張 勁，黃小云，秦曉媛，謝太理，管敬喜，文仁德，謝林君，成 果

（1.廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)院葡萄與葡萄酒研究所，廣西南寧530007；

2.廣西-東盟食品藥品安全檢驗(yàn)檢測中心，廣西南寧530021）

廣西毛葡萄及釀酒皮渣中齊墩果酸的分析研究

張 勁1，黃小云1，秦曉媛2，謝太理1，管敬喜1，文仁德1，謝林君1，成 果1

（1.廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)院葡萄與葡萄酒研究所，廣西南寧530007；

2.廣西-東盟食品藥品安全檢驗(yàn)檢測中心，廣西南寧530021）

探索生理活性成分齊墩果酸在毛葡萄中的分布，考察利用毛葡萄釀酒皮渣提取齊墩果酸的可行性。以廣西毛葡萄及釀酒皮渣為實(shí)驗(yàn)原料，采用高效液相色譜法（HPLC）分析毛葡萄果皮、葡萄籽、葡萄汁、葡萄酒及釀酒皮渣和釀酒葡萄籽中齊墩果酸的含量。結(jié)果表明，在毛葡萄果皮及釀酒皮渣中均檢出齊墩果酸，但在葡萄汁、葡萄酒及葡萄籽中未檢出。齊墩果酸天然存在于毛葡萄果皮中，由于其水不溶性，通過浸漬發(fā)酵無法溶入葡萄酒中。利用毛葡萄釀酒皮渣提取齊墩果酸為葡萄酒釀酒廢棄物綜合利用提供了新思路。

毛葡萄； 釀酒皮渣； 齊墩果酸

齊墩果酸（oleanolic acid,OA），又名慶四素，是一類五環(huán)三萜化合物，以游離態(tài)和糖苷鍵合形式廣泛存在于女貞子、連翹、景天三七、人參、雪膽、夏枯草等藥用植物中[1]，并且存在于木瓜[2]、葡萄[3]、大棗等食物中。據(jù)研究報(bào)道，OA具有護(hù)肝、解肝毒、降轉(zhuǎn)氨酶、降血糖、降血脂、抗炎抗病毒、抗突變、抗癌等多重藥理作用[1]。

近年來，對于葡萄中齊墩果酸的發(fā)現(xiàn)、含量測定以及分離提取的研究越來越多。研究發(fā)現(xiàn)，OA主要存在于葡萄皮中[4]，含量較高的葡萄品種多集中于新疆產(chǎn)地鮮食及釀酒葡萄品種，如索索葡萄[5]、和田紅、木訥格、無核白、馬奶子克里米札特、巨峰等[6]，另外，刺葡萄籽多酚提取物中也發(fā)現(xiàn)OA的存在[7]。目前，葡萄中齊墩果酸的研究領(lǐng)域多集中于含量測定[6]、提取工藝[8-9]及藥理作用[10-11]等方面。

毛葡萄(Vitis quinquangularis Rehd)是葡萄科(Vitaceae)葡萄屬(Vitis L)真葡萄亞屬(E-uvitis)東亞種群的一個(gè)種，原產(chǎn)于中國，是我國葡萄屬東亞種群中分布最廣的一個(gè)野生種[12]。毛葡萄是廣西分布最廣的葡萄屬野生品種，含有豐富的維生素、氨基酸、不飽和脂肪酸、礦物質(zhì)、雙糖苷花色苷、超氧化物歧化酶、白藜蘆醇等營養(yǎng)功效成分，食用或飲用葡萄酒具有抗衰老、軟化血管、抗癌等多重保健作用[13]。本研究首次探索生理活性物質(zhì)齊墩果酸在廣西毛葡萄中的分布情況，探索利用毛葡萄釀酒皮渣提取齊墩果酸的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

