董韓博，謝 晶，錢韻芳，楊勝平，茍 怡

（上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心，上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海 201306）

抗熒光假單胞菌Carnobacterium spp. LB1培養(yǎng)發(fā)酵條件的優(yōu)化

董韓博，謝 晶*，錢韻芳，楊勝平，茍 怡

（上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心，上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海 201306）

為了改善和優(yōu)化海產(chǎn)品源肉食桿菌（Carnobacterium）spp. LB1產(chǎn)有效抑菌代謝產(chǎn)物的培養(yǎng)發(fā)酵條件，提高對(duì)熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）的抑菌效果?；趩我蛩卦囼?yàn)，從對(duì)Carnobacterium spp. LB1抑菌效果有影響的5 個(gè)因素中篩選出3 個(gè)顯著影響因素，運(yùn)用Design-Expert軟件的Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原則研究3 個(gè)顯著影響因素的重要水平和交互作用。結(jié)果表明：Carnobacterium spp. LB1的最佳培養(yǎng)發(fā)酵條件：初始pH 6.22、溫度28.6 ℃、葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%。在最優(yōu)培養(yǎng)條件下，Carnobacterium spp. LB1的濃縮發(fā)酵液在15 h和18 h對(duì)P.uorescens的抑菌率分別為80.7%、86.3%，其抑菌機(jī)理是Carnobacterium spp. LB1破壞了P.uorescens的細(xì)胞壁，導(dǎo)致其通透性增大，堿性磷酸酶大量溢出，使其代謝紊亂，從而抑制了P. fluorescens的生長(zhǎng)。同時(shí)，最優(yōu)發(fā)酵條件下獲得的實(shí)驗(yàn)結(jié)果平均值與模型預(yù)測(cè)值基本吻合，進(jìn)而說(shuō)明所建立回歸模型是可靠的。

熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）是一種革蘭氏陰性桿狀嗜冷微生物，具有分布范圍廣、營(yíng)養(yǎng)需求單一、競(jìng)爭(zhēng)定植力強(qiáng)等特點(diǎn)，在4 ℃條件下能夠快速繁殖；水產(chǎn)品由于捕撈、貯藏和運(yùn)輸?shù)冗^(guò)程中的人為操作不當(dāng)或者機(jī)械損傷，魚(yú)體易被該菌侵入引起致腐，它是水產(chǎn)品的主要優(yōu)勢(shì)致病菌和腐敗菌[1-4]。

乳酸菌是一種新型的微生物源生物保鮮劑，通過(guò)生態(tài)位競(jìng)爭(zhēng)、營(yíng)造酸性環(huán)境和產(chǎn)生H2O2、細(xì)菌素等抑菌性物質(zhì)抑制食品中銅綠假單胞菌、單增李斯特菌、金黃色葡萄球菌等常見(jiàn)腐敗菌和致病菌的生長(zhǎng)和繁殖[5-9]。傅容輝等[10]研究乳酸菌對(duì)熒光假單胞菌、金黃色葡萄球菌等水產(chǎn)品常見(jiàn)的腐敗菌和致病菌的抑菌機(jī)理時(shí)，其中有3 株植物乳桿菌ACCC10171、ACCC11095和ACCC1118，2 株干酪乳桿菌ACCC11052和ACCC11050對(duì)熒光假單胞菌抑菌作用顯著，抑菌圈基本上都達(dá)到17.95 mm左右。高鵬等[11]從自制酸菜中分離得到的植物乳桿菌HLJ-174，對(duì)大腸桿菌、熒光假單胞菌等有明顯抑菌效果。Liu Hui等[12]從奶酪中分離得到一株植物乳桿菌Q7，產(chǎn)生一種新穎的植物乳桿菌素Q7，不僅能夠抑制熒光假單胞菌AS1.1802的生長(zhǎng)繁殖，同時(shí)對(duì)惡臭假單胞菌AS1.1819、銅綠假單胞菌CICC21636等有良好的抑制作用。Vaz-Velho等[13]從水產(chǎn)品腸道中分離得到的Carnobacterium divergens V41使單增李斯特菌降低了1 個(gè)對(duì)數(shù)值。目前，一些乳酸菌產(chǎn)代謝產(chǎn)物和抑菌制劑已應(yīng)用于食品防腐和動(dòng)物飼料[14-17]，但是現(xiàn)已有的乳酸菌產(chǎn)有效抑菌代謝產(chǎn)物的量普遍較低，抑菌效果有限。從海產(chǎn)品腸道中Carnobacterium最適生長(zhǎng)溫度相對(duì)較低[18-19]，協(xié)同低溫貯藏保鮮水產(chǎn)品，對(duì)水產(chǎn)品中的條件優(yōu)勢(shì)腐敗菌會(huì)有更好的抑菌效果，因此優(yōu)化培養(yǎng)從環(huán)境中所篩選得到的菌株以應(yīng)用的水產(chǎn)品低溫貯運(yùn)是相對(duì)有效可行的方法。

