OD630nm分別為0.879和0.303，計(jì)算得到菌株L-H15產(chǎn)鐵載體相對(duì)表達(dá)量為65.53%。

2.1.2 L-H15產(chǎn)植物激素能力

圖 2 L-H15產(chǎn)IAA（A）和CTK（B）能力Fig. 2 Capacity of L-H15 to produce IAA (A) and CTK (B)

如圖2A所示，L-H15分泌IAA濃度隨著時(shí)間的延長(zhǎng)呈S形趨勢(shì)，先快速增長(zhǎng)，后趨于平緩。培養(yǎng)16 h時(shí)，解淀粉芽孢桿菌L-H15開(kāi)始緩慢分泌IAA；24～40 h，IAA產(chǎn)量快速累積增長(zhǎng)，在40 h時(shí)濃度達(dá)到6.698× 10－11mol/L，之后增長(zhǎng)趨勢(shì)趨于平緩，48 h的產(chǎn)量與40 h相比幾乎無(wú)差別。如圖2B所示，L-H15分泌CTK濃度隨著時(shí)間的延長(zhǎng)呈拋物線(xiàn)型，先經(jīng)過(guò)平穩(wěn)期后快速增長(zhǎng)，又快速下降。培養(yǎng)16 h時(shí)，解淀粉芽孢桿菌L-H15開(kāi)始緩慢產(chǎn)生CTK，24 h后進(jìn)入快速增長(zhǎng)期，在40 h時(shí)分泌量達(dá)到最大值2.157 7×10－10mol/L；此后CTK產(chǎn)量下降，在48 h時(shí)降至1.024 6×10－10mol/L?？傮w來(lái)看，菌株L-H15產(chǎn)CTK的能力很強(qiáng)。

2.1.3 L-H15產(chǎn)ACC脫氨酶能力

ACC脫氨酶活力為反應(yīng)體系中1 min形成1 μmol α-丁酮酸的酶量，解淀粉芽孢桿菌L-H15產(chǎn)ACC脫氨酶活力為0.049 1 U/mL；通過(guò)測(cè)定得總蛋白質(zhì)量濃度為0.125 mg/mL；ACC脫氨酶比活力為0.401 U/mg，即24.06 μmol/（mg·h）。

2.1.4 L-H15產(chǎn)VOCs能力

圖 3 L-H15產(chǎn)VOCs質(zhì)譜Fig. 3 Mass spectrum of VOCs produced by L-H15

L-H15產(chǎn)VOCs質(zhì)譜見(jiàn)圖3。本實(shí)驗(yàn)使用NIST11數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)未知揮發(fā)性化合物譜圖進(jìn)行比對(duì)，相似度達(dá)85%以上。

由表1可以看出，解淀粉芽孢桿菌L-H15產(chǎn)生的VOCs主要是酸類(lèi)、醛酮類(lèi)和醇類(lèi)物質(zhì)。各種物質(zhì)混雜在一起，形成了L-H15獨(dú)特的氣味。編號(hào)14揮發(fā)性物質(zhì)可能為乙酰甲基原醇，相似度達(dá)到86%。Ryu等[5]報(bào)道枯草芽孢桿菌GB03和解淀粉芽孢桿菌IN937a產(chǎn)生的2,3-丁二醇和乙酰甲基原醇能促進(jìn)擬南芥的生長(zhǎng)，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)了乙酰甲基原醇，表明解淀粉芽孢桿菌L-H15產(chǎn)生的VOCs能夠?qū)χ参锏纳L(zhǎng)起到調(diào)控作用。

表 1 L-H15產(chǎn)VOCs質(zhì)譜分析Table 1 Mass spectral analysis of VOCs produced by L-H15

