王桂清 曾路 馬迪 張賽 荊曉東

(聊城大學(xué)，聊城，252059)

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國槐根莖腐爛病病原菌的形態(tài)與分子鑒定1)

王桂清 曾路 馬迪 張賽 荊曉東

(聊城大學(xué)，聊城，252059)

為了確定引起國槐根莖腐爛病的病原菌種類，以國槐(SophorajaponicaLinn.)典型根莖腐爛病病株為試材，采用組織分離法獲得純菌株，并對所得菌株進行致病性測定、形態(tài)學(xué)鑒定及rDNA-ITS序列分析，研究了國槐根莖腐爛病的病原菌種類。根據(jù)24個菌株的培養(yǎng)性狀和形態(tài)特征，鑒定所分離菌株均為鐮刀菌。致病性測定表明，24個菌株均能侵染寄主樹皮組織使其腐爛變黑褐色。在GenBank序列數(shù)據(jù)庫中，24個菌株的DNA序列分別與多隔鐮刀菌(Fusariumdecemcellulare)、層生鐮刀菌(F.proliferatum)、木賊鐮刀菌(F.equiseti)、F.keratoplasticum和腐皮鐮刀菌(F.solani)的ITS序列同源性為99%～100%。

國槐；根莖腐爛?。荤牭毒?；形態(tài)鑒定；分子鑒定

國槐(SophorajaponicaLinn.)原產(chǎn)于中國的北部，又叫中華槐，是我國特有的樹種之一，也是城鄉(xiāng)良好的遮陰樹、行道樹、園林綠化樹種。但近年發(fā)現(xiàn)，聊城市及周邊幾個市區(qū)的成年國槐由于根莖腐爛而大面積樹勢衰弱甚至死亡。2016年3月，筆者在聊城東昌府區(qū)對國槐生長勢進行了調(diào)查，共調(diào)查國槐5 861棵，其中衰弱的有638棵，死亡的有210棵(東昌路、花園路較嚴重)，衰弱死亡的比例達到了14.5%。若繼續(xù)發(fā)展下去，將給當(dāng)?shù)氐膱@林綠化造成嚴重威脅，對生態(tài)景觀造成嚴重影響。為了明確引起國槐根莖腐爛的原因及致病菌的種類，本試驗對聊城市區(qū)不同地點的國槐腐爛病樣進行采集，分離純化，柯赫氏法則驗證，并從形態(tài)學(xué)、分子生物學(xué)方面對分離菌進行了鑒定，明確了主要的致病菌種類，為國槐根莖腐爛病的防治及相關(guān)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 病樣的采集

國槐腐爛病病樣采集地點是聊城市城區(qū)，寄主為20年生左右的行道用樹國槐，觀察被害癥狀后，采集病樣。共采集市區(qū)主要街道的10個地點，共10組病樣。

1.2 病原菌的分離與純化

病原菌的分離以PDA培養(yǎng)基作為基本培養(yǎng)基，采用常規(guī)組織分離法進行，于恒溫培養(yǎng)箱中，(25±1)℃，培養(yǎng)4～7 d。待長出菌落后，從菌落邊緣挑取微量菌絲多次轉(zhuǎn)接純化[1]，個別菌株采用單孢分離法進行純化。純化后接種于PDA斜面試管中，冰箱中4 ℃保存，待用。

1.3 病原菌的致病性測定

于3月底樹木開始發(fā)芽時，選取苗圃中生長正常的國槐2年生幼苗，移栽入盆，采用根莖部切傷接種法[2]進行致病性測定(成年國槐不便于試驗，為了方便試驗和觀察，采用國槐幼苗，只證明分離菌是否能致病)。利用滅過菌的昆蟲針對根莖進行人工造傷，接種在PDA上培養(yǎng)7 d的菌片，紗布保濕，5次重復(fù)，設(shè)PDA為空白對照。然后將接種后的植株置于室溫下培養(yǎng)，及時觀察記載發(fā)病時間和病斑大小，拍照記錄。從發(fā)病組織上再次分離病原菌，比較前后兩次分離得到的病原菌菌落形態(tài)、色澤和孢子等特征是否一致，進行柯赫氏法則驗證。

