王 軍，陳希穎，劉雯蓓，常小麗，何彩鳳，季必華

(皖南醫(yī)學(xué)院弋磯山醫(yī)院皮膚性病科，安徽蕪湖 241000)

論著·臨床研究

血小板源性生長因子B及受體α mRNA在復(fù)發(fā)性尖銳濕疣皮損中的表達(dá)與意義*

王 軍，陳希穎，劉雯蓓，常小麗，何彩鳳，季必華

(皖南醫(yī)學(xué)院弋磯山醫(yī)院皮膚性病科，安徽蕪湖 241000)

目的 研究血小板源性生長因子B(PDGF-B)及其受體α(PDGFR-α) mRNA在復(fù)發(fā)性尖銳濕疣皮損中的表達(dá)及意義。方法 采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測復(fù)發(fā)性、未復(fù)發(fā)性尖銳濕疣皮損和正常皮膚中PDGF-B及PDGFR-α mRNA表達(dá)水平。結(jié)果 尖銳濕疣復(fù)發(fā)組、未復(fù)發(fā)組的PDGF-B和PDGFR-α mRNA表達(dá)水平均明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；復(fù)發(fā)組PDGF-B和PDGFR-α mRNA表達(dá)水平高于未復(fù)發(fā)組，復(fù)發(fā)組治療前PDGF-B和PDGFR-α mRNA水平高于治療后(P<0.01)。結(jié)論 PDGF-B和PDGFR-α mRNA可能與尖銳濕疣的復(fù)發(fā)有一定的關(guān)系。

尖銳濕疣；生長因子；血小板源性；受體；實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)

血小板源性生長因子B(platelet-derived growth factor-B，PDGF-B)及受體α(PDGFR-α)屬于血小板源性生長因子及受體家族，二者結(jié)合后通過磷酸化促進(jìn)細(xì)胞的生長和分裂[1-2]，刺激細(xì)胞增殖和血管增生以實(shí)現(xiàn)腫瘤組織的生長。尖銳濕疣(condyloma acuminatum，CA)是皮膚性病科的常見疾病，目前無特殊有效的治療方法，臨床上易復(fù)發(fā)，并有惡變的可能。本研究通過實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)來檢測PDGF-B、PDGFR-α mRNA在初發(fā)和復(fù)發(fā)CA皮損以及對(duì)照組織中的表達(dá)水平，并分析PDGF-B、PDGFR-α mRNA與復(fù)發(fā)性CA之間的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 將2012年3月至2014年4月本院門診收治的46例CA患者作為試驗(yàn)組，均具有典型皮損，并經(jīng)醋酸白實(shí)驗(yàn)證實(shí)，部分病例經(jīng)皮膚病理確診，取材時(shí)患者均未接受任何治療(包括免疫調(diào)節(jié)劑和糖皮質(zhì)激素)，其中男28例，女21例；年齡22～72歲，平均29歲；病程6～38 d，平均14.5 d。男性患者皮損位于包皮、龜頭、冠狀溝16例，肛周7例，其他5例；女性患者皮損位于外陰、陰道口19例，其他2例。隨機(jī)選取20例泌尿外科手術(shù)切除包皮的健康成年男性作為對(duì)照組，年齡18～58歲，平均26.7歲，無其他疾病和服藥史者。該研究獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)通過和患者知情同意。對(duì)CA患者給予二氧化碳激光去除疣體，同時(shí)口服胸腺肽膠囊10 mg，每天3次，共服用28 d，臨床觀察3個(gè)月；隨訪觀察期內(nèi)如有新皮損出現(xiàn)，歸為復(fù)發(fā)組，同時(shí)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測PDGF-B及受體α的基因，未復(fù)發(fā)的歸為未復(fù)發(fā)組。

1.2 儀器與試劑 PDGF-B、PDGFR-α濃縮型兔抗人多克隆抗體(福州邁新生物技術(shù)有限公司),RNA提取試劑盒購自Qiagen公司,Real Time qRT-PCR 試劑盒購自大連寶生物工程有限公司,PDGF-B、PDGFR-α、β-actin引物均由上海賽百盛公司合成。PCR 擴(kuò)增儀為Roche Light Cycler 480-Ⅱ，紫外分光光度計(jì)為日本島津公司產(chǎn)品(UV-3200)。