2.2 L-H15的液態(tài)發(fā)酵

2.2.1 培養(yǎng)條件單因素試驗(yàn)結(jié)果

圖 4 發(fā)酵條件單因素試驗(yàn)結(jié)果Fig. 4 Optimization of fermentation conditions

如圖4所示，活菌數(shù)隨著裝液量的增加呈先增加后減小的趨勢(shì)，響應(yīng)區(qū)間為50%～80%，裝液量為60%時(shí)活菌數(shù)達(dá)最大值1.09×108CFU/mL。接種量在2%～6%范圍時(shí)，活菌數(shù)隨接種量增加而增大；接種量超過(guò)6%時(shí)，活菌數(shù)隨接種量的增加而減少。響應(yīng)區(qū)間為4%～8%，接種量為6%時(shí)活菌數(shù)達(dá)最大值1.38×108CFU/mL。隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，活菌數(shù)呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢(shì)，響應(yīng)區(qū)間為9～15 h，當(dāng)發(fā)酵時(shí)間為9 h，活菌數(shù)達(dá)到最大值3.07×108CFU/mL。當(dāng)發(fā)酵溫度在28～32 ℃時(shí)，活菌數(shù)呈增加趨勢(shì)；當(dāng)溫度在32～44 ℃范圍內(nèi)，活菌數(shù)逐漸減少。響應(yīng)區(qū)間為32～40 ℃，當(dāng)溫度為32 ℃時(shí)，活菌數(shù)達(dá)最大值9.93×108CFU/mL。隨著轉(zhuǎn)速的增加，活菌數(shù)先增加后減少。響應(yīng)區(qū)間為180～240 r/min，當(dāng)轉(zhuǎn)速為180 r/min時(shí)，活菌數(shù)最大達(dá)1.09×109CFU/mL。

2.2.2 Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)果

表 2 Plackett-Burman試驗(yàn)效應(yīng)分析Table 2 Effect analysis of Plackett-Burman design

本試驗(yàn)選用N12的Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)，考察液量（A）、接種量（C）、發(fā)酵時(shí)間（E）、發(fā)酵溫度（G）、轉(zhuǎn)速（J）5 個(gè)因素對(duì)OD600nm的影響，對(duì)結(jié)果進(jìn)行效應(yīng)分析。由表2看出，裝液量、發(fā)酵溫度為負(fù)效應(yīng)；而接種量、發(fā)酵時(shí)間、轉(zhuǎn)速為正效應(yīng)。效應(yīng)值的大小表示該因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響的強(qiáng)弱，該值與因素的貢獻(xiàn)率呈正相關(guān)。由此可得，5 個(gè)因素對(duì)模型影響的貢獻(xiàn)率依次為：裝液量＞發(fā)酵時(shí)間＞轉(zhuǎn)速＞接種量＞發(fā)酵溫度。對(duì)貢獻(xiàn)率較大的三因素進(jìn)行最陡爬坡試驗(yàn)，其他因素根據(jù)效應(yīng)值取值，表現(xiàn)為正效應(yīng)的因素取高水平，表現(xiàn)為負(fù)效應(yīng)的因素取低水平。

2.2.3 最陡爬坡試驗(yàn)結(jié)果

由Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)果設(shè)計(jì)主要因素的最陡爬坡路徑，裝液量、發(fā)酵時(shí)間、轉(zhuǎn)速為顯著模型，裝液量為負(fù)效應(yīng)，應(yīng)減少；發(fā)酵時(shí)間、轉(zhuǎn)速為正效應(yīng)，應(yīng)增加。根據(jù)試驗(yàn)號(hào)1～5，依次取裝液量為80%、70%、60%、50%和40%；發(fā)酵時(shí)間為9、11、13、15 h和17 h，轉(zhuǎn)速為180、200、220、240 r/min和260 r/min。

圖 5 最陡爬坡試驗(yàn)結(jié)果Fig. 5 Results of steepest grade test

由圖5可以看出，所設(shè)計(jì)的最陡爬坡試驗(yàn)結(jié)果出現(xiàn)理想的先增高后降低的趨勢(shì)，并且在2號(hào)試驗(yàn)點(diǎn)處出現(xiàn)最高點(diǎn)，即裝液量70%、發(fā)酵時(shí)間11 h、轉(zhuǎn)速200 r/min時(shí)，OD600nm值達(dá)到最大，該點(diǎn)即為最陡爬坡試驗(yàn)的拐點(diǎn)，也是下一步Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)的中心點(diǎn)。

2.2.4 Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

表 3 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 Box-Behnken design with experimental results

設(shè)計(jì)三水平三因素的Box-Behnken試驗(yàn)，對(duì)Plackett-Burman試驗(yàn)篩選出的顯著因素裝液量、發(fā)酵時(shí)間、轉(zhuǎn)速進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化，具體試驗(yàn)方案及結(jié)果如表3所示。

根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)結(jié)果建立回歸模型并進(jìn)行方差分析，如表4所示。

表 4 Box-Behnken試驗(yàn)回歸模型方差分析Table 4 Analysis of variance (ANOVA) of Box-Behnken design regression model

