吳榮榮，趙娟娟，程書梅

(1.衡水學(xué)院生命科學(xué)系，河北衡水053000； 2.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，河北保定071000)

蘋果酒專用釀酒酵母Y2菌劑研究

吳榮榮1，趙娟娟1，程書梅2

(1.衡水學(xué)院生命科學(xué)系，河北衡水053000； 2.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，河北保定071000)

對實驗室保藏蘋果酒專用釀酒酵母Y2的發(fā)酵條件和保護劑進行優(yōu)化。結(jié)果表明，Y2培養(yǎng)基的最適組成為葡萄糖1.5%，KNO32%，MgSO40.15%；Y2最適培養(yǎng)條件分別為，溫度25℃，接種量1.5%，培養(yǎng)時間為14 h，pH4.0，培養(yǎng)液中菌體OD值可達1.30。保護劑的最佳組合分別為脫脂奶粉14%，甘油3%，谷氨酸鈉3%，吐溫80為0.5%。冷凍干燥后菌劑的活菌數(shù)為8.45×1011cfu/g。

釀酒酵母； 培養(yǎng)基； 培養(yǎng)條件； 冷凍保護劑

蘋果酒是近年來在我國流行的一種果汁飲料，產(chǎn)量和知名度在國際上略低于葡萄酒，酒精度含量低，是第二大果酒[1]。它既有美酒的芬芳又有果汁的風(fēng)味，含有多種人體所需氨基酸、豐富的維生素、有機酸等[2]，口感清醇，營養(yǎng)豐富。

酵母菌種的發(fā)酵性能是否良好直接影響蘋果酒品質(zhì)的好壞。用發(fā)酵能力和繁殖能力較高、抗二氧化硫能力較強的酵母啟動發(fā)酵，可提高發(fā)酵速率，釀造出的蘋果酒具有較好的品質(zhì)。缺少專用蘋果酒發(fā)酵酵母是制約我國蘋果酒發(fā)展的一個重要原因[3]。制備高品質(zhì)的蘋果酒釀酒酵母，應(yīng)保證其具有起酵迅速、降糖能力好、沉降性能好、方便分離、產(chǎn)酒量大、酒香協(xié)調(diào)等優(yōu)良特征[4-5]。

本研究擬對實驗室保藏的蘋果酒專用釀酒酵母Y2的制備技術(shù)進行研究，主要從菌株生長培養(yǎng)基最適碳源、氮源、無機鹽，以及培養(yǎng)過程中的最適生長溫度、最適生長pH值、最適接種量、最適培養(yǎng)時間幾個方面進行研究。通過對釀酒酵母的生長情況的測定，以期對工業(yè)化生產(chǎn)用的蘋果酒專用酵母培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件進行優(yōu)化[6-10]，獲得高數(shù)量和高活性的釀酒酵母菌劑。

1 材料與方法

1.1 材料及儀器

菌株：實驗室保藏的酵母菌Y2。

培養(yǎng)基：YPD基礎(chǔ)培養(yǎng)基。

儀器：超凈工作臺，Swut SE型電子天平，LRH系列生化培養(yǎng)箱，722S可見分光光度計，SK-1型快速混勻器，PHB-4便攜式pH計，BXM-30R立式壓力蒸汽滅菌鍋，移液槍。

1.2 實驗方法

1.2.1 蘋果酒專用酵母菌培養(yǎng)基的優(yōu)化

（1）單因素實驗

考察不同碳源、氮源、無機鹽對酵母菌生長的影響。每500 mL三角瓶裝100 mL培養(yǎng)基，121℃滅菌20 min。分別接入3種菌株以28℃、120 r/min振蕩培養(yǎng)24 h后，在560 nm處測定吸光度。

（2）正交實驗

采用4因素3水平的L9(34)正交實驗，以碳源、氮源、無機鹽為考察因素，確定培養(yǎng)基的最佳組成，因素水平見表1。

表1 正交實驗因素水平

1.2.2 蘋果酒專用酵母培養(yǎng)條件的優(yōu)化

（1）單因素實驗

考察不同的培養(yǎng)溫度（10℃、15℃、20℃和25℃），pH值（4.0、4.5、5.0、5.5），接種量（1%、1.5%、2%、2.5%），培養(yǎng)時間（14 h、18 h、22 h、24 h）對酵母生長的影響。

