牛艷芳 閆偉 陳立紅

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)，呼和浩特，010019)

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阿爾山白樺根際土壤固氮菌多樣性及特性1)

牛艷芳 閆偉 陳立紅

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)，呼和浩特，010019)

采用阿須貝無氮培養(yǎng)基分離純化白樺(Betulaplatyphylla)根際土壤固氮菌，根據(jù)菌落形態(tài)、16S rDNA序列分析及生理生化特性進(jìn)行固氮菌的鑒定，從而探討阿爾山國家森林公園自然保護(hù)區(qū)白樺根際土壤固氮菌的多樣性，并對典型固氮菌進(jìn)行pH、溫度和解磷能力的測定。結(jié)果表明：分離出的31株固氮菌分屬于Pseudomonas、Variovorax、Burkholderia、Rhizobium、Paenibacillus、Arthrobacter、Rhodococcus、Bosea、Labrys、Phyllobacterium、Mesorhizobium、Mucilaginibacter12個不同的類群。不同類群的固氮菌pH和溫度生長范圍有所不同；分離得到的典型固氮菌中，有3株具有解磷活性。

阿爾山；白樺；根際；固氮菌；16S rDNA

土壤微生物中對植物起促生作用的主要是一些根際促生菌，可通過生物固氮、溶磷等分解和轉(zhuǎn)化作用改變植物根際的營養(yǎng)，促進(jìn)根系對營養(yǎng)元素的吸收。植物在生長的過程中需要的大量氮元素，約有60%來自生物固氮[1-4]。從1958年，科學(xué)家Dobereiner和Ruschei從甘蔗的根際分離到具有固氮能力的微生物至今，發(fā)現(xiàn)和研究得較多的與植物聯(lián)合固氮的微生物種、屬有20多種[5-7]。目前，根際固氮菌研究的熱點(diǎn)主要集中于農(nóng)業(yè)作物和固氮樹種[8-13]。而對非固氮樹種的研究較少，且都集中在聯(lián)合固氮細(xì)菌回接對這些樹種的促生效應(yīng)上[14-16]，而關(guān)于白樺根際固氮菌的相關(guān)報(bào)道很少[17-18]。

阿爾山植被類型多樣，其根際微生物群落結(jié)構(gòu)也必定十分豐富，存在著大量有利于植物生長的、固氮能力較強(qiáng)的PGPR，但目前尚缺乏對阿爾山植物根際固氮菌的相關(guān)研究。因此，本研究采集了阿爾山的主要木本植物白樺(Betulaplatyphylla)的根際土壤，采用稀釋涂布分離法分離純化固氮菌，根據(jù)菌落形態(tài)、16S rDNA序列分析及生理生化特征進(jìn)行固氮菌的鑒定，并測定其生物學(xué)特性，分析白樺根際土壤固氮菌的多樣性及生物學(xué)特性，豐富白樺根際土壤固氮菌資源，為研究白樺固氮機(jī)制提供參考。

1 研究區(qū)概況

阿爾山國家森林公園(46°39′～47°39′N，119°28′～121°23′E)位于蒙古高原大陸性氣候區(qū)，屬于寒溫帶濕潤區(qū)，地處大興安嶺中段，被呼倫貝爾、錫林郭勒、科爾沁、蒙古四大草原所環(huán)抱，具有典型的火山地貌類型。阿爾山特殊的地理位置和獨(dú)特的生態(tài)地位塑造了阿爾山獨(dú)特的生物類群。一年四季常受西伯利亞寒流的侵襲，冬季寒冷漫長，夏季短促涼爽，植物生長期短，植被類型屬寒溫帶針闊混交林，主要植被多由西伯利亞植物區(qū)蒙古植物區(qū)系組成，以木本植物為主體。主要樹種有興安落葉松(Larixgmelinii)、白樺、樟子松(Pinussylvestrisvar.mongolica)、山楊(Populussp.)等[19-20]。