本研究以從帶魚(yú)腸道中篩選得到的抑菌效果最明顯的Carnobacterium spp. LB1作為供試菌，做后續(xù)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，為提升其抑菌效果，以本實(shí)驗(yàn)室保藏的熒光假單胞菌作為指示菌，采用微量法通過(guò)單因素試驗(yàn)初篩顯著影響因素，采用響應(yīng)面法的Box-Behnken設(shè)計(jì)對(duì)顯著影響因素的重要水平和交互作用進(jìn)行研究和分析，以確定Carnobacterium spp. LB1抑菌性最優(yōu)的培養(yǎng)發(fā)酵條件和營(yíng)養(yǎng)成分，提高其抑菌效果，為其在水產(chǎn)品保鮮上的研究和使用提供一定的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株

菌株Carnobacterium spp. LB1為帶魚(yú)腸道中獲取；熒光假單胞菌為上海海洋大學(xué)上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心保存。

1.2 培養(yǎng)基與試劑

胰酪胨大豆瓊脂培養(yǎng)基（soybean-casein digest agar，TSA）、胰酪胨大豆肉湯（trypticase soy broth，TSB）培養(yǎng)基、腦心浸液肉湯（brain heart influsion，BHI）培養(yǎng)基、含0.6%酵母膏的胰酪胨大豆肉湯（trypticase soybrothyeast extract，TSB-YE）培養(yǎng)基青島海博生物技術(shù)有限公司；葡萄糖、蔗糖、果糖、尿素、酵母膏、氯化銨 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；堿性磷酸酶（alkaline phosphomonoestesase，AKP）試劑盒 南京建成生物工程研究所。

1.3 方法

1.3.1 預(yù)處理

指示菌的活化：將本實(shí)驗(yàn)室－80 ℃保藏的熒光假單胞菌（P.uorescens）在TSA固體培養(yǎng)基上劃線，37 ℃培養(yǎng)48 h，挑單菌落于液體培養(yǎng)基37 ℃過(guò)夜搖床培養(yǎng)，活化傳代培養(yǎng)3～4 次。

供試菌的活化：將－80 ℃保藏菌株Carnobacterium spp. LB1在TSA固體培養(yǎng)基上劃線，挑單菌落接種到BHI液體培養(yǎng)基中，30 ℃靜置培養(yǎng)24 h，反復(fù)傳代接種培養(yǎng)3～4 次。

濃縮發(fā)酵液的獲?。簩⒒罨腃arnobacterium spp. LB1接種到TSB-YE液體培養(yǎng)基中，靜置培養(yǎng)一定時(shí)間，10 000 r/min離心15 min，用0.22 μm的微孔濾膜過(guò)濾去除菌體，置于－80 ℃冰箱中冷凍12 h，經(jīng)真空冷凍干燥得10 倍濃縮發(fā)酵液[20]，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 抑菌性物質(zhì)的單因素試驗(yàn)

微量法測(cè)抑菌性物質(zhì)的抑菌率[21]。無(wú)菌條件下，在96微孔板上添加100 μL的指示菌菌懸液，取100 μL濃縮發(fā)酵液添加到含有100 μL指示菌菌懸液的96 孔板上，以添加同體積的無(wú)菌水的孔作為空白對(duì)照，以添加100 μL濃縮發(fā)酵液的100 μL無(wú)菌液體培養(yǎng)基為參比溶液，將96微孔板用保鮮膜包好以防止外界污染。包好的96 孔板置于37 ℃搖床培養(yǎng)，每間隔3 h用酶標(biāo)儀在600 nm波長(zhǎng)處測(cè)定并記錄菌懸液的吸光度，按照下式計(jì)算抑菌率：

式中：A樣品為濃縮發(fā)酵液、指示菌菌懸液混合后的吸光度；A參比為濃縮發(fā)酵液、無(wú)菌液體培養(yǎng)基混合后的吸光度；A空白為無(wú)菌水、指示菌菌懸液混合后的吸光度。

1.3.2.1 培養(yǎng)溫度對(duì)抑菌率的影響

將活化后傳代培養(yǎng)2 次的Carnobacterium spp. LB1接種TSB-YE液體培養(yǎng)基中，在25、30、37 ℃條件下靜置培養(yǎng)36 h，采用微量法以P. fluorescens為指示菌檢測(cè)不同培養(yǎng)溫度對(duì)抑菌率的影響。