1.4 病原菌的形態(tài)觀察

國槐腐爛病病原菌鑒定，主要根據(jù)培養(yǎng)性狀、孢子及菌絲體的顯微觀察、生長速率幾個方面，并結(jié)合相應(yīng)的真菌鑒定手冊進行鑒定[3-4]。

培養(yǎng)性狀觀察:比較不同菌株在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)性狀的特點，包括菌落的形態(tài)、凸起程度、有無暈圈、菌絲的疏密程度、是否產(chǎn)生色素等幾個方面。

孢子及菌絲體顯微觀察:挑取不同菌株的菌絲體于干凈的載玻片上，制成臨時玻片，利用BX51-Olympus顯微鏡在10×40倍鏡下觀察菌絲及孢子的形態(tài)、隔膜的有無及隔膜數(shù)量等，并進行顯微照相。

1.5 病原菌的rDNA-ITS序列分析

基因組DNA的提取:采用PD培養(yǎng)液對分離菌進行培養(yǎng)，每瓶裝培養(yǎng)液100 mL，接種15個菌片，(25±1)℃，150 r·min-1恒溫震蕩培養(yǎng)6 d，抽濾，挑除菌片，獲取菌絲，干燥。準確稱取0.1 g菌絲，液氮研磨，用真菌基因組DNA 快速抽提試劑盒(生工生物工程(上海)股份有限公司)進行DNA 提取，用紫外/可見分光光度計檢測樣品DNA的濃度和純度。

rDNA-ITS序列擴增及測序:采用真菌ITS擴增通用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATG-3′)，對供試真菌基因組DNA 進行PCR擴增。

PCR反應(yīng)體系：模板DNA(約30 ng)1 μL，10×Buffer 5 μL，dNTP(10 mmol·L-1)4 μL，引物ITS1和ITS4各1 μL(10 μmol·L-1)，TaqDNA聚合酶(2.5 U·μL-1)0.7 μL，ddH2O 37.3 μL，共50 μL。

PCR反應(yīng)：預(yù)變性(95 ℃，5 min)→變性(95 ℃，30 s)→退火(54.5 ℃，30 s)→延伸(72 ℃，1 min)→修復(fù)延伸(72 ℃，10 min)→終止反應(yīng)(4 ℃，∞)，33 個循環(huán)。

PCR擴增產(chǎn)物以不含有EB的質(zhì)量分數(shù)為1.5%的瓊脂糖凝膠電泳(電泳緩沖液為50×TAE，電壓為4 V·cm-1)，2.5% EB的染色液中染30 min左右，并用凝膠成像系統(tǒng)檢測拍照記錄，得到目的條帶后，將PCR擴增產(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。用所獲菌株的rDNA-ITS序列在NCBI網(wǎng)站上經(jīng)BLAST與GenBank數(shù)據(jù)庫中已知序列進行序列比對，利用MEGA7構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，確定病原菌的種類。

2 結(jié)果與分析

2.1 國槐根莖腐爛病的發(fā)病癥狀

發(fā)病部位主要為植株的根莖、主根及部分側(cè)根的韌皮部和木質(zhì)部之間的組織，病健交界處分界明顯，病部腐爛，組織變褐，韌皮部和木質(zhì)部分離，國槐的輸導(dǎo)組織受到破壞，導(dǎo)致養(yǎng)分和水分無法運輸，樹冠部分得不到充分的養(yǎng)分，葉子逐漸變黃，然后干枯，直至整株枯死。

2.2 病原菌的形態(tài)

通過對采集的10個地點的24個病樣進行分離純化，共分離得到24個菌株，其中從發(fā)病的根部得到11個菌株，編號以G開頭(其中G4-3代表從第4份根部病樣上分離到的第3個菌株)；從根莖部分離得到13個菌株，編號以J開頭(其中J7-7代表從第7份根莖部病樣上分離到的第7個菌株)。