2 材料與方法

2.1 標(biāo)準(zhǔn)樣地選擇

在前期的踏查基礎(chǔ)上，于2015年8選擇阿爾山國家森林公園自然保護(hù)區(qū)純白樺林為研究樣地。樣地坡度23.75°，西南坡向，中坡位，海撥1 112 m，林分密度1 300株·hm-2，郁閉度0.83，林木平均胸徑17.0 cm，平均樹高20.9 m。

2.2 樣品的采集

在選取樣地內(nèi)，采用5點(diǎn)采樣法(4個頂點(diǎn)加1個中心點(diǎn))，每個采樣點(diǎn)選取1株白樺，去掉表面的腐殖質(zhì)，用無菌的鐵鍬挖取30 cm深的土壤，找到白樺根系，將帶有根系的土壤裝入無菌密封袋，帶回實(shí)驗(yàn)室，冰箱中4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 根際土壤固氮菌的分離純化

采用稀釋涂布分離法，利用阿須貝無氮培養(yǎng)基分離和純化土壤樣品中的固氮菌。稱取土樣10 g，放入裝有90 mL無菌水的加玻璃珠的三角瓶中，在搖床上150 r·min-1，振蕩20 min。依次制成10-3、10-4、10-5稀釋度的土壤懸液，分別接種到培養(yǎng)皿中，用無菌玻璃棒涂布均勻，28 ℃恒溫培養(yǎng)6～7 d。每個稀釋度重復(fù)3次。利用劃線法將培養(yǎng)出的固氮菌菌落進(jìn)行分離，4～5代可以分離到純種的固氮菌。將純化后的固氮菌繼續(xù)在無氮培養(yǎng)基上轉(zhuǎn)接3次，保證分離到的固氮菌仍具有固氮活性，將分離后的固氮菌保存到試管，置于冰箱4 ℃保存?zhèn)溆肹21-23]。

2.4 固氮菌16S rDNA序列分析

利用細(xì)菌基因組試劑盒(天根生化科技有限公司)提取固氮菌基因組DNA(具體操作方法見說明書)[24]。以細(xì)菌基因組DNA為模板，采用細(xì)菌通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)/1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)(上海生工生物工程有限公司合成)擴(kuò)增16S rDNA。反應(yīng)體系(總體積50 μL)：25 μL DaeamTapGreen PCR Master Mix(2X)，2.0 μL 10 μmol·L-1引物27F，2.0 μL 10 μmol·L-1引物1492R，2.0 μL模板DNA，19 μL ddH2O。擴(kuò)增反應(yīng)條件：95 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s，45 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30個循環(huán)；72 ℃ 15 min。擴(kuò)增后序列由上海生物工程有限公司進(jìn)行序列的測定。

測定的序列經(jīng)DNAMAN6.0校正后引入EzTaxon與已發(fā)表菌種的16S rDNA序列進(jìn)行同源性比較，找出相似度較高的序列，用MEGA4軟件采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，自展值(Bootstrap)為1 000。分析根際土壤固氮菌的系統(tǒng)發(fā)育地位[25-29]。

2.5 典型固氮菌生理生化鑒定

將篩選出的代表菌株選用多種不同的生理生化實(shí)驗(yàn)鑒定固氮菌[30]。

2.6 典型固氮微生物特性分析

pH對菌株活性的影響：將篩選出的代表菌株分別接種于pH為3、4、5、6、7、8、9、10、11的培養(yǎng)基中，28 ℃培養(yǎng)5 d，觀察菌落生長情況[31]。

溫度對菌株活性的影響：將篩選出的代表菌株分別接種于阿須貝培養(yǎng)基，置于5、15、28、37、45 ℃等不同溫度下培養(yǎng)5 d，觀察菌落生長情況[31]。

解磷能力的測定：采用溶磷圈法將篩選出的菌株接種到無機(jī)磷培養(yǎng)基中，培養(yǎng)箱中28 ℃培養(yǎng)10 d，觀察菌株周圍是否有透明圈出現(xiàn)。如有出現(xiàn)，測定透明圈和菌落的直徑大小，二者比值的大小表示菌株解磷能力的強(qiáng)弱[32-33]。