1.3.2.2 初始pH值對(duì)抑菌率的影響

調(diào)節(jié)TSB-YE的初始pH值為5.0、5.5、6.0、6.5、7.0，將活化后的肉食桿菌接種到不同pH值液體培養(yǎng)基中，在最適溫度下靜置培養(yǎng)，得到濃縮發(fā)酵液。采用微量法以P.uorescens為指示菌檢測(cè)不同初始pH值對(duì)抑菌率的影響。

1.3.2.3 接種量對(duì)抑菌率的影響

將活化后傳代培養(yǎng)兩次的Carnobacterium spp. LB1以1%、2%、3%、4%、5%的接種量接種TSB-YE液體培養(yǎng)基中，根據(jù)以上試驗(yàn)結(jié)果，在最佳的初始pH值和溫度下靜置培養(yǎng)，得到濃縮發(fā)酵液，采用微量法以P.uorescens為指示菌檢測(cè)不同接種量對(duì)抑菌率的影響。

1.3.2.4 碳源對(duì)抑菌率的影響

取葡萄糖、果糖、蔗糖添加到TSB-YE液體培養(yǎng)基中，使其終質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%，采用微量法抑菌實(shí)驗(yàn)以獲取抑菌效果最好的碳源，以P.uorescens為指示菌采用微量法從1%、2%、3%、4%和5%中篩選最佳碳源的最優(yōu)終質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

1.3.2.5 氮源對(duì)抑菌率的影響

取尿素、酵母膏、氯化銨添加到TSB-YE液體培養(yǎng)基中，使其終質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%，采用微量法抑菌實(shí)驗(yàn)以獲取抑菌效果最好的氮源，以P.uorescens為指示菌采用微量法從1%、2%、3%、4%和5%中篩選最佳氮源的最優(yōu)終質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

1.3.3 響應(yīng)面法和數(shù)據(jù)分析

根據(jù)單因素水平試驗(yàn)結(jié)果，最終優(yōu)選出3 個(gè)主要影響因素，進(jìn)而確定數(shù)值范圍。按照響應(yīng)面試驗(yàn)的Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案進(jìn)行。

1.3.4 最佳抑菌效果優(yōu)化結(jié)果驗(yàn)證和濃縮發(fā)酵液抑菌特性初步分析

1.3.4.1 對(duì)細(xì)胞膜通透性的影響

將P. fluorescens于37 ℃條件下?lián)u床培養(yǎng)，取適量菌液，加入一定量的濃縮發(fā)酵液，用蒸餾水代替發(fā)酵液作為對(duì)照組，分別于0、2、4、6、8、10、12 h測(cè)定培養(yǎng)液的電導(dǎo)率值，從而確定金屬離子的滲出變化趨勢(shì)。

1.3.4.2 對(duì)細(xì)菌菌體內(nèi)AKP酶的影響

活化得到P.uorescens菌懸液，加入濃縮發(fā)酵液。使用搖床將其置于37 ℃條件下培養(yǎng)16～18 h，對(duì)照組不添加保鮮劑，空白為未接種的培養(yǎng)液。分別于0、2、4、6、8、10、12 h取上清液，按照ATP酶測(cè)試試劑盒中操作說(shuō)明進(jìn)行測(cè)試。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同培養(yǎng)發(fā)酵條件對(duì)Carnobacterium spp. LB1抑菌活性的影響

由圖1a可知，在溫度為30 ℃時(shí)，其所得到的發(fā)酵液在15 h和18 h時(shí)的抑菌率相比對(duì)照組較高，這與Sip等[19]抑菌研究培養(yǎng)發(fā)酵條件一致。當(dāng)初始pH值為6.5時(shí)，得到的濃縮發(fā)酵液對(duì)P. fluorescens的抑菌率達(dá)到最大，15 h的抑菌率達(dá)到93%，18 h為89%，初始pH值影響了發(fā)酵液中有效抑菌產(chǎn)物的產(chǎn)生[22]，也有一些研究表示pH值對(duì)乳酸菌的抑菌能力影響不大，只是和接種量呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)[19]。當(dāng)接種量小于3%時(shí)，抑菌活性隨著接種量的增加而加強(qiáng)，接種量為3%時(shí)抑菌活性最強(qiáng)，當(dāng)接種量大于3%時(shí)，抑菌活性隨著接種量的增加而降低，后續(xù)實(shí)驗(yàn)采用接種量3%作為Carnobacterium spp. LB1的培養(yǎng)發(fā)酵條件。

圖 1 溫度（a）、初始pH值（b）、接種量（c）對(duì)Carnobacteriumspp. LB1抑菌能力的影響Fig. 1 Effect of temperature (a), initial pH (b), inoculum amount (c) on antimicrobial activity of fermentation broth of Carnobacterium spp. LB1