2.2.1 G1菌株的培養(yǎng)性狀與形態(tài)特征

G1在PDA培養(yǎng)基上產(chǎn)生大量白色絨毛狀、致密的氣生菌絲，生長旺盛，單菌落圓形，呈均勻放射狀(圖1A)，產(chǎn)生絳紅色色素(圖1B)，PDA培養(yǎng)基上25 ℃培養(yǎng)4 d的菌落直徑為3.3～3.5 cm。分生孢子2種類型：小型分生孢子，單細胞，無色，橢圓形或卵圓形，中央寬，兩端稍窄，經(jīng)常2個或3個連在一起；大型分生孢子多細胞，鐮刀型，略彎曲，兩端稍尖，6～8個隔(圖1C)。菌絲暗褐色，分生孢子梗有隔，灰色(圖1D)。

A.菌落形態(tài)；B.基物顏色；C.分生飽子；D.菌絲。

2.2.2 G2菌株的培養(yǎng)性狀與形態(tài)特征

G2菌株單菌落圓形，呈均勻輻射狀，氣生菌絲羊毛狀，生長旺盛(圖2A)，初期白色或淡紫色，基物紫色(圖2B)，PDA培養(yǎng)基上25 ℃培養(yǎng)4 d的菌落直徑為4.4～5.0 cm，培養(yǎng)5 d左右，菌落由內(nèi)到外形成明顯的紫色、白色輪紋。小型分生孢子，單細胞，橢圓形、卵圓形、柱形等，中央寬，兩端漸窄，稍尖或平齊，無色；大型分生孢子，鐮刀形，較直、細長，3～5個隔膜(圖2C)。菌絲有隔，分生孢子梗無色，有少量分枝，分枝呈銳角狀(圖2D)。

A.菌落形態(tài)；B.基物顏色；C.分生飽子；D.菌絲。

2.2.3 J7-7菌株的培養(yǎng)性狀與形態(tài)特征

單菌落圓形，呈輻射狀，在PDA培養(yǎng)基上產(chǎn)生大量的氣生菌絲，濃密長絨狀(圖3A)，初期菌絲體白色羊毛狀，基物為淺粉色，后期基物逐漸變成棕黃色(圖3B)，呈海綿狀，PDA培養(yǎng)基上25 ℃培養(yǎng)4 d的菌落直徑為6.3～6.6 cm。分生孢子中型，新月形，大多有3個隔膜，頂端細胞彎曲，呈長喙?fàn)?，中間細胞寬，下端細長，呈足狀，未見小型分生孢子(圖3C)。分生孢子?；液稚该?，可見內(nèi)容物，細絲狀(圖3D)。

A.菌落形態(tài)；B.基物顏色；C.分生飽子；D.菌絲。

2.2.4 G4-3和G6菌株的培養(yǎng)性狀與形態(tài)特征

由圖4可見，菌落圓形，呈均勻輻射狀，氣生菌絲較密，白色棉絮狀，外圍一圈菌絲生長稀疏(圖4A)，基物黃褐色，部分變色，變色與不變色部分呈五角星狀或呈扇形相間排列(圖4B)，PDA培養(yǎng)基上25 ℃培養(yǎng)4 d的菌落直徑為3.2～4.6 cm。大型分生孢子，瓶狀、梭狀、棒狀、腎狀等，孢子較粗壯，1～3個隔膜；小型分生孢子卵圓形，無隔膜(圖4C)。菌絲體大多粗壯，分生孢子梗呈不規(guī)則或規(guī)則樹狀分枝，分枝大多呈直角(圖4D)，后期顏色逐漸變深。

A.菌落形態(tài)；B.基物顏色；C.分生飽子；D.菌絲。

2.2.5 其余19個菌株的培養(yǎng)性狀與形態(tài)特征

菌落圓形，奶油色，氣生菌絲羊絨狀或長絮狀，白色或黃色(圖5A)，少數(shù)菌株菌落背面可產(chǎn)生淡粉紅色素；基物表面肉色，基物不變色(圖5B)。在PDA培養(yǎng)基上于25 ℃培養(yǎng)4 d，菌落直徑為2.7～5.0 cm。小型分生孢子卵圓形或長橢圓形；大型分生孢子馬特型，即大型分生孢子最寬處在孢子中線上部，兩端較鈍，頂細胞稍彎，基細胞鈍圓形或足跟不明顯，整個孢子形態(tài)較短、較胖，2～7個分隔，多數(shù) 3～5個分隔(圖5C)。小型分生孢子梗單出長瓶狀，大型分生孢子梗多為簇生，呈掃帚狀長梗，偶爾單生長瓶狀或菌絲狀(圖5D)。

