程 斌，王軼芃，詹 佳

(武漢大學(xué)中南醫(yī)院麻醉科 430071)

論著·基礎(chǔ)研究

鹽酸戊乙奎醚上調(diào)β抑制蛋白-1與M3受體的關(guān)系研究*

程 斌，王軼芃，詹 佳△

(武漢大學(xué)中南醫(yī)院麻醉科 430071)

目的 探討在脂多糖(LPS)致肺微血管內(nèi)皮損傷中鹽酸戊乙奎醚(PHC)上調(diào)β抑制蛋白-1(β-arrestin-1)的作用與M3受體的關(guān)系。方法 M3 shRNA轉(zhuǎn)染肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞和正常肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞，分為LPS組(A)、鹽酸戊乙奎醚+LPS組(B)、LPS+M3 shRNA轉(zhuǎn)染組(C)和鹽酸戊乙奎醚+LPS+M3 shRNA轉(zhuǎn)染組(D)，激光共聚焦觀察細(xì)胞骨架變化，檢測細(xì)胞上清液中乳酸脫氫酶(LDH)水平，免疫熒光化學(xué)法檢測血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子-1(VCAM-1)蛋白表達(dá)，Western blot法和實時定量PCR法檢測β-arrestin-1表達(dá)。結(jié)果 與A組、C組比較，B組、D組肌動蛋白骨架排列整齊，LDH水平和VCAM-1蛋白表達(dá)降低，β-arrestin-1表達(dá)升高；與A組、B組相比較，C組、D組肌動蛋白骨架排列整齊，LDH水平和VCAM-1蛋白表達(dá)降低，β-arrestin-1表達(dá)無明顯改變。結(jié)論 沉默M3受體有助于降低脂多糖誘導(dǎo)的肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷。但鹽酸戊乙奎醚上調(diào)β-arrestin-1的作用與M3受體是否存在無必然聯(lián)系。

M3受體；鹽酸戊乙奎醚；β抑制蛋白-1；RNA干擾

膿毒癥是當(dāng)前急危重癥患者的主要死亡原因之一[1]。肺是此過程中最容易受到損傷的靶器官之一，主要表現(xiàn)為急性肺損傷(acute lung injury,ALI)[2]。內(nèi)毒素的重要化學(xué)成分之一是脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)，該成分也是膿毒癥、ALI的主要致病因子之一。血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷是膿毒癥急性肺損傷中的一個重要環(huán)節(jié)，脂多糖與受體結(jié)合后，可通過激活炎性細(xì)胞因子直接及間接損傷肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞，增高肺微血管通透性，最終引起急性肺損傷[3]。鹽酸戊乙奎醚注射液(Penehyclidine Hydrochloride,PHC)，商品名長托寧，由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院設(shè)計合成。β抑制蛋白(β-arrestins)是當(dāng)今生物學(xué)中信號傳導(dǎo)研究領(lǐng)域的熱點之一，是G蛋白耦聯(lián)受體通路的負(fù)調(diào)控蛋白，本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，鹽酸戊乙奎醚可上調(diào)β-arrestin-1表達(dá)，減輕膿毒癥肺損傷[4]。而鹽酸戊乙奎醚是一種M1、M3選擇性膽堿能受體阻滯劑。本研究擬通過M3受體shRNA干擾轉(zhuǎn)染人肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞，利用LPS與細(xì)胞共同孵育，模擬體外膿毒癥狀態(tài)，通過觀察鹽酸戊乙奎醚對細(xì)胞骨架變化，內(nèi)皮細(xì)胞乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)水平，血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子-1(vascular cell adhesion molecule 1,VCAM-1)蛋白表達(dá)以及β-arrestin-1表達(dá)的影響，觀察M3在LPS誘導(dǎo)的肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷中的作用，并探討鹽酸戊乙奎醚上調(diào)β-arrestin-1的作用是否與M3受體的存在有關(guān)。