2.2 不同營(yíng)養(yǎng)成分對(duì)Carnobacterium spp. LB1抑菌活性的影響。

圖 2 碳源（a、b）和氮源（c、d）對(duì)Carnobacterium spp. LB1抑菌能力的影響Fig. 2 Effects of carbon sources (a, b) and nitrogen sources (c, d) on antimicrobial activity of fermentation broth of Carnobacterium spp. LB1

如圖2所示，不同的碳源對(duì)Carnobacterium spp. LB1濃縮發(fā)酵液的抑菌效果有明顯的影響，3 種碳源之間具有明顯差異，在15 h和1 8h時(shí)的抑菌活性依次為：葡萄糖＞蔗糖＞果糖，添加葡萄糖為碳源時(shí)，得到的濃縮發(fā)酵液對(duì)P. fluorescens的抑菌率明顯高于其他碳源，葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)從1%開(kāi)始，Carnobacterium spp. LB1濃縮發(fā)酵液的抑菌活性隨著葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的升高而增大，當(dāng)葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%時(shí)出現(xiàn)峰值，此時(shí)Carnobacterium spp. LB1濃縮發(fā)酵液抑菌活性較強(qiáng)，這與楊云喜等[23]研究結(jié)果相似，其從酸菜中篩選出一株對(duì)革蘭氏陽(yáng)性和革蘭氏陰性菌都有明顯抑菌效果的植物乳酸桿菌9-4，結(jié)果表明葡萄糖是植物乳酸桿菌9-4合成抗菌肽的最優(yōu)碳源，當(dāng)葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.5%，抑菌效果出現(xiàn)峰值，達(dá)到最佳。

選擇氯化銨為氮源，當(dāng)其質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%時(shí)，其對(duì)指示菌的抑菌效果較好。這與吳大華[24]研究結(jié)果相似，1%氯化銨促進(jìn)了枯草芽孢桿菌CS27的細(xì)胞生長(zhǎng)，有效地促進(jìn)了其發(fā)酵過(guò)程中代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生。Carnobacterium spp. LB1的濃縮發(fā)酵液的抑菌活性隨著氯化銨終質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增長(zhǎng)反而降低，可能由于氯化銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)過(guò)大，在微生物利用降解過(guò)程中產(chǎn)生大量氨類物質(zhì)，導(dǎo)致培養(yǎng)液的pH值升高，不利于Carnobacterium spp. LB1的生長(zhǎng)和繁殖，導(dǎo)致Carnobacterium spp. LB1數(shù)量減少，進(jìn)而影響有效抑菌代謝物的產(chǎn)生。

2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)

2.3.1 預(yù)測(cè)模型建立及顯著性檢驗(yàn)

表 1 中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案和結(jié)果Table 1 Central composite design with experimental results

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，篩選對(duì)Carnobacterium spp. LB1的濃縮發(fā)酵液的抑菌活性有明顯影響效果的初始pH值、溫度、葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3 個(gè)顯著影響因素。采用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)，試驗(yàn)方案和結(jié)果見(jiàn)表1。通過(guò)以不同條件下得到的濃縮發(fā)酵液對(duì)P.uorescens的抑菌率為響應(yīng)值，根據(jù)表1中的試驗(yàn)數(shù)據(jù)，運(yùn)用Design Expert 8.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，對(duì)Box-Behnken設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行二次多項(xiàng)回歸擬合，建立抑菌率（Y）與初始pH值（A）、溫度（B）和葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)（C）3 個(gè)因素的多項(xiàng)回歸方程：Y=5.840+0.670A－0.390B－0.005C+0.180AB+ 0.100AC－0.210BC－0.560A2－0.580B2－0.310C2。

表 2 方差分析Table 2 Analysis of variance

對(duì)上述回歸方程進(jìn)行方差分析，結(jié)果表2所示，該模式回歸顯著（F=18.68），回歸方程的失擬性檢驗(yàn)表示不顯著（P=0.329 6＞0.05）?；貧w方程的R2Adj為0.919 1，說(shuō)明該方程能夠解釋91.91%響應(yīng)值的變化，決定系數(shù)R2為0.971 1，說(shuō)明Carnobacterium spp. LB1的有效代謝產(chǎn)物對(duì)P.uorescens的抑菌率的實(shí)測(cè)值和預(yù)測(cè)值具有良好的擬合性?；貧w方程中3 種顯著影響因素對(duì)響應(yīng)值影響的顯著程度通過(guò)檢驗(yàn)F值來(lái)判定，所對(duì)應(yīng)變量的P值和其顯著程度呈負(fù)相關(guān)，即P值越小，對(duì)應(yīng)變量的顯著程度反而越高。模型一次項(xiàng)A、B極顯著，C不顯著；交互項(xiàng)AB、AC和BC不顯著，二次項(xiàng)A2、B2極顯著，C2顯著。