由表4可知，所選模型極顯著（P=0.007 6＜0.01），說(shuō)明模型具有可信度；失擬項(xiàng)不顯著（P=0.077 7＞0.05），說(shuō)明未知因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果干擾小。因此確定本模型可靠，利用Design-Expert 8.0軟件對(duì)模型進(jìn)行響應(yīng)面分析，得到等高線(xiàn)圖和響應(yīng)面三維圖，如圖6所示。

圖 6 Box-Behnken等高線(xiàn)和響應(yīng)面圖Fig. 6 Response surface and contour plots showing the effects on various culture conditions on the viable cell count

由圖6可以看出，等高線(xiàn)圖均為橢圓形，響應(yīng)面三維圖均有穩(wěn)定點(diǎn)，且為極大值。利用Design-Expert 8.0對(duì)表5中所顯示的結(jié)果進(jìn)行二次多元回歸擬合處理，得到解淀粉芽孢桿菌L-H15的OD600nm（R）對(duì)裝液量（A）、發(fā)酵時(shí)間（B）、轉(zhuǎn)速（C）的二次多元回歸方程為：

Design-Expert 8.0軟件預(yù)測(cè)出以O(shè)D600nm為響應(yīng)值時(shí)，裝液量、發(fā)酵時(shí)間、轉(zhuǎn)速的最優(yōu)參數(shù)分別為67.8%、11.5 h、196 r/min，此時(shí)預(yù)測(cè)最大OD600nm為1.28；驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的條件參照Box-Behnken試驗(yàn)和Plackett-Burman試驗(yàn)的優(yōu)化結(jié)果，實(shí)際所得解淀粉芽孢桿菌L-H15的OD600nm為1.31，該值與模型的預(yù)測(cè)值基本吻合，此時(shí)活菌數(shù)為1.21×109CFU/mL。

3 討 論

本研究對(duì)解淀粉芽孢桿菌L-H15可能具有的促生長(zhǎng)因子進(jìn)行了定性和定量的分析。根際促生菌產(chǎn)生的鐵載體一方面可與病原微生物爭(zhēng)奪有限的鐵營(yíng)養(yǎng)而抑制病原菌的侵染能力[6-9]；另一方面其所形成的鐵-鐵載體復(fù)合物具有可溶性，能被植物細(xì)胞外膜上的特異性受體識(shí)別和吸收，直接參與植物的代謝過(guò)程[10-12]。本實(shí)驗(yàn)得到解淀粉芽孢桿菌L-H15的鐵載體相對(duì)表達(dá)量為65.53%。查閱相關(guān)文獻(xiàn)，蒙淵[13]篩選的一株產(chǎn)鐵載體的氫氧化細(xì)菌表達(dá)量為16.2%；孫紅啟[14]篩選的27株鐵載體高表達(dá)量的絲狀真菌產(chǎn)量范圍為10.2%～74.3%，由此可以看出解淀粉芽孢桿菌L-H15產(chǎn)鐵載體的能力相對(duì)較強(qiáng)。

根際促生菌可以通過(guò)干擾植物內(nèi)源激素或提供外源激素兩種方式對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育產(chǎn)生影響?，F(xiàn)已知能促進(jìn)幼苗生長(zhǎng)的植物激素主要有IAA和CTK。本實(shí)驗(yàn)研究了L-H15產(chǎn)IAA和CTK的能力，發(fā)現(xiàn)其能夠產(chǎn)生6.698×10－11mol/L的IAA和2.157 7×10－10mol/L的CTK，產(chǎn)CTK的能力尤為顯著。觀察到IAA的含量隨時(shí)間延長(zhǎng)漸趨穩(wěn)定，說(shuō)明菌株L-H15自身不會(huì)吸收分解IAA，IAA能夠促進(jìn)植物根系統(tǒng)的發(fā)育，使植物根部伸展到更大的土壤范圍。由此推測(cè)，解淀粉芽孢桿菌L-H15產(chǎn)生IAA的原因可能是為了刺激植物釋放出大量的單糖和低聚糖，為菌株自身附生于植物表面，獲取充足的營(yíng)養(yǎng)創(chuàng)造有利的條件。菌株L-H15分泌的CTK含量在40 h達(dá)到頂峰后開(kāi)始下降，說(shuō)明菌株L-H15自身可能對(duì)CTK有消耗需求[15]。CTK能促進(jìn)細(xì)胞的分裂，并延緩細(xì)胞的衰老。推測(cè)L-H15進(jìn)入衰亡期時(shí)，通過(guò)吸收CTK來(lái)延緩細(xì)胞的衰老，并刺激菌體細(xì)胞繼續(xù)分裂，而其產(chǎn)生的CTK也能夠直接被植物吸收利用，協(xié)助幼苗根系吸收系統(tǒng)的迅速