1 材料與方法

1.1 材料 人肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞(美國Scien Cell公司)，RPMI 1640培養(yǎng)基(Sigma公司，美國)，鹽酸戊乙奎醚(批號：050302-1，成都力思特制藥廠)，無血清培養(yǎng)基中(Invitrogen Life Technologies公司，美國)，脂質(zhì)體2000試劑(Invitrogen Life Technologies公司,美國)，LDH試劑盒(南京建成生物工程研究所)，兔單克隆抗體IgG(Abcam公司，英國)，F(xiàn)ITC標(biāo)記山羊抗兔IgG(KPL公司，美國)，DAPI染液(碧云天公司)，抗熒光淬滅封片劑(碧云天公司)，β-arrestin-1一抗(Abcam公司，英國)和β-actin一抗(Santa Cruz公司，美國)，二抗HRP-羊抗兔IgG(KPL公司，美國)。

1.2 人肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞(human pulmonary microvascular endothelial cell，HPMVEC)體外培養(yǎng) HPMVEC用加入雙抗的10%胎牛血清RPMI 1640培養(yǎng)基，置于37 ℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天換液，相差顯微鏡下觀察，培養(yǎng)瓶中單個細(xì)胞呈梭形或多邊形，細(xì)胞株不斷生長、分化后，融合呈典型鋪路石樣排列。待細(xì)胞培養(yǎng)至80%左右融合時，吸棄培養(yǎng)液，用PBS沖洗2次。用37 ℃預(yù)溫的0.25%胰蛋白酶消化2～3 min，加3 mL培養(yǎng)基終止消化，吹打混勻成懸液，計數(shù)后按1∶2比例傳代，實驗取4～6代細(xì)胞。

1.3 分組及處理 將已長成致密單層的內(nèi)皮細(xì)胞用培養(yǎng)基稀釋成細(xì)胞懸液，以1×105個/mL的密度接種于6孔板(每孔2 mL)或培養(yǎng)瓶(每瓶4 mL)中，采用隨機(jī)數(shù)字表法將其分為4組： LPS組(A)、鹽酸戊乙奎醚+LPS組(B)、LPS+M3 shRNA轉(zhuǎn)染組(C)和鹽酸戊乙奎醚+ LPS+M3 shRNA轉(zhuǎn)染組(D)。含M3受體shRNA質(zhì)粒的構(gòu)建及轉(zhuǎn)染委托武漢谷歌生物公司完成。在50 μL的Opti-MEM無血清培養(yǎng)基中加入含M3受體shRNA的質(zhì)粒，另取50 μL Opti-MEM無血清培養(yǎng)基，加入 4.5 μL 脂質(zhì)體2000試劑，混勻后室溫靜置20 min，進(jìn)行轉(zhuǎn)染。以含M3受體shRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，孵育24 h。A組：正常細(xì)胞加入終濃度為0.1 μg/mL的LPS孵育1 h；B組：正常細(xì)胞先加入終濃度為2.0 μg/mL的鹽酸戊乙奎醚，孵育1 h時加入終濃度為0.1 μg/mL的LPS繼續(xù)孵育1 h；C組：以含M3受體 shRNA的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞24 h時加入終濃度為0.1 μg/mL的LPS孵育1 h；D組：以含M3受體 shRNA的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞24 h時加入終濃度為2.0 μg/mL的鹽酸戊乙奎醚孵育1 h后，加入終濃度為0.1 μg/mL的LPS繼續(xù)孵育1 h。

1.4 免疫雙熒光標(biāo)記-激光共聚焦顯微鏡觀察肌動蛋白骨架變化 將內(nèi)皮細(xì)胞用胰蛋白酶消化并制成細(xì)胞懸液，吹打均勻后滴于蓋玻片上，取出蓋玻片按以下流程處理：PBS漂洗，4%多聚甲醛室溫固定5 min，細(xì)胞生長至融合后加入羅丹明標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽并在室溫下孵育40 min。PBS漂洗，滴加DAPI染液，在黑暗中室溫孵育10 min。采用Carl Zeiss 7激光掃描共聚焦顯微鏡(Carl Zeiss AG,德國)觀察細(xì)胞骨架的變化。