由上述多項(xiàng)回歸模型得到的立體響應(yīng)面圖（圖3），分別體現(xiàn)了對(duì)Carnobacterium spp. LB1濃縮發(fā)酵液的抑菌性有明顯影響效果的3 個(gè)顯著因素兩兩之間交互作用。通過(guò)回歸方程發(fā)現(xiàn)，二次項(xiàng)系數(shù)均為負(fù)值，表示其形成的拋物面開(kāi)口朝下，具有極大值點(diǎn)。利用Design Expert 6.0軟件對(duì)Carnobacterium spp. LB1濃縮發(fā)酵液抑菌效果的3 個(gè)顯著影響因素進(jìn)一步優(yōu)化分析，所對(duì)應(yīng)的3 個(gè)顯著因素最佳條件分別為初始pH 6.22、溫度28.6 ℃、葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%，此時(shí)濃縮發(fā)酵液對(duì)指示菌的抑菌率最高，達(dá)到85.4%。根據(jù)實(shí)驗(yàn)室實(shí)際操作的方便性和方差分析結(jié)果，確定Carnobacterium spp. LB1最佳培養(yǎng)發(fā)酵條件為：初始pH 6.2、溫度28 ℃、葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%。

2.3.2 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果

以初始pH 6.2、溫度28 ℃、葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%為Carnobacterium spp. LB1發(fā)酵培養(yǎng)條件，測(cè)定Carnobacterium spp. LB1濃縮發(fā)酵液對(duì)P. fluorescens的抑菌率。濃縮發(fā)酵液對(duì)指示菌的抑菌率在15 h和18 h時(shí)的平均值分別為80.7%、86.3%。說(shuō)明上述回歸方程的擬合性良好，能夠很好地反映培養(yǎng)條件和營(yíng)養(yǎng)成分對(duì)Carnobacterium spp. LB1濃縮發(fā)酵液抑菌活性的影響。

2.4 Carnobacterium spp. LB1濃縮發(fā)酵液對(duì)P.uorescens的抑菌機(jī)理研究

圖 4 濃縮發(fā)酵液對(duì)熒光假單胞菌菌液電導(dǎo)率的影響Fig. 4 Effects of concentrated fermentation broth of Carnobacterium spp. LB1 on electric conductivity of P.uorescens cell suspension

2.4.1 對(duì)P.uorescens細(xì)胞膜通透性的影響結(jié)果當(dāng)微生物細(xì)胞膜因?yàn)橥饨绮焕h(huán)境或者抑菌劑而遭到破壞時(shí)，其胞內(nèi)電解質(zhì)如Na+、K+等離子會(huì)大量漏出，滲入到培養(yǎng)液中，導(dǎo)致培養(yǎng)液的電導(dǎo)率升高。因此，通過(guò)監(jiān)測(cè)培養(yǎng)液的電導(dǎo)率的變化可以間接反映細(xì)胞膜通透性的變化狀況[25-27]。以P. fluorescens為指示菌，由圖4可知，濃縮發(fā)酵液處理的實(shí)驗(yàn)組的電導(dǎo)率明顯高于對(duì)照組，說(shuō)明Carnobacterium spp. LB1濃縮發(fā)酵液對(duì)熒光假單胞菌的影響作用較大，破壞其細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，使其通透性增大，造成大量電解質(zhì)外滲。6 h時(shí)，實(shí)驗(yàn)組達(dá)到最大（17.84 mS/cm），之后略有降低，可能由于隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，濃縮發(fā)酵液濃度降低等因素條件，對(duì)細(xì)胞膜的破壞作用有限，在靜電作用下，使菌液中其他金屬離子和細(xì)胞膜結(jié)合，從而導(dǎo)致菌液電導(dǎo)率略有降低[20]。

2.4.2 對(duì)P.uorescens菌體內(nèi)AKP的影響

圖 5 濃縮發(fā)酵液對(duì)熒光假單胞菌AKP酶活力的影響Fig. 5 Effect of concentrated fermentation broth of Carnobacterium spp. LB1 on AKP activity in P.uorescens