建立[16-17]。

乙烯對(duì)植物生長(zhǎng)的影響，取決于乙烯的含量和植物對(duì)乙烯的敏感程度。在成熟的果實(shí)中乙烯濃度會(huì)顯著提高[18-19]；遇到不良環(huán)境脅迫也會(huì)大量積累乙烯[20]。“逆境乙烯”的產(chǎn)生在某種意義上來(lái)說(shuō)是植物自身的一種應(yīng)激反應(yīng)，能夠起到自我保護(hù)的作用，但高于正常濃度的乙烯也會(huì)導(dǎo)致植物生長(zhǎng)發(fā)育受阻或死亡[21]。Adams等[4]發(fā)現(xiàn)ACC是乙烯生物合成的前體，而根際促生菌分泌的ACC脫氨酶可將ACC分解成α-丁酮酸和氨，從而抑制乙烯的生成。解淀粉芽孢桿菌L-H15產(chǎn)ACC脫氨酶比活力為0.401 U/mg，即24.06 μmol/（mg·h）。查閱相關(guān)文獻(xiàn)，馬嘉敏[22]分離得到11株苜蓿根際促生菌，其分泌的A C C脫氨酶活性在1.1 7～29.78 μmol/（mg·h）范圍內(nèi)；龔鳳娟[23]從杜仲內(nèi)生細(xì)菌分離得到Pseudomonas koreensi JDM-2的ACC脫氨酶具有0.178 U/mg的最高酶活，絞股藍(lán)內(nèi)生細(xì)菌Pseudomonas sp. JDG-7的酶活性最高，為0.870 U/mg；周仲?gòu)?qiáng)[24]篩選的植物根際促生菌產(chǎn)ACC脫氨酶活力范圍為0.315～0.461 U/mg?？梢钥闯鼍闘-H15產(chǎn)ACC脫氨酶的活力較強(qiáng)。

近年發(fā)現(xiàn)植物根際促生菌產(chǎn)生的VOCs對(duì)植物的生長(zhǎng)調(diào)控有不容小覷的作用[25]。關(guān)于根際促生菌揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)植物生長(zhǎng)最具影響力的報(bào)道是Ryu等[5]發(fā)表的枯草芽孢桿菌GB03和解淀粉芽孢桿菌IN937a產(chǎn)生的2,3-丁二醇和乙酰甲基原醇能促進(jìn)擬南芥的生長(zhǎng)，本研究中解淀粉芽孢桿菌L-H15能產(chǎn)生乙酰甲基原醇，這與Ryu等[5]的報(bào)道相一致，說(shuō)明菌株L-H15能夠產(chǎn)生對(duì)植物有促生作用的揮發(fā)性物質(zhì)。

由于解淀粉芽孢桿菌L-H15有開(kāi)發(fā)成生物肥料的潛力，使用液體發(fā)酵能使其周期縮短、產(chǎn)量增加、質(zhì)量穩(wěn)定，具有很高的經(jīng)濟(jì)效益。解淀粉芽孢桿菌發(fā)酵條件主要影響因素有裝液量、接種量、發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度和轉(zhuǎn)速。裝液量過(guò)少，發(fā)酵液相應(yīng)的碳氮源和營(yíng)養(yǎng)成分少，不夠支持活菌的持續(xù)增長(zhǎng)；裝液量過(guò)多，溶氧含量降低，影響微生物的有氧呼吸，導(dǎo)致活菌數(shù)下降。在發(fā)酵工業(yè)中，合適的接種量不僅有利于菌株發(fā)酵的快速啟動(dòng)，更能提高菌株對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基的利用率。當(dāng)接種量較小時(shí)，初始菌株生長(zhǎng)緩慢而導(dǎo)致雜菌污染的機(jī)率增大，影響發(fā)酵產(chǎn)品的質(zhì)量[26]；但接種量過(guò)大，會(huì)加速培養(yǎng)基的消耗，菌體產(chǎn)生大量的次級(jí)代謝產(chǎn)物也可能對(duì)菌體的繁殖產(chǎn)生抑制作用。細(xì)菌生長(zhǎng)曲線(xiàn)分為遲滯期、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、穩(wěn)定生長(zhǎng)期和衰亡期，發(fā)酵時(shí)間一般控制在穩(wěn)定期。發(fā)酵時(shí)間過(guò)短，細(xì)菌菌體沒(méi)有充分形成；發(fā)酵時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，培養(yǎng)基被大量消耗，導(dǎo)致微生物生長(zhǎng)所需物質(zhì)匱乏，不僅菌體活力會(huì)降低，菌體細(xì)胞也會(huì)自溶死亡。發(fā)酵溫度是影響菌株發(fā)酵水平的重要因素之一，溫度升高，細(xì)菌細(xì)胞中蛋白質(zhì)和酶活性增強(qiáng)，生物化學(xué)反應(yīng)加快，生長(zhǎng)與繁殖速率提高；但溫度上升超過(guò)一定閾值后，細(xì)菌細(xì)胞中對(duì)溫度較敏感的組成成分（如蛋白質(zhì)、核酸等）會(huì)受到不可逆的破壞，進(jìn)而抑制菌體生長(zhǎng)與繁殖。轉(zhuǎn)速對(duì)發(fā)酵的影響主要是對(duì)通氣量的調(diào)節(jié)，解淀粉芽孢桿菌L-H15為好氧菌，故轉(zhuǎn)速越高，通氣量越大，菌株生長(zhǎng)越旺盛。本研究通過(guò)Plackett-Burman試驗(yàn)、最陡爬坡試驗(yàn)和Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化了因素間的交互影響，最終菌落數(shù)達(dá)到了較高的水平，這為今后開(kāi)發(fā)微生物肥料提供了很好的理論依據(jù)。