1.3 方法

1.3.1 取材 按標(biāo)準(zhǔn)采集初發(fā)CA及復(fù)發(fā)CA皮損及健康人包皮組織標(biāo)本，放入密封無菌保存管中，置于液氮罐中保存。

1.3.2 總RNA提取與定量 在液氮速凍條件下將標(biāo)本組織磨成粉末，趁液氮尚未揮發(fā)光時(shí)，把組織粉末轉(zhuǎn)移到1.5 mL eppendorf管中,使用RNeasy Mini Kit試劑盒，按照操作說明書提取總RNA。紫外分光光度計(jì)測定提取總RNA濃度,A260/A280比值為1.8～2.0,-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 cDNA的合成 取 500 ng總RNA 在25 μL反應(yīng)體系中逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,該反應(yīng)體系組成如下:10×RT 緩沖液 5 μL,oligo dT(18) 1 μL,dNTP 3 μL,RNAse Inhibitor 1 μL,M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶1 μL,加入DEPC處理水至25 μL。70 ℃預(yù)變性 5 min,42 ℃孵育 60 min,-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 PCR 反應(yīng) 按試劑盒操作程序進(jìn)行。反應(yīng)體系為20 μL，包括cDNA 2 μL，SYBR green Premix Ex TaqⅡ 10 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各0.8 μL。目的基因PDGF-B:上游5′-CCC AGC AGC TCA AGA AGA AAA-3′，下游5′-CAA AGA GCG ACC CCA TCA GT-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物片段長度110 bp；目的基因PDGFR-α:上游5′-TGC TAT CGG CAG ATG ATG CT-3′，下游5′-GGC CAA TCT GGC TCA GTC TTC-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物片段長度140 bp；內(nèi)參照基因β-actin:上游5′-CTA CAA TGA GCT GCG TGT GGC-3′，下游5′-CAG GTC CAG ACG CAG GAT GGC-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物片段長度245 bp。反應(yīng)條件:預(yù)變性 95 ℃ 30 s,95 ℃ 5 s,60 ℃ 35 s,40個(gè)循環(huán)。融解曲線分析為95 ℃ 15 s,60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s。

1.3.5 結(jié)果判定 采用Relative Quantification檢測模式軟件分析結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1 CA復(fù)發(fā)情況 46例CA患者，復(fù)發(fā)組有30例，復(fù)發(fā)率為65%，復(fù)發(fā)時(shí)間為11～75 d，平均(24.7±14.1)d，未復(fù)發(fā)組16例。

2.2 PDGF-B mRNA及PDGFR-α mRNA的表達(dá) PDGF-B mRNA和PDGFR-α mRNA在CA復(fù)發(fā)組、未復(fù)發(fā)組、對(duì)照組的表達(dá)水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，且兩兩組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。CA復(fù)發(fā)組和未復(fù)發(fā)組均明顯高于對(duì)照組PDGF-B mRNA和PDGFR-α mRNA的表達(dá)水平，見表1。

表1 3組PDGF-B和PDGFR-α mRNA表達(dá)水平比較

2.3 CA復(fù)發(fā)組治療前后PDGF-B mRNA、PDGFR-α mRNA的表達(dá) 治療前PDGF-B mRNA和PDGFR-α mRNA水平均高于治療后(t=7.30、6.07，P<0.01)，見表2。

表2 CA復(fù)發(fā)組治療前后PDGF-B、PDGFR-αmRNA表達(dá)水平

3 討 論

尖銳濕疣是一種由人類乳頭瘤病毒(human papilloma virus，HPV)引起的常見而頑固的性傳播疾病，潛伏期一般為2周至8個(gè)月，平均為3個(gè)月，且CA復(fù)發(fā)率高達(dá)50%以上[3]。目前研究表明CA的復(fù)發(fā)可能和患者的細(xì)胞免疫狀態(tài)、亞臨床感染、治療不徹底、CA患者不良的生活狀態(tài)以及合并其他性病等因素有關(guān)[4]。