1.5 LDH水平測定 取出加入處理因素后的6孔板，每組取兩板，任選10個培養(yǎng)孔，于60 min時間點，按照LDH試劑盒說明書進(jìn)行操作，用2,4-二硝基苯肼顯色法檢測LDH水平。

1.6 免疫細(xì)胞熒光染色法檢測VCAM-1蛋白表達(dá) 取出加入各種處理因素后的6孔板，放置滅菌蓋玻片，用4%多聚甲醛固定，PBS沖洗后稍甩干，用組化筆在蓋玻片中間細(xì)胞分布均勻的位置畫圈，加100 μL濃度為0.1%的破膜工作液，室溫孵育10 min后PBS沖洗，一抗覆蓋組織，爬片置于冰箱內(nèi)4°C孵育過夜。次日取出爬片后PBS沖洗3次，去除PBS后滴加與一抗相應(yīng)種屬的二抗，避光室溫孵育50 min后，PBS沖洗。滴加DAPI染液，室溫下避光孵育10 min，PBS沖洗后稍甩干，將有細(xì)胞的一面朝下用抗熒光淬滅封片劑將玻片封固在載玻片上封片。采用全自動圖像分析系統(tǒng)NIS-elements F3.2對陽性染色進(jìn)行分析，測定VCAM-1陽性表達(dá)的平均吸光度值(OD)，隨機(jī)選取5個高倍視野，測定陽性表達(dá)的吸光度值，取平均值反映VCAM-1的表達(dá)。

1.7 Western blot法 每組取5個培養(yǎng)瓶，收集細(xì)胞，檢測β-arrestin-1表達(dá)。采用蛋白抽提試劑提取蛋白。取40 μg蛋白，上樣進(jìn)行SDS-PAGE蛋白電泳，分離的蛋白隨后轉(zhuǎn)印至PVDF膜，膜在封閉液中(5%脫脂奶粉溶于PBS緩沖液-0.05 %Tween 20)室溫作用1 h封阻非特異性結(jié)合。再分別加入β-arrestin-1一抗和β-actin一抗，4 ℃孵育過夜，用TBST 漂洗濾膜3次，每次5 min后，加入二抗HRP-羊抗兔IgG，于室溫平緩搖動孵育30min，用TBST 漂洗濾膜3 次，每次5 min，進(jìn)行增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)。采用Alpha Ease FC分析軟件處理系統(tǒng)分析目標(biāo)帶的光密度值。

1.8 實時熒光定量PCR檢測β-arrestin-1 mRNA表達(dá) 主要步驟包括采用Trizol提取總RNA、逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA及實時熒光定量PCR。β-arrestin-1上游引物:CCAACAACACCAACAAGACGG,下游引物:CGCTTCTCTCGGTTATTGGC,擴(kuò)增片段長度193 bp。內(nèi)參β-actin上游引物:GTCCACCGCAAATGCTTCTA,下游引物:TGCTGTCACCTTCACCGTTC,擴(kuò)增片段長度190 bp。PCR反應(yīng)體系：2× qPCR Mix：12.5 μL，2.5 μmol/L內(nèi)標(biāo)引物：2.0 μL，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物：2.0 μL，ddH2O：8.5 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性1 min，95 ℃預(yù)變性15 s，58 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，共進(jìn)行40個循環(huán)，然后72 ℃延伸5 min。PCR完成后，在ABI Prism SDS 2.0軟件上行自動分析，導(dǎo)出相應(yīng)的循環(huán)閾值，采用2-△△CT值作為β-arrestin-1 mRNA的相對表達(dá)量。