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Plant Growth Promoting Characteristics of Bacillus amyloliquefaciens L-H15 and Optimization of Its Culture Conditions

WANG Hui1, SHANG Qingmao2, ZHANG Zhigang2, ZHANG Ying1, LI Pinglan1,*
(1. College of Food Science and Nutritional Engineering, China Agricultural University, Beijing 100083, China; 2. Institute of Vegetables and Flowers, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China)

Plant growth promoting rhizobacteria (PGPR) c an decompose and transform organic substances and minerals in soil, prevent and control plant diseases and reduce the use of pesticides and fertilizers. Thus, PGPR are considered to be used as a new strategy to improve agricultural production. Bacillus amyloliquefaciens L-H15 is an excellent plant growth promoting rhizobacterium. Based on the results of previous studies of its full-length genomic sequence, we investigated the plant growth promoting properties of B. amyloliquefaciens L-H15 and optimized its culture conditions in order to develop a highly active solid starter culture. Our results indicated that B. amyloliquefaciens L-H15 produced a high level of siderophore (65.53%) and strong activity of 1-aminocyclopropane-1-carboxylate (ACC) deaminase showing a speci c activity of 0.401 U/mg. This strain could also produce indole-3-acetic (IAA) and cytokinins (CTK). The abilityto produce CTK was particularly signi cant, which was as high as 2.157 7 × 10-10mol/L. Acetyl methyl alcohol, which can promote plant growth, was also detected in the volatiles generated by L-H15. These factors were able to effectively stimulate plant growth. We used response surface methodology based on Box-Behnken design to optimize the culture conditions of B. amyloliquefaciens L-H15 as follows: an inoculum size of 8%, a proportion of medium in a 500-mL volumetrica sk of 67.8%, a culture temperature of 32 ℃, a culture time of 11.5 h, and a rotational speed of 196 r/min. Under these conditions, the viable cell count of B. amyloliquefaciens L-H15 was 1.21 × 109CFU/mL. In conclusion, B. amyloliquefaciens L-H15 is an excellent PGPR, which has a broad prospect of development and utilization as a biofertilizer.

Bacillus amyloliquefaciens L-H15; plant growth promoting factors; fermentation process

10.7506/spkx10 02-6630-201710013

S482.292

A

1002-6630（2017）10-0074-08

2016-06-06

公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專(zhuān)項(xiàng)（20130314-04）

王卉（1990—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)閼?yīng)用微生物。E-mai l：wanghui31240@163.com

*通信作者：李平蘭（1964—），女，教授，博士，研究方向?yàn)閼?yīng)用微生物。E-mail：lipinglan@cau.edu.cn

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WANG Hui, SHANG Qingmao, ZHANG Zhigang, et al. Plant growth promoting characteristics of Bacillus amyloliquefaciens L-H15 and optimization of its culture conditions[J]. Food Science, 2017, 38(10): 74-81. (in Chinese with English abstract)

10.7506/spkx1002-6630-201710013. http://www.spkx.net.cn