毛葡萄：2016年8月采自廣西羅城，品種為“野釀2號”，由廣西農(nóng)科院生物所鑒定。

毛葡萄酒及釀酒皮渣：由廣西農(nóng)科院葡萄與葡萄酒研究所釀造工藝研究室利用野釀2號毛葡萄按照干紅釀造工藝發(fā)酵釀造干紅葡萄酒，在酒精發(fā)酵結(jié)束時(shí)分離釀酒皮渣（含葡萄籽）。

樣品前處理：取1 kg毛葡萄果實(shí)，人工去皮，分離葡萄籽，準(zhǔn)確稱重，計(jì)算皮果比和籽果比；果肉經(jīng)勻漿、離心（8000 r/min，10 min），取上清液果汁備用；葡萄皮和葡萄籽自然晾干，加液氮粉碎，經(jīng)冷凍干燥（-58℃，24 h），計(jì)算得率，葡萄皮及葡萄籽干粉備用。

釀酒皮渣：稱取1 kg釀酒皮渣，分離皮渣與葡萄籽，60℃熱風(fēng)干燥，粉碎，過100目篩，計(jì)算皮渣和葡萄籽得率，干粉備用。

試劑：齊墩果酸（HPLC），Sigma；甲醇（色譜級），F(xiàn)isher；水為實(shí)驗(yàn)室超純水。

儀器設(shè)備：高效液相色譜儀（LC-20AT），日本島津；高速離心機(jī)（TG16-WS），湖南湘儀；真空冷凍干燥機(jī)（Alpha 1-2 LDplus），德國Christ；超聲波清洗機(jī)（XUB25），Grant；電熱鼓風(fēng)干燥箱，上海躍進(jìn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 OA的提取

葡萄皮、葡萄籽樣品：取經(jīng)干燥的葡萄鮮果分離的葡萄皮、葡萄籽及釀酒后的葡萄皮渣和葡萄籽干粉，準(zhǔn)確稱量1.0000 g，用甲醇定容至25 mL，超聲波提取30 min，常溫浸漬30 min，經(jīng)高速離心（8000 r/min，10 min），取上清液1 mL，用甲醇定容至10 mL，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾，取濾液上機(jī)進(jìn)行HPLC分析。

葡萄汁樣品：取澄清葡萄汁樣品，稀釋10倍，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾，取濾液上機(jī)進(jìn)行HPLC分析。

葡萄酒樣品：取葡萄酒樣品，稀釋50倍，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾，取濾液上機(jī)進(jìn)行HPLC分析。

1.2.2 OA的HPLC分析

色譜條件：島津InertSustainC18（250mm×4.6mm× 5 μm），流動(dòng)相：甲醇∶水=85∶15（v/v），檢測器：UV檢測器，波長210 nm；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：10 μL。

標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：準(zhǔn)確稱取10 mg OA標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇定容至10 mL，配制成1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)試劑母液，取母液配制成10 μg/mL、20 μg/mL、30 μg/mL、40 μg/mL、50 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按照色譜條件進(jìn)樣分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品前處理

針對1.1中葡萄皮、葡萄籽、釀酒葡萄皮渣、釀酒葡萄籽樣品前處理各步驟的樣品得率進(jìn)行計(jì)算，結(jié)果見表1。葡萄鮮果中葡萄皮、葡萄籽含量和釀酒皮渣中皮、籽含量用于評價(jià)釀酒皮渣綜合利用的可行性，樣品干燥得率用于最終計(jì)算鮮樣中齊墩果酸的含量。

2.2 OA線性關(guān)系考察

根據(jù)HPLC的分析結(jié)果，標(biāo)準(zhǔn)品在19.617 min出峰，色譜圖見圖1。以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)（X），以峰面積為縱坐標(biāo)（Y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖2。標(biāo)準(zhǔn)曲線為：Y=5439.5X-1238，R2=0.9999，線性關(guān)系良好。