根據(jù)24個菌株的培養(yǎng)性狀和形態(tài)特征，初步鑒定所分離24個菌株均為鐮刀菌(Fusariumsp.)。

2.3 病原菌的致病性

為了便于觀察，在實驗室內(nèi)，利用2年生國槐苗，用根莖部切傷法對分離獲得的24個菌株進行活體致病性檢測，接種14 d以后接種部位開始表現(xiàn)癥狀，主要為病斑處韌皮部和木質(zhì)部之間的組織腐爛變黑褐色，病健交界處明顯，中央稍凹陷，且病斑不斷擴展，但擴展的程度不同，接種40 d后的病部表現(xiàn)如圖6。

(1)接種G1菌株后，病斑擴展較明顯，呈干腐狀，稍凹陷，病部縱向開裂明顯，開裂部位稍隆起(圖6A)。

(2)接種G2菌株后，病斑呈干腐狀，以縱向擴展為主(圖6B)。

(3)接種G4-3和G6菌株后，表現(xiàn)出明顯的癥狀，且病斑不斷向四周擴展，以縱向擴展為主。病斑黑褐色，病部稍凹陷，開裂明顯，有白色凹陷的小點(圖6C)。

(4)接種J7-7菌株后，癥狀明顯，病斑周緣腐爛黑褐色，向四周擴展明顯；病斑內(nèi)緣凹陷，干腐狀，不開裂，有少量白色凹陷的小點(圖6D)。

(5)接種其余的19個菌株后，發(fā)病較其他菌株重，癥狀非常明顯，病部腐爛，黑褐色，呈不規(guī)則狀向四周擴展；病斑內(nèi)緣稍凹陷，干腐狀，不開裂(圖6E)。

A.菌落形態(tài)；B.基物顏色；C.分生飽子；D.菌絲。

A.接種G1；B.接種G2；C.接種G4-3和G6；D.接種J7-7；E.接種其余菌株。

從發(fā)病組織上再次分離、純化培養(yǎng)病原菌，其在PDA培養(yǎng)基上的培養(yǎng)性狀及孢子特征均與接種前對應(yīng)的菌株一致。

2.4 病原菌的分子生物學(xué)鑒定

用真菌ITS擴增通用引物對24個菌株進行rDNA-ITS 序列測定，獲得有效序列長度均為550 bp左右，利用NCBI網(wǎng)站在GenBank上進行Blast比對，結(jié)果表明，G1菌株有效序列長度為548 bp，與登陸號為KM231809.1、KF918594.1、LC055814.1等20多個Fusariumdecemcellulare(多隔鐮刀菌)序列的ITS序列同源性為99%～100%；G2菌株有效序列長度為535 bp，與登陸號為KP670435.1、FJ040179.1、EU151484.1等20個F.proliferatum(層生鐮刀菌)同源性為100%；J7-7菌株有效序列長度為517 bp，與登陸號為JQ412109.1、KU204754.1、AY147368.1等35個F.equiseti(木賊鐮刀菌)同源性為99%～100%；G4-3和G6菌株有效序列長度為550 bp左右，與登陸號為KC254052.1、KF255446.1、JN235224.1等21個F.keratoplasticum同源性為99%以上；其他19個菌株有效序列長度為546 bp左右，與登陸號為KF939490.1、KR997532.1、JX524022.1等50余個F.solani(腐皮鐮刀菌)序列的ITS序列同源性為99%。利用MEGA7構(gòu)建的24個菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹見圖7。

以上鑒定結(jié)果表明，24個分離菌株分屬于5種鐮刀菌。多隔鐮刀菌只包括菌株G1，層生鐮刀菌只包括菌株G2，木賊鐮刀菌只包括菌株J7-7，三者各占分離菌總量的4.17%；F.keratoplasticum包括菌株G4-3和G6，占總量的8.33%；腐皮鐮刀菌共包括G4-1、G4-2、G5-1等19個菌株，數(shù)量多，占總量的79.17%。