（2）正交實驗

采用4因素3水平的L9(34)正交實驗，以溫度、pH值、培養(yǎng)時間、接種量為考察因素，確定培養(yǎng)基的最佳組成。因素水平見表2。

表2 正交實驗因素水平

1.2.3 冷凍保護劑

采用4因素3水平的L9(34)正交實驗，以脫脂奶粉、甘油、谷氨酸鈉和吐溫80為考察因素，確定對酵母菌生物量的影響，因素水平見表3。

表3 正交實驗因素水平

2 結(jié)果與分析

2.1 蘋果酒專用酵母菌培養(yǎng)基的優(yōu)化

2.1.1 單因素實驗結(jié)果

（1）碳源對酵母菌生長的影響

將YPD培養(yǎng)基中的葡萄糖分別以等量的蔗糖、淀粉、玉米粉替換，測得560 nm處的OD值見圖1。

圖1 碳源對酵母菌生長的影響

由圖1可以看出，菌株Y2在碳源為葡萄糖的培養(yǎng)基中生長得最好，OD值為0.86，其次為蔗糖、淀粉，在玉米粉中生長得最少。表明蘋果酒釀酒酵母在單糖的環(huán)境中生長得最好。

（2）氮源對酵母菌生長的影響

將YPD培養(yǎng)基中的蛋白胨分別以尿素、硫酸銨和硝酸鉀代替，測得560 nm處的OD值見圖2。

由圖2可以看出，Y2在氮源為硝酸鉀或硫酸銨的培養(yǎng)基中的生長量相當(dāng)，OD值分別為0.726和0.603，菌株的生長量大。其次為蛋白胨，在尿素中生長量最少。

（3）無機鹽對酵母菌生長的影響

將YPD培養(yǎng)基中的MgSO4·7H2O分別用硫酸錳、硫酸亞鐵、硫酸鋅代替，測得560 nm處的OD值見圖3。

圖2 氮源對酵母菌生長的影響

圖3 無機鹽對酵母菌生長的影響

由圖3可以看出，菌株在無機鹽為MgSO4的培養(yǎng)基中生長得最好，OD值為0.973，其次為硫酸亞鐵和硫酸錳，在硫酸鋅中生長情況最差。

2.1.2 培養(yǎng)基正交實驗結(jié)果

對培養(yǎng)基的碳源、氮源、無機鹽3個因素進行3因素3水平的正交實驗，確定蘋果酒釀酒酵母培養(yǎng)基的最佳組合。實驗結(jié)果見表4、表5。

表4 釀酒酵母Y2發(fā)酵實驗結(jié)果

由表4、表5可知，對于Y2，碳源影響最為顯著，其次為無機鹽，氮源的影響最小。方差分析結(jié)果顯示，在95%的置信區(qū)間內(nèi)，3個因素的F比都小于F臨界值，對OD值的影響不顯著。其最佳發(fā)酵參數(shù)為組合8。因此培養(yǎng)基成分的最佳組合為碳源1.5%、氮源2%、無機鹽0.15%。

表5 釀酒酵母Y2正交實驗方差分析

2.2 蘋果酒專用酵母菌培養(yǎng)條件的優(yōu)化

2.2.1 單因素實驗結(jié)果

（1）生長溫度對酵母的影響

不同溫度10℃、15℃、20℃和25℃下，120 r/min振蕩培養(yǎng)16 h，560 nm下測定OD值，實驗結(jié)果見圖4。

圖4 生長溫度對釀酒酵母Y2菌株的影響

由圖4可以看出，釀酒酵母Y2菌株隨著培養(yǎng)溫度的升高，生長量逐漸增加，在25℃時，生長最好，OD值最大為0.806。

（2）生長pH值對Y2酵母菌株的影響

不同pH值4.0、4.5、5.0和5.5的YPD液體培養(yǎng)基接種量3%，28℃下，120 r/min振蕩培養(yǎng)16 h，于560 nm下測定OD值，實驗結(jié)果見圖5。

由圖5可以看出，Y2菌株對不同的pH值適應(yīng)性不同。Y2最適pH值為4.5，OD值為0.953，隨著pH值的升高其生長量減少。

（3）接種量對Y2酵母菌的影響

將Y2按1%、1.5%、2%、2.5%接種量接種到Y(jié)PD液體培養(yǎng)基中，在28℃、120 r/min振蕩培養(yǎng)16 h后，于560 nm下測吸光度值，結(jié)果見圖6。

圖5 生長pH值實驗結(jié)果對釀酒酵母Y2的影響

圖6 接種量實驗結(jié)果對釀酒酵母Y2的影響

由圖6可以看出，Y2的最適接種量為1.5%，OD值為0.828，后隨著接種量的增加，菌株生長量減少，OD值下降。

（4）培養(yǎng)時間對酵母的影響

按3%接種量接種到Y(jié)PD液體培養(yǎng)基中，在28℃、120 r/min振蕩培養(yǎng)14 h、18 h、22 h和24 h后，于560 nm下測吸光度值，實驗結(jié)果見圖7。