圖1 OA標(biāo)準(zhǔn)品HPLC色譜圖

表1 樣品前處理中葡萄皮、葡萄籽得率

圖2 OA標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3 OA測定結(jié)果

根據(jù)樣品的HPLC分析結(jié)果，樣品中OA出峰時(shí)間在19.6 min左右，根據(jù)樣品中OA的峰面積和標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算各樣品中的OA含量，結(jié)果見表2。

結(jié)果表明，毛葡萄含有齊墩果酸，主要集中于葡萄皮中。葡萄中營養(yǎng)成分多存在于果肉中，如有機(jī)酸、氨基酸等，而生物活性成分多分布在果皮與籽中，如白藜蘆醇、黃酮、原花青素等。有研究[3，14]發(fā)現(xiàn)，齊墩果酸存在于葡萄皮中，與本研究的結(jié)論一致，但文獻(xiàn)中少有報(bào)道葡萄籽、葡萄汁及葡萄酒中的OA測定研究進(jìn)展，本研究表明，毛葡萄中齊墩果酸存在且僅存在于葡萄皮中。報(bào)道[3-4]認(rèn)為，國內(nèi)OA含量較高的葡萄主要為新疆產(chǎn)地的品種，如索索葡萄、和田紅、木訥格、馬奶子等，而歐洲葡萄品種中含量很低。本研究結(jié)果表明，廣西毛葡萄富含齊墩果酸，且含量高于新疆產(chǎn)地葡萄。

表2 毛葡萄中齊墩果酸含量

從含量上分析，干樣品的釀酒葡萄皮渣中OA含量高于鮮葡萄皮中，由2.1中樣品前處理得率數(shù)據(jù)，釀酒葡萄皮渣得率為鮮葡萄皮的1/2左右，說明濕樣品中，鮮葡萄皮中OA含量仍高于釀酒葡萄皮渣中，這是因?yàn)獒劸破咸哑ぴ胁粌H含有葡萄皮，而且含有一定量的葡萄果肉（酒泥）。馬龍等[3，6]的研究認(rèn)為，新疆產(chǎn)葡萄皮中OA含量在1%左右，且釀酒后的皮渣中OA含量高于新鮮葡萄皮，其同樣是用干樣品含量計(jì)。毛葡萄干紅葡萄酒釀造中，一般產(chǎn)生30%釀酒皮渣（含籽），根據(jù)2.1中得率計(jì)算，1 t毛葡萄釀造干紅葡萄酒產(chǎn)生的皮渣中在理論上含有778.7 g齊墩果酸，具備工業(yè)化提取利用價(jià)值。

從毛葡萄、葡萄酒及釀酒葡萄皮渣中OA存在分布分析，新鮮葡萄皮、釀酒葡萄皮渣中含有OA，而葡萄籽、葡萄汁及葡萄酒中均未檢出OA。結(jié)果表明，葡萄果實(shí)中的OA僅存在于葡萄皮中，且通過發(fā)酵浸漬OA無法富集進(jìn)入葡萄酒中。OA為齊墩果酸烷型五環(huán)三萜化合物，不溶于水，可溶于乙醇、氯仿、丙酮[15]。葡萄酒的酒精度為12%vol左右，OA無法溶解。OA具有護(hù)肝、解肝毒等豐富的生理作用，然而僅存在于葡萄皮中，通過葡萄鮮食或飲用葡萄酒均無法攝入OA。利用發(fā)酵后的釀酒葡萄皮渣提取OA，為釀酒廢棄物的綜合利用提供了一條新的思路。

2.4 精密度實(shí)驗(yàn)

分別精確稱取野釀2號葡萄皮粉末和釀酒葡萄皮渣樣品粉末1.0000 g，按照樣品提取和測定方法條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，各平行6次。結(jié)果葡萄皮中齊墩果酸的平均含量為1.639 g/100 g，RSD為2.477%；釀酒葡萄皮渣中OA的平均含量為1.697 g/100 g，RSD為4.310%。表明該實(shí)驗(yàn)提取和測定方法精密度良好。