AKP是存在于細(xì)菌細(xì)胞膜和細(xì)胞壁之間的一種非特異性磷酸單酯酶，在細(xì)菌代謝過(guò)程中起到至關(guān)重要的作用[28]。微生物正常生長(zhǎng)狀態(tài)下測(cè)得細(xì)菌內(nèi)AKP難度很大，但當(dāng)細(xì)菌細(xì)胞壁由于外界因素破損，胞體通透性增大，AKP大量滲透到胞外，因此，通過(guò)測(cè)定培養(yǎng)液中AKP的變化可以很好反映菌體細(xì)菌壁通透性的變化情況[29]。由圖5可知，經(jīng)Carnobacterium spp. LB1濃縮發(fā)酵液處理后的熒光假單胞菌菌液的AKP含量從第2上升速率達(dá)最快，之后上升幅度緩慢，6 h后呈現(xiàn)平穩(wěn)趨勢(shì)。而對(duì)照組從0～12 h始終處于低AKP含量的平穩(wěn)增長(zhǎng)趨勢(shì)。Carnobacterium spp. LB1濃縮發(fā)酵液破環(huán)P. fluorescens的胞體完整性，使大量AKP溢出，導(dǎo)致細(xì)胞的代謝循環(huán)受阻，從而抑制P.uorescens的生長(zhǎng)。

3 結(jié) 論

單因素試驗(yàn)初步優(yōu)化培養(yǎng)發(fā)酵條件和營(yíng)養(yǎng)成分結(jié)果：Carnobac terium spp. LB1的最佳接種量3%、最佳初始pH 6.5，最佳培養(yǎng)溫度30 ℃、最佳碳源為3%葡萄糖、最佳氮源為1%無(wú)機(jī)氮。

在單因素試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上，選取對(duì)Carnobacterium spp. LB1的抑菌效果有明顯效果的初始pH值、溫度和葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)作為3 個(gè)顯著影響因素。采用微量法以P.uorescens為指示菌利用Design expert 6.0軟件處理Box-Behnken設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果，建立了抑菌率同初始pH值、溫度和葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)3 個(gè)顯著因素的二次多項(xiàng)回歸方程，經(jīng)驗(yàn)證后該模型可靠。

確定Carnobacterium spp. LB1的最佳培養(yǎng)發(fā)酵條件為：初始pH 6.22、溫度28.6 ℃、葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%，此時(shí)得到的濃縮發(fā)酵液對(duì)指示菌的抑菌率最高，達(dá)到85.4%。考慮到實(shí)驗(yàn)室實(shí)際操作的方便性和方差分析結(jié)果，確定Carnobacterium spp. LB1最佳培養(yǎng)發(fā)酵條件為：初始pH 6.2、溫度28 ℃、葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)時(shí)，Carnobacterium spp. LB1在最佳發(fā)酵條件下獲得的濃縮發(fā)酵液，對(duì)指示菌在15 h和18 h時(shí)的抑菌率的平均值分別為80.7%、86.3%。

在最佳發(fā)酵培養(yǎng)條件獲得的Carnobacterium spp. LB1濃縮發(fā)酵液，能夠破壞P. fluorescens的細(xì)胞膜，菌體內(nèi)AKP大量溢出，濃縮發(fā)酵液剛加入時(shí)，增大速率較大，6 h后呈平穩(wěn)趨勢(shì)，此時(shí)，P.uorescens細(xì)胞通透性達(dá)到最大，導(dǎo)致胞內(nèi)電解質(zhì)大量漏出，導(dǎo)致其代謝紊亂，抑制P.uorescens的生長(zhǎng)和繁殖。

[1] 張偉瓊, 聶明, 肖明. 熒光假單胞菌生防機(jī)理的研究進(jìn)展[J]. 生物學(xué)雜志, 2007, 24(3): 9-11. DOI:10.3969/j.issn.2095-1736.2007.03.003.

[2] 藍(lán)蔚青, 謝晶, 周會(huì), 等. 不同時(shí)期鯧魚(yú)冷藏期間優(yōu)勢(shì)腐敗菌的多樣性變化[J]. 食品科學(xué), 2015, 36(2): 226-231. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201502044.

[3] 高琳, 陳萬(wàn)義, 任婧. 食品中熒光假單胞菌的危害及其快速檢測(cè)方法研究進(jìn)展[J]. 食品工業(yè)科技, 2015, 36(16): 373-377. DOI:10.13386/j.issn1002-0306.2015.16.068.

[4] 王玲. 大西洋鮭熒光假單胞菌感染癥的病原學(xué)及病理學(xué)研究[D].雅安: 四川農(nóng)業(yè)大學(xué), 2010: 8-11.

[5] 繆璐歡, 杜靜芳, 馬歡歡, 等. 淡水魚(yú)腸道中抗大腸桿菌O157:H7乳酸菌的篩選及抑菌作用研究[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè), 2015, 41(10): 7-13. DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201510002.