2 結(jié) 果

2.1 各組細(xì)胞肌動蛋白骨架變化的比較 免疫熒光共聚焦的圖片顯示，A組可見排列紊亂的肌動蛋白有斷裂和不連續(xù)顯示，且無圍繞藍(lán)色細(xì)胞核的絲狀足。而給予鹽酸戊乙奎醚預(yù)處理的B組情況有所改善。與C組比較，給予鹽酸戊乙奎醚預(yù)處理的D組肌動蛋白的連續(xù)性和斷裂情況相對較輕。與A組比較，C組肌動蛋白的連續(xù)性和斷裂情況減輕；與B組比較，D組肌動蛋白的連續(xù)性和斷裂情況減輕(圖1)。

2.2 各組細(xì)胞LDH水平和VCAM-1蛋白表達(dá)的比較 與A組比較，B組LDH水平和VCAM-1蛋白表達(dá)降低；與C組比較，D組LDH水平和VCAM-1蛋白表達(dá)降低；與A組比較，C組LDH水平和VCAM-1蛋白表達(dá)降低；與B組比較，D組LDH水平和VCAM-1蛋白表達(dá)降低(表1)。

2.3 各組細(xì)胞β-arrestin-1蛋白和mRNA表達(dá)的比較 與A組比較，B組β-arrestin-1蛋白和mRNA表達(dá)升高；與C組比較，D組β-arrestin-1蛋白和mRNA表達(dá)升高；與A組比較，C組β-arrestin-1蛋白和mRNA表達(dá)無明顯改變；與B組比較，D組β-arrestin-1蛋白和mRNA表達(dá)無明顯改變(圖2、表1)。

表1 各組細(xì)胞LDH水平、VCAM-1和β-arrestin-1表達(dá)的比較

續(xù)表1 各組細(xì)胞LDH水平、VCAM-1和β-arrestin-1表達(dá)的比較

b：P<0.01，與A組比較;c：P<0.05，d：P<0.01，與B組比較；e：P<0.01，與C組比較。

圖1 各組細(xì)胞肌動蛋白骨架變化的比較

圖2 各組細(xì)胞β-arrestin-1蛋白表達(dá)的比較

3 討 論

LDH正常情況下存在于細(xì)胞內(nèi)，但在細(xì)胞膜受損傷而通透性增加時，可通過受損的細(xì)胞膜釋放出來，通過檢測其水平高低能夠較好的反映細(xì)胞受損程度[5]。VCAM-1為細(xì)胞黏附分子中的免疫球蛋白超家族成員，介導(dǎo)了中性粒細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的黏附激活并誘導(dǎo)炎性介質(zhì)的產(chǎn)生，是肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷發(fā)生發(fā)展的分子標(biāo)志[6]。鹽酸戊乙奎醚是新型的選擇性抗M1、M3受體型抗膽堿藥，對中樞和外周均有很強(qiáng)的抗膽堿作用，可作用于細(xì)胞生物膜膽堿受體，通過G蛋白耦聯(lián)環(huán)節(jié)，改變細(xì)胞內(nèi)第二信使的濃度，減輕炎性因子、黏附分子及趨化分子的合成、釋放，抑制有害介質(zhì)對組織及細(xì)胞的損傷[7]。本研究利用LPS與肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞共同孵育，結(jié)果表明，與A組比較，B組LDH水平和VCAM-1蛋白表達(dá)降低，提示鹽酸戊乙奎醚可以減輕LPS引起的肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷。

β-arrestins主要包括β-arrestin-1和β-arrestin-2，是GPCR信號通路重要的接頭和支架蛋白[8]。在本研究中，預(yù)先給予鹽酸戊乙奎醚2 μg/mL后LDH水平和VCAM-1蛋白表達(dá)明顯降低，而β-arrestin-1表達(dá)升高，提示鹽酸戊乙奎醚可通過上調(diào)β-arrestin-1表達(dá)從而降低LPS導(dǎo)致的肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷。