致病性試驗(圖6)表明：從國槐根莖腐爛部位分離得到的5種鐮刀菌均是腐爛病的致病菌。

3 結(jié)論與討論

通過對聊城市區(qū)國槐根莖腐爛病樣品的采集、分離、純化和鑒定，明確了引起聊城地區(qū)國槐根部和莖部腐爛的鐮刀菌有5種，分別為多隔鐮刀菌、層生鐮刀菌、木賊鐮刀菌、F.keratoplasticum、腐皮鐮刀菌，柯赫氏法則證明5種鐮刀菌均是國槐腐爛病的致病菌；從分離菌株的數(shù)量看，腐皮鐮刀菌菌株數(shù)最多，占優(yōu)勢，共19個，占總菌株數(shù)的79.17%。

圖7 國槐根莖腐爛病病原菌系統(tǒng)發(fā)育樹

真菌、線蟲、細菌均可引起寄主植物根莖、插穗[5]等腐爛。鐮刀菌屬是非常重要的一類真菌，廣泛存在于自然界，是真菌中較大的一個屬，為重要的病原菌之一。經(jīng)形態(tài)學(xué)特征觀察、致病性測定及rDNA-ITS序列分析，確定了尖孢鐮刀菌(F.oxysporum)為紅豆杉根腐病、河北石家莊地區(qū)銀杏根腐病的病原[6-7]，鐮刀屬李瑟組層生鐮刀菌為引起油茶根腐病的病原菌[8]，丹參、洛陽牡丹和蝴蝶蘭根腐病的主要致病菌為腐皮鐮刀菌[9-11]。根腐病是槐樹的主要病害之一[12]，鐮刀菌、絲核菌、腐霉菌等均可引起刺槐根腐病[13]。本研究結(jié)果表明，鐮刀菌是引起國槐根莖腐爛病的主要致病菌，與前人的研究結(jié)果是一致的。

樹木腐爛病是危害園林綠化闊葉樹的重要病害，屬弱寄生菌引起的典型寄主主導(dǎo)性病害，其病原菌在自然界普遍存在，潛伏期長，當(dāng)寄主衰弱受傷、氣候異?；蛏L不良時，寄主植株抗病性減弱，感病性增強，潛伏的病原菌侵染，迅速發(fā)病，輕者影響樹木生長，重者造成樹木死亡，有時會造成毀滅性的后果[14]。大多罹病樹木既使當(dāng)年沒有死亡，以后也年年發(fā)病，致使樹干局部木質(zhì)部與韌皮部分離，長勢衰弱，影響綠化、美化效果[15]。

本研究明確了引起國槐根莖腐爛病的鐮刀菌至少有5種，是否還有其他種類的鐮刀菌，有待于進一步分離鑒定；分離得到的5種鐮刀菌的致病性強弱有待于通過測定毒素、致病酶系、致病力等進一步研究，以確定國槐根莖腐爛病的優(yōu)勢致病菌。

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Morphological and Molecular Identification of theFusariumPathogen Causing Root Rot Disease of Chinese Scholartree//

Wang Guiqing, Zeng Lu, Ma Di, Zhang Sai, Jing Xiaodong

(Liaocheng University, Liaocheng 252059, P. R. China)//

Journal of Northeast Forestry University，2017,45(5)：106-110.

WithSophorajaponicaLinn. root rot, the pathogens were isolated by tissue separation, tested by the standard Koch’s postulation methods, and identified by the methods of microscopy and molecules, and the pathogen species of Chinese scholartree root rot were studied. From the culture characters and morphological characteristics of the 24 strains, the isolated strains were identified asFusariumsp. These strains ofFusariumcould infectinvivoChinese scholartree barkes and make it black brown and rot. In GenBank sequence database, the DNA sequence homology of 24 strains withF.decemcellulare,F.proliferatum,F.equiseti,F.keratoplasticum, andF.solaniwere 99%-100%, respectively.

Chinese scholartree; Root rot disease;Fusariumsp.; Morphological identification; Molecular identification

1)山東省自然科學(xué)基金項目(ZR2012CL17)；聊城市科技發(fā)展計劃項目(2014GJH10)；國家大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目(201610447025)。

王桂清，女，1968年12月生，聊城大學(xué)農(nóng)學(xué)院，教授。E-mail:wangguiqing@lcu.edu.cn。

2016年8月30日。

S792.26；Q934.1

責(zé)任編輯：程 紅。