3 結(jié)果與分析

3.1 根際土壤固氮菌的形態(tài)

根據(jù)菌落大小、顏色、透明度、邊緣是否整齊等特征，最終從白樺根際土壤中分離出具有典型形態(tài)的固氮菌31株，用XH表示。從圖1可以看出，固氮菌的菌落形態(tài)多樣，有的菌落大，有的菌落??；有的菌落乳白色，有的菌落透明；有的菌落邊緣整齊，有的菌落邊緣不整齊；有的菌落隆起，有的菌落扁平；有的菌落表面濕潤光滑，有的菌落表面干燥。

3.2 16S rDNA瓊脂糖凝膠電泳

以細(xì)菌通用引物27F和1492R為引物，對白樺根際土壤中分離出的31株固氮菌的16S rDNA基因片段進(jìn)行擴(kuò)增，所得片段條帶清晰(圖2)，大小約為1.5 kb，符合細(xì)菌16S rDNA的大小。16S rDNA序列委托上海生物工程有限公司測序。

3.3 白樺根際土壤固氮菌系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

經(jīng)EzTaxon研究表明，從白樺根際土壤分離出的31株固氮菌的16S rDNA基因序列與相關(guān)模式菌株的16S rDNA基因序列相似性為96.38%～100%。由系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3)可以看出，31株固氮菌分屬于12個不同的屬，其中假單胞菌(Pseudomonas)為優(yōu)勢屬，占總固氮菌數(shù)的45.2%。

3.4 白樺根際土壤典型固氮菌生理生化特性

從經(jīng)16S rDNA鑒定后分屬于12個不同類群的菌株中選出代表菌株進(jìn)行生理生化試驗(yàn)，其結(jié)果見表1。從表1可以看出，不同類群的固氮菌其生理生化特性不同，但所有菌株都能利用葡萄糖和甘露醇作為碳源生長，過氧化氫酶為陽性。菌株XH10、XH14、XH21、XH22、XH24、XH25、XH26均能利用乳糖生長，而菌株XH4、XH5、XH16、XH18、XH20不能利用乳糖；菌株XH16、XH18、XH20不能利用蔗糖生長，其余菌株均能利用蔗糖生長；甲基紅和VP反應(yīng)只有菌株XH18為陽性，其余均為陰性；吲哚反應(yīng)菌株XH20、XH22、XH24為陽性，其余均為陰性；淀粉水解反應(yīng)菌株XH22、XH24為陽性，其余均為陰性；尿素水解反應(yīng)菌株XH22、XH24、XH25為陽性，其余均為陰性；油脂水解反應(yīng)菌株XH5、XH14、XH18、XH21、XH22、XH26均為陽性，菌株XH4、XH10、XH16、XH24均為陰性，菌株XH20、XH25未檢出；明膠液化反應(yīng)菌株XH10、XH18、XH22、XH24均為陽性，其余菌株為陰性。

圖1 白樺根際土壤固氮菌菌落形態(tài)

圖2 部分白樺根際固氮菌16S rDNA電泳圖譜

根據(jù)《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(第9版)》和《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》，結(jié)合16S rDNA序列分析，最終確定，分離自阿爾山白樺根際土壤的31株固氮菌分屬于Pseudomonas、Variovorax、Burkholderia、Bosea、Labrys、Phyllobacterium、Mesorhizobium、Rhizobium、Paenibacillus、Arthrobacter、Rhodococcus、Mucilaginibacter12個不同的類群(表2)。

3.5 白樺根際典型固氮菌特性

pH對菌株活性的影響：將不同類群的固氮微生物分別接種于pH為3、4、5、6、7、8、9、10、11的培養(yǎng)基中，28 ℃培養(yǎng)5 d，觀察菌落生長情況。從表3中可以看出，不同類群的固氮菌pH的生長范圍不同，其中菌株XH22的pH生長范圍最大，在3～11都能生長，菌株XH4、XH16、XH26的pH生長范圍是4～9；菌株XH5、XH10、XH20的pH生長范圍是3～9；菌株XH14的pH生長范圍是5～10，菌株XH18的pH生長范圍是5～9；菌株XH21的pH生長范圍是5～11，菌株XH24和XH25的pH生長范圍是4～10，但所有菌株的最適生長pH值均集中在6～8。