[6] BARBOSA M D S, TODOROV S D, IVANOVA I, et al. Improving safety of salami by application of bacteriocins produced by an autochthonous Lactobacillus curvatus isolate[J]. Food Microbiology, 2015, 46: 254-262. DOI:10.1016/j.fm.2014.08.004.

[7] MALHEIROS P S, CUCCOVIA I M, FRANCO B D G M. Inhibition of Listeria monocytogenes in vitro and in goat milk by liposomal nanovesicles containing bacteriocins produced by Lactobacillus sakei subsp. sakei 2a[J]. Food Control, 2015, 63: 158-164. DOI:10.1016/ j.foodcont.2015.11.037.

[8] 呂欣然, 李瑩, 馬歡歡, 等. 遼西傳統(tǒng)發(fā)酵食品中抗單增李斯特菌乳酸菌的篩選與鑒定[J]. 食品工業(yè)科技, 2016, 37(3): 143-148. DOI:10.13386/j.issn1002-0306.2016.03.022.

[9] 繆璐歡, 杜靜芳, 馬歡歡, 等. 淡水魚(yú)腸道中抗芽孢桿菌性乳酸菌的篩選與鑒定[J]. 食品工業(yè)科技, 2015, 36(16): 188-192. DOI:10.13386/j.issn1002-0306.2015.16.030.

[10] 傅容輝, 張曉霞, 梁運(yùn)祥. 生物保鮮乳酸菌的篩選及 抑菌物質(zhì)性質(zhì)的初步研究[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè), 2007, 33(11): 72-74.

[11] 高鵬, 韓金志, 陸兆新, 等. 廣譜抗菌乳酸菌的分離鑒定及細(xì)菌素的提取和純化[J]. 食品科學(xué), 2016, 37(11): 160-166. DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201611028.

[12] LIU H, ZHANG L, Yi H, et al. Identification and characteriz ation of plantaricin Q7, a novel plantaricin produced by Lactobacillus plantarum Q7[J]. LWT-Food Science and Technology, 2016, 71: 386-390. DOI:10.1016/j.lwt.2016.04.009.

[13] VAZ-VELHO M, TODOROV S, RIBEIRO J, et al. Growth control of Listeria innocua 2030c during processing and storage of coldsmoked salmon-trout by Carnobacterium divergens V41 culture and supernatant[J]. Food Control, 2005, 16(6): 540-548. DOI:10.1016/ j.foodcont.2004.05.012.

[14] 馬美湖, 婁愛(ài)華, 葛長(zhǎng)榮, 等. 冷卻肉生產(chǎn)中保鮮技術(shù)的研究: 溶菌酶、Nisin、山梨酸鉀保鮮正交試驗(yàn)[J]. 食品科學(xué), 2005, 3: 235-243. DOI:10.3321/j.issn:1002-6630.2003.04.017.

[15] KAKATKAR A S, GAUTAM R K, SHASHIDHAR R. Combination of glazing, nisin treatment and radiation processing for shelflife extension of seer fish (Scomberomorous guttatus) steaks[J]. Radiation Physics and Chemistry, 2016, 130: 303-305. DOI:10.1016/ j.rad physchem.2016.09.017.

[16] 羅欣, 朱燕. Nisin在牛肉冷卻肉保鮮中的應(yīng)用研究[J]. 食品科學(xué), 2000, 21(3): 53-57. DOI:10.3321/j.issn:1002-6630.2000.03.021.

[17] LI C, BLENCKE H M, Smith L C, et al. Two recombinant peptides, SpStrongylocins 1 and 2, from Strongylocentrotus pu rpuratus, show antimicrobial activity against Gram-positive and Gram-negative bacteria[J]. Developmental and Comparative Immunology, 2010, 34(3): 286-292. DOI:10.1016/j.dci.2009.10.006.

[18] HAMMES W P, HERTEL C. The Genera Lactobacillus, and Carnobacterium[M]. Berlin: Springer, 2006: 320-403.

[19] SIP A, GRAJEK W, BOYAVAL P. Enhancement of bacteriocin production by Carnobacterium divergens AS7 in the presence of a bacteriocinsensitive strain Carnobacterium piscicola[J]. International Journal of Food Microbiology, 1998, 42(1/2): 63-69. DOI:10.1016/S0168-1605(98)00062-2.

[20] 李院, 魏新元, 王靜, 等. 抑制青霉菌乳酸菌的分離、鑒定及抑菌物質(zhì)分析[J]. 食品科學(xué), 2015, 36(21): 150-155. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201521029.

[21] 倪文杰. 山西老陳醋類黑精的抑菌作用研究[D]. 太原: 山西大學(xué), 2015: 9-11.