2.5 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

精確稱取野釀2號葡萄皮粉末1.0000 g，按照樣品提取和測定方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，在0～12 h，每1 h進(jìn)樣分析一次，記錄峰面積，計(jì)算測定結(jié)果。結(jié)果表明12 h內(nèi)OA峰面積無明顯變化，13次樣品測試，OA平均含量為1.629 g/100 g，RSD為0.334%，說明樣品提取的OA測定穩(wěn)定性良好。

2.6 回收率實(shí)驗(yàn)

精確稱取野釀2號葡萄皮粉末1.0000 g共9份，分為3組平行，每組分別加入10 mg/mL的OA標(biāo)準(zhǔn)品試劑母液1 mL、2 mL、3 mL，每組平行3份，按照樣品提取和測定方法實(shí)驗(yàn)，9次實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，OA平均回收率為103.06%，RSD為1.41%。表明本實(shí)驗(yàn)方法回收率高，可以滿足分析要求。

3 結(jié)論

本研究用HPLC法測定了廣西毛葡萄中葡萄皮、葡萄籽、葡萄汁、葡萄酒及釀酒葡萄皮、釀酒葡萄籽等樣品中的齊墩果酸含量。葡萄果實(shí)僅葡萄皮中存在齊墩果酸，葡萄汁和葡萄籽中均不含有齊墩果酸，且通過發(fā)酵浸漬，齊墩果酸無法溶入葡萄酒中。釀酒后的葡萄皮渣中富含齊墩果酸，具備提取利用的價(jià)值。本研究團(tuán)隊(duì)今后將就毛葡萄皮渣齊墩果酸綜合利用和齊墩果酸功能型葡萄酒為研發(fā)方向繼續(xù)深入研究。

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Analysis of Oleanolic Acid in Vitis quinquangularis Rehd and Its Skin Residues after Wine Making

ZHANG Jin1,HUANG Xiaoyun1,QIN Xiaoyuan2,XIE Taili1,GUAN Jingxi1, WEN Rende1,XIE Linjun1and CHENG Guo1
(1.Viticulture and Wine Research Institute,Guangxi Academy of Agricultural Sciences,Nanning,Guangxi 530007;
2.Guangxi&ASEAN Inspection&Testing Center For Food and Drug Safety,Nanning,Guangxi 530021,China)

The distribution of biologically-active component oleanolic acid in Guangxi V.quinquangularis Rehd was explored and the feasibility of extracting oleanolic acid from V.quinquangularis Rehd skin residues after wine making was discussed.V.quinquangularis Rehd and its skin residues were used as the experimental raw materials,and oleanolic acid content in V.quinquangularis Rehd skin,seed,juice,wine and skin residues was measured by HPLC.The results showed that,oleanolic acid was detected in fresh fruit skin and skin residues,but not in seed,juice and wine.As a conclusion,oleanolic acid naturally exists in V.quinquangularis Rehd skin and it could not dissolve in wine due to its water-insoluble property.The extraction of oleanolic acid from skin residues was feasible and it was a new pathway for comprehensive utilization of grape pomace.

Vitis quinquangularis Rehd;skin residues;oleanolic acid

TS261.2；TS261.9；TS261.7

A

1001-9286（2017）05-0099-04

10.13746/j.njkj.2017010

廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院基本科研業(yè)務(wù)專項(xiàng)（桂農(nóng)科2015YM05、桂農(nóng)科2015YT85和桂農(nóng)科2015JZ150），廣西自然科學(xué)基金（2015GXNSFBA139091）。

2017-01-16

張勁（1986-），男，助理研究員，碩士，研究方向?yàn)檗r(nóng)產(chǎn)品加工及貯藏，E-mail：86562900@qq.com。

成果（1987-），女，助理研究員，博士，研究方向?yàn)獒劸破咸焉泶x，E-mail：berry713@163.com。

優(yōu)先數(shù)字出版時(shí)間：2017-04-17；地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20170417.1001.002.html。