圖3 基于16S rDNA的白樺根際土壤固氮菌系統(tǒng)發(fā)育樹

表1 白樺根際土壤典型固氮菌生理生化特性

注：“+”表示反應(yīng)陽性，“-”表示反應(yīng)陰性，ND表示未檢出。

溫度對菌株活性的影響：從表4中可以看出，不同類群的固氮菌其溫度生長范圍不同，菌株XH14和XH26溫度生長范圍最大，在4～45 ℃均可以生長，其余菌株的溫度生長范圍基本都集中于15～37 ℃，但最適生長溫度都是28 ℃。

表2 白樺根際土壤固氮菌鑒定結(jié)果

表3 白樺根際典型固氮菌不同pH下的生長情況

注：“-”表示不生長，“+”表示生長，“++”表示生長較好，“+++”表示生長旺盛。

表4 白樺根際典型固氮菌不同溫度下的生長情況

注：“-”表示不生長，“+”表示生長，“++”表示生長較好，“+++”表示生長旺盛。

解磷能力：有許多固氮菌除了具有固氮能力外，還具有解磷作用。本試驗(yàn)對篩選菌株是否具有解磷作用進(jìn)行了驗(yàn)證。結(jié)果表明，在解磷能力方面，從定性試驗(yàn)來看，菌株XH18、XH22、XH24均具有解磷作用，解磷能力由強(qiáng)到弱依次為XH22、XH18、XH24(表5)。

表5 白樺根際土壤典型固氮菌解磷能力

注：表中“+”表示能夠解磷，“-”表示不能解磷。

4 結(jié)束語

阿爾山國家森林公園白樺根際土壤固氮菌具有豐富的多樣性，分離出的31株固氮菌分別屬于12個不同的類群，其中Pseudomonas為優(yōu)勢類群。不同固氮菌的生長pH和溫度有差異性，12個不同類群的固氮菌中只有Pseudomonas、Paenibacillus、Burkholderia具有解磷作用。該研究豐富了我國白樺木本植物根際固氮菌資源，為研究木本植物固氮提供了理論依據(jù)。

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Diversity and Characterization of Nitrogen-fixing Bacteria inBetulaplatypyllaRhizosphere in Arxan//

Niu Yanfang, Yan Wei, Chen Lihong

(Inner Mongolia Agricultural University, Hohhot 010019, P. R. China)//

Journal of Northeast Forestry University，2017,45(5)：101-105,120.

The nitrogen-fixing bacteria were isolated and purified from the rhizosphere ofBetulaplatyphyllaby Ashby nitrogen-free culture medium, and identified in the 16S rDNA and physiology-biochemical. The diversity of nitrogen fixing bacteria was studied inB.platyphyllarhizosphere in Arxan National Forest Park. The optimum pH, temperature and phosphate solubilizing capacity of the typical nitrogen fixing bacteria were measured. The 31 nitrogen-fixing bacteria were isolated, belonging to 12 groups, which werePseudomonas,Variovorax,Burkholderia,Rhizobium,Paenibacillus,Arthrobacter,Rhodococcus,Bosea,Labrys,Phyllobacterium,MesorhizobiumandMucilaginibacter. The pH and temperature range of nitrogen-fixing bacteria were different in different groups, and phosphate-solubilizing activity was found in three strains of typical nitrogen-fixing bacteria.

Aershan；Betulaplatypylla； Rhizosphere； Nitrogen-fixing bacteria； 16S rDNA

1)國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31260173)。

牛艷芳，女，1977年6月生，內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院，博士研究生。E-mail:niuyanfang@126.com。

陳立紅，內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，教授。E-mail:chenlihong@imau.edu.cn。

2017年1月21日。

S718.8

責(zé)任編輯：程 紅。