[22] MIAO J Y, XU M B, GUO H X, et al. Optimization of culture conditions for the production of antimicrobial substances by probiotic Lactobacillus paracasei subsp. tolerans FX-6[J]. Journal of Functional Foods, 2015, 18: 244-253. DOI:10.1016/j.jff.2015.07.011.

[23] 楊云喜, 李佩, 徐岳松, 等. 產(chǎn)抗菌肽乳酸菌的分離、鑒定及培養(yǎng)條件優(yōu)化[J]. 應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào), 2014, 20(5): 817-824.

[24] 吳大華. 枯草芽孢桿菌CS27高密度培養(yǎng)及保藏研究[D]. 福州: 福建農(nóng)林大學(xué), 2011: 37-54.

[25] 錢麗紅, 陶妍, 謝晶. 茶多酚對(duì)金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌的抑菌機(jī)理[J]. 微生物學(xué)通報(bào), 2010, 37(11): 1628-1633.

[26] 寧初光, 楊洋, 吳小勇. 電導(dǎo)率法快速檢測(cè)食品細(xì)菌總數(shù)的研究[J]. 現(xiàn)代食品科技, 2012, 28(2): 237-240. DOI:10.3969/j.issn.1673-9078.2012.02.027.

[27] 謝麗, 孫瑞珠, 馬玉龍. 應(yīng)用電導(dǎo)率儀測(cè)定微生物生物量的研究[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué), 2011, 39(31): 19048-19050. DOI:10.3969/ j.issn.0517-6611.2011.31.007.

[28] 王秋穎. 堿性磷酸酶特性及其應(yīng)用的研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)畜牧獸醫(yī), 2011, 38(1): 157-161.

[29] KARA S, YAMAKAWA M. Moricin, a novel type of antibacterial peptide isolated from the silkworm, Bombyx mori[J]. The Journal of Biological Chemistry, 1995, 270(50): 29923-29927. DOI:10.1074/jbc.270.50.29923.

Optimization of Culture Conditions of Carnobacterium spp. LB1 for Enhanced Production of Anti-Pseudomonasuorescens Metabolites

DONG Hanbo, XIE Jing*, QIAN Yunfang, YANG Shengping, GOU Yi
(Shanghai Engineering Research Center of Aquatic Product Processing and Preservation, College of Food Science and Technology, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China)

This study aimed to optimize the culture conditions for Carnobacterium spp. LB1, isolated from the ribbon sh intestine, to produce anti-Pseudomonas fluorescens metabolites. By using one-factor-at-a-time method, three of the five factors were selected for their significant influences on the antibacterial activity. A Box-Behnken design was applied to evaluate the effects of interaction among the chosen variables and optimize them. The optimum culture conditions obtained were as follows: initial pH, 6.22; temperature, 28.6 ℃; and glucose concentration, 3%, where the percentage inhibition of concentrated fermentation broth harvested after 15 and 18 h against Pseudomonasuorescens were 80.7% and 86.3%, respectively. The antibacterial mechanism was due to increased cell wall permeability and leakage of a large amount of alkaline phosphatase (AKP) after the destruction of the cell wall of Pseudomonasuorescens, leading to metabolic disorders. Finally, the experimental results obtained under the optimized fermentation conditions were in good agreement with the model predictions, indicating that the established model in this study was feasible.

Carnobacterium spp. LB1; Pseudomonasuorescens; antibacterial activity; response surface methodology

10.7506/spkx1002-6630-201710010

Q93-331

A

1002-6630（2017）10-0055-06

董韓博, 謝晶, 錢韻芳, 等. 抗熒光假單胞菌Carnobacterium spp. LB1培養(yǎng)發(fā)酵條件的優(yōu)化[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(10): 55-60. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201710010. http://www.spkx.net.cn

DONG Hanbo, XIE Jing, QIAN Yunfang, et al. Optimization of culture conditions of Carnobacterium spp. LB1 for enhanced production of anti-Pseudomonas fluorescens metabolites[J]. Food Science, 2017, 38(10): 55-60. (in Chinese with English abstract)

10.7506/spkx1002-6630-201710010. http://www.spkx.net.cn

2016-09-03

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（31571914）；上海市科技興農(nóng)重點(diǎn)攻關(guān)項(xiàng)目（滬農(nóng)科攻字（2016）第1-1號(hào)）；上海市科委平臺(tái)能力提升項(xiàng)目（16DZ2280300）

董韓博（1991—），男，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称房茖W(xué)與工程。E-mail：donghanbo2015@163.com

*通信作者：謝晶（1968—），女，教授，博士，研究方向?yàn)槭称饭こ?。E-mail：jxie@shou.edu.cn

肉食桿菌；熒光假單胞菌；抑菌；響應(yīng)面