血小板源性生長因子(PDGF)屬于血管內(nèi)皮生長因子家族，由 A、B、C、D 4條多肽鏈通過二硫鍵連接而形成同型或異型二聚體，組成血小板源性生長因子家族(PDGFs)。其中PDGF-B鏈編碼基因位于第22號(hào)染色體，現(xiàn)已有研究發(fā)現(xiàn)該基因與原癌基因C-sis具有很同源性，其純合二聚體PDGF-BB具有很強(qiáng)的促有絲分裂的作用。PDGFR-α是PDGF靶細(xì)胞上的特異性受體，與PDGF結(jié)合后可使其發(fā)生二聚化，激發(fā)酪氨酸激酶的活性，從而使PDGFR發(fā)生自磷酸化[5]，繼而激活下游的細(xì)胞內(nèi)分子，改變細(xì)胞RNA含量，促進(jìn)細(xì)胞的生長和分裂[1-2]，表現(xiàn)為血管增生和細(xì)胞增殖。部分研究還表明二者結(jié)合后以PDGF-B/PDGFR-α的形式形成自分泌刺激環(huán)的方式[6]，通過一系列級(jí)聯(lián)的方式，實(shí)現(xiàn)強(qiáng)的有絲分裂原的作用，而刺激細(xì)胞增殖和血管增生以實(shí)現(xiàn)腫瘤組織的生長[7]。 目前已經(jīng)有PDGF及受體的抑制劑生產(chǎn)出來，如伊馬替尼、尼羅替尼、巴菲替尼等，這些藥物屬于PDGFR酪氨酸激酶抑制劑，對(duì)PDGFR具有選擇性，能抑制血管的生成，已經(jīng)被批準(zhǔn)用于治療胃腸道腫瘤和血液系統(tǒng)腫瘤[8-10]，并取得一定的效果。

本課題組前期研究使用免疫組化的方法，定性地對(duì)總的PDGF及其受體α、β與CA的關(guān)系進(jìn)行了闡述，表明在CA組織中PDGF及受體的陽性表達(dá)程度明顯增強(qiáng)[11]。本研究對(duì)CA復(fù)發(fā)組、未復(fù)發(fā)組和對(duì)照組皮損中PDGF-B及其受體α mRNA水平進(jìn)行檢測,發(fā)現(xiàn)PDGF-B及其受體α mRNA在復(fù)發(fā)組中的表達(dá)明顯高于未復(fù)發(fā)組和對(duì)照組，推測PDGF-B及受體α與CA的復(fù)發(fā)有一定的關(guān)聯(lián)；PDGF-B及其受體α mRNA在初發(fā)CA皮損中的表達(dá)明顯高于對(duì)照組，提示PDGF-B及其受體α可能參與了CA皮損的發(fā)生和發(fā)展，這和筆者前期的研究一致；在CA患者的隨訪期結(jié)束后，在CA復(fù)發(fā)組中對(duì)治療前后皮損PDGF-B及受體α基因的mRNA表達(dá)水平進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，二者之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這是否與患者使用胸腺肽口服治療有關(guān)，尚不能確定，需要擴(kuò)大樣本進(jìn)行進(jìn)一步研究。

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Expression and significance of platelet derived growth factor B and its receptors α in skin lesions of recurrent condyloma acuminatum*

Wang Jun,Chen Xiyin,Liu Wenbei,Chang Xiaoli,He Caifeng,Ji Bihua

(Department of Dermatology,Yijishan Hospital of Wannan Medical College,Wuhu,Anhui 241000,China)

[Abstract] Objective To investigate the expression of platelet-derived growth factor B(PDGF-B) and PDGFR-α mRNA in the skin lesion of recurrent condyloma acuminatum(CA) and to explore its relationship with recurrent condyloma acuminatum.Methods The expressions of PDGF-B and PDGFR-α mRNA in the lesions of recurrent CA and Nonrecurrent CA were investigated by Real-Time-PCR,and the normal foreskins were taken as controls.Results The PDGF-B and PDGFR-α mRNA levels in the recurrent CA group and non-recurrent CA group were significantly higher than those in the normal control group,the differences were statistically significant(P<0.05).The expressions of PDGF-B and PDGFR-α mRNA in the recurrent CA group were higher than those in the non-recurrent CA group(P<0.01).Furthermore,the expressions of PDGF-B and PDGFR-α mRNA before treatment in the recurrent CA group were higher than those after treatment(P<0.01).Conclusion PDGF-B and PDGFR-α mRNA might haue a certain relation with CA recurrence.

condyloma acuminatum;growth factor,platelet-derived;receptor;real-time-PCR

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.13.015

2013年度高校省級(jí)自然科學(xué)研究項(xiàng)目(KJ2013B324)。 作者簡介:王軍(1978-)，碩士，副主任醫(yī)師/副教授，主要從事性傳播疾病方面的研究。

R752.5+3

A

1671-8348(2017)13-1773-02

2016-12-01

2017-01-19)