圖7 培養(yǎng)時間對釀酒酵母Y2的影響

由圖7可以看出，酵母菌Y2的最適培養(yǎng)時間為14 h，OD值為0.918，后隨著培養(yǎng)時間的延長，菌株生長量減少，OD值下降。

2.2.2 培養(yǎng)條件的正交實驗結(jié)果

對培養(yǎng)條件溫度、接種量、培養(yǎng)時間和pH值4個因素進行4因素3水平的正交實驗，確定蘋果酒釀酒酵母培養(yǎng)條件的最佳組合。釀酒酵母Y2發(fā)酵實驗結(jié)果見表6、表7。

表6 釀酒酵母Y2發(fā)酵實驗結(jié)果

表7 釀酒酵母Y2正交實驗方差分析

由表6、表7可看出，培養(yǎng)溫度影響最大，其次為培養(yǎng)時間和pH值，接種量的影響最小。在95%的置信區(qū)間內(nèi)，4個因素對OD值的影響都不顯著。最佳發(fā)酵參數(shù)為組合5，其OD值達到1.30。按理論最優(yōu)條件進行驗證實驗，結(jié)果OD值小于5號組合，因此培養(yǎng)條件的最佳組合為5號，溫度25℃、接種量1.5%、培養(yǎng)時間14 h、pH4.0。

2.3 冷凍保護劑的研究

以脫脂奶粉、甘油、谷氨酸鈉和吐溫80為考察因素，采用4因素3水平的L9(34)正交實驗，確定對酵母菌Y2菌株生物量的影響，實驗結(jié)果見表8、表9。

由表8、表9可看出，谷氨酸鈉對活菌數(shù)影響最大，其次是脫脂奶粉和甘油，吐溫80的影響最小。方差分析結(jié)果顯示，在95%的置信區(qū)間內(nèi)，脫脂奶粉和谷氨酸鈉對OD值的影響顯著。最佳參數(shù)為組合5，其活菌數(shù)為84.5×1010cfu/g。按理論最優(yōu)條件進行驗證實驗，結(jié)果顯示活菌數(shù)低于組合5，因此保護劑的最佳組合為5號組合，脫脂奶粉14%、甘油3%、谷氨酸鈉3%和吐溫80為0.5%。

表8 釀酒酵母Y2保護劑實驗結(jié)果

表9 釀酒酵母Y2正交實驗方差分析

3 結(jié)論

通過單因素及正交實驗，根據(jù)測定釀酒酵母Y2在發(fā)酵過程中560 nm處的OD值，確定了Y2在發(fā)酵過程中最適宜的碳源、氮源、無機鹽分別為葡萄糖、KNO3和MgSO4，培養(yǎng)基成分的最佳組合為碳源1.5%、氮源2%、無機鹽0.15%；最適培養(yǎng)條件為溫度25℃、接種量1.5%、培養(yǎng)時間14 h、pH4.0；保護劑的最佳組合為脫脂奶粉14%、甘油3%、谷氨酸鈉3%和吐溫80為0.5%。最終獲得了適宜蘋果酒釀造的高數(shù)量和高活性的酵母菌，冷凍干燥后菌劑的活菌數(shù)為8.45×1011cfu/g。

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Y2：an S.cerevisiae Strain Exclusively Used for Cider Production

WU Rongrong1，ZHAO Juanjuan1and CHENG Shumei2
(1.College of Life Science,Hengshui University,Hengshui,Hebei 053000;2.College of Food Science and Technology,HebeiAgricultural University,Baoding,Hebei 071000,China)

In this study,the fermenting conditions and the cryoprotectant formulation of S.cerevisiae strain Y2 exclusively used for cider were explored.The results showed that,its best culture medium was composed of 1.5%glucose,2%KNO3and 0.15%MgSO4; its best culture conditions included temperature at 25℃,1.5%inoculation quantity,14 h fermenting time,and pH value 4.0(OD value of the broth reached up to 1.30);its best cryoprotectant formulation was 14%skim milk powder,3%glycerin,3%monosodium glutamate and 0.5%Tween 80,respectively(the viable count of S.cerevisiae strain reached up to 8.45×1011cfu/g).

S.cerevisiae;culture medium;culture conditions;cryoprotectant

TS262.4；TS261.4

A

1001-9286（2017）05-0047-05

10.13746/j.njkj.2016307

項目名稱“蘋果酒專用釀酒酵母Y2菌劑研究”，河北省科技支撐項目(13213002)。

2016-10-14

吳榮榮（1976-），女，河北衡水人，博士，研究方向：食品科學(xué)，E-mail：rpkxw@126.com。