毒蕈堿樣膽堿能受體(M受體)是膜受體家族的成員，通過與異三聚體鳥苷酸結(jié)合蛋白(G蛋白)耦聯(lián)介導(dǎo)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，因此又稱G蛋白耦聯(lián)受體(GPCRs)[9]。而β-arrestins可以識別并結(jié)合磷酸化的毒蕈堿受體，阻斷毒蕈堿受體與G蛋白之間的相互作用，從而阻斷毒蕈堿受體介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[10]。本實驗中，相對于其他3組細(xì)胞，D組肌動蛋白骨架排列改善最明顯，LDH水平和VCAM-1蛋白表達(dá)水平最低，可能是由于毒蕈堿M3受體表達(dá)被抑制，從而使LPS引起這些指標(biāo)變化的程度減輕，而又累加上鹽酸戊乙奎醚對這些指標(biāo)的改善作用，因此D組表現(xiàn)的減輕內(nèi)皮細(xì)胞損傷的作用最為明顯。而與B組相比較，D組β-arrestin-1表達(dá)無明顯改變，證明鹽酸戊乙奎醚調(diào)節(jié)β-arrestin-1的機(jī)制與M3受體并無直接聯(lián)系。

綜上所述，M3受體在鹽酸戊乙奎醚減輕LPS導(dǎo)致的肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷中發(fā)揮著重要作用，沉默M3受體有助于降低LPS誘導(dǎo)的肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷。但鹽酸戊乙奎醚上調(diào)β-arrestin-1的作用與毒蕈堿受體M3的存在無必然聯(lián)系。這種作用是否與毒蕈堿受體其他亞型相關(guān)，還有待進(jìn)一步研究。

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Role of M3 receptor in the effect of penehyclidine hydrochloride up-regulating β-arrestin-1 expression*

Cheng Bin,Wang Yipeng,Zhan Jia△

(Department of Anesthesiology,Zhongnan Hospital of Wuhan University,Wuhan,Hubei,430071，China)

[Abstract] Objective To investigate the role of M3 receptor in the effect of penehyclidine hydrochloride(PHC) upregulating β-arrestin-1 expression in lipopolysaccharide(LPS)-induced human pulmonary microvascular endothelial cell(HPMVEC) injury.Methods .M3 shRNA transfected HPMVEC and normal HPMVEC cells were randomly divided into LPS group(A)，LPS+PHC group(B)，LPS+ M3 shRNA transfection group(C) and PHC+LPS+M3 shRNA transfection group(D).The cytoskeleton change was observed by laser scanning confocal.The LDH level in cellular supernate was detected.The VCAM-1 protein expression was examined by immunofluorescence chemistry.β-arrestin-1 protein expression was determined by Western blot and β-arrestin-1mRNA expression was measured by real-time PCR.Results Compared with the group A or C,F-actin cytoskeleton arrangement in the group B or D was neat,the LDH level and VCAM-1 protein expression were decreased,and β-arrestin-1 expression was increased;compared with group A or B,F-actin cytoskeleton arrangement in the group C or D was neat,the LDH level and VCAM-1 protein expression were decreased,while the β-arrestin-1 expression had no obvious change.Conclusion Silence M3 receptor is conducive to reduce LPS-induced HPMVEC injury.But the role of PHC up-regulating β-arrestin-1 expression has no necessary connection with M3 receptor.

M3 receptor；penehyclidine hydrochloride;β-arrestin-1;shRNA

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.13.007

國家自然科學(xué)基金青年基金項目(81101408)；湖北省武漢市科技局晨光計劃項目(2016070204010150)。 作者簡介：程斌(1970-)，大專，主管護(hù)師，主要從事臨床麻醉藥物的研究。△

，E-mail:jia19811001@163.com。

R979.3

A

1671-8348(2017)13-1750-03

2016-11-23

2017-01-11)