郝 娟 常 婧 王 毅

(新疆喀什地區(qū)食品藥品檢驗(yàn)所，新疆 喀什 844000)

15種維藥醫(yī)院制劑微生物限度檢查方法驗(yàn)證

郝 娟 常 婧 王 毅

(新疆喀什地區(qū)食品藥品檢驗(yàn)所，新疆 喀什 844000)

目的：建立15種維藥醫(yī)院制劑的微生物限度檢查方法。方法:按《中國(guó)藥典》2010年版附錄微生物限度檢查法中細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)方法和控制菌檢查法進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果:供試品5種試驗(yàn)菌回收率菌均高于70%，控制菌均能正常檢出。結(jié)論:維藥醫(yī)院制劑必須進(jìn)行微生物限度檢查方法驗(yàn)證，才能保證檢驗(yàn)結(jié)果的正確性。

維藥醫(yī)院制劑；微生物限度；方法學(xué)驗(yàn)證；回收率

新疆維藥居多，主要以醫(yī)院制劑的形式發(fā)展。目前醫(yī)院制劑普遍存在的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法落后、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)缺項(xiàng)嚴(yán)重的問題[1]。藥品微生物檢驗(yàn)主要是根據(jù)藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)所規(guī)定的相關(guān)指標(biāo)對(duì)藥品在研制、生產(chǎn)、保存等過程中是否受到微生物污染來進(jìn)行藥品質(zhì)量以及安全性的綜合評(píng)定。[2]按《中國(guó)藥典》2010年版規(guī)定[3]，藥品進(jìn)行微生物限度檢查時(shí)必須對(duì)方法學(xué)進(jìn)行驗(yàn)證，本文參考相關(guān)文獻(xiàn)[4-7]，根據(jù)制劑中成分的抑菌作用強(qiáng)度不同，采用了常規(guī)法、培養(yǎng)基稀釋法、薄膜過濾法制備供試品溶液，建立了15種醫(yī)院制劑相應(yīng)的微生物限度檢測(cè)方法，經(jīng)方法驗(yàn)證試驗(yàn)證實(shí)該方法簡(jiǎn)便易行，消除抑菌作用有效。

1 儀器與材料

1.1 儀器:高壓蒸汽滅菌器，LDZH-150KBS，上海申安醫(yī)療器械廠；超凈工作臺(tái)，SW-CJ-2D,蘇州凈化設(shè)備有限公司；生物安全柜，BH3-1300，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；HTY-III型集菌儀,杭州泰林醫(yī)療器械廠;一次性薄膜過濾器(規(guī)格FC502;批號(hào)20150814),杭州泰林生物技術(shù)設(shè)備有限公司。

1.2 樣品:復(fù)方比黑馬爾江膠囊(批號(hào)：20141201，20141202)；艾合米爾散(批號(hào)：20150101，20150102)；黑種草子油(批號(hào)：20141201，20141202)；依提爾菲力開西尼孜丸(批號(hào)：20150201，20150202)；小茴香露劑(批號(hào)：20141201，20141202)均有新疆喀什地區(qū)葉城縣維吾爾醫(yī)醫(yī)院提供.加瓦日西庫(kù)木尼蜜膏(批號(hào)：20141101，20141201)；驅(qū)白馬日白熱斯丸(批號(hào)：20140601，20140801)；復(fù)方安吉杷爾糖漿(批號(hào)：20140901，20141101)；瑪里抗瘤丸(批號(hào)：20140701，20141101)；加瓦日西昆都爾蜜膏(批號(hào)：20141101，20141201)均有新疆喀什地區(qū)莎車縣維吾爾醫(yī)醫(yī)院提供。止痛蘇潤(rùn)江片(批號(hào)：20150101，20150102)；復(fù)方合牙日仙拜爾片(批號(hào)：20150101，20150202)；止咳祖帕片(批號(hào)：20150101，20150102)；那尼花米西克片(批號(hào)：20150101，20150102)；清血吾血白片(批號(hào)：20150101，20150102)均有新疆和田地區(qū)維吾爾醫(yī)醫(yī)院提供

1.3 培養(yǎng)基:營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(批號(hào)：110105)、玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基(批號(hào)：1012152)、營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基(批號(hào)：101213)、膽鹽乳糖增菌液批號(hào)：(1211222)、pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液(批號(hào)：1404242)、乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基(批號(hào)：101108)，營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基(批號(hào)：141103)均由北京三藥科技開發(fā)公司

1.4 菌株:金黃色葡萄球菌，大腸埃希菌，枯草芽孢桿菌，銅綠假單孢菌，白色念珠菌，黑曲霉，乙型副傷寒沙門菌均由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 菌液的制備

2.1.1 取經(jīng)35℃培養(yǎng)18～24h的金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌肉湯培養(yǎng)物1mL，加入9mL0.9%氯化鈉溶液中，10倍稀釋制成50～100cfu/mL，備用。

2.1.2 取經(jīng)25℃培養(yǎng)24～48h的白色念珠菌改良馬丁液體培養(yǎng)物1mL，加入9mL0.9%氯化鈉溶液中，10倍稀釋為50～100cfu/mL，備用。

2.1.3 取經(jīng)25℃培養(yǎng)1周的黑曲霉斜面培養(yǎng)物，加3mL0.9%滅菌氯化鈉洗下霉菌孢子，用帶有棉花的吸管取出菌液，用0.9%滅菌氯化鈉溶液10倍稀釋制成50～100cfu/mL，備用。

2.2 供試品溶液的制備

2.2.1 口服液體供試品：取樣品10mL，加pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100mL，混勻，制成1:10的供試液。

2.2.2 口服固體供試品：取樣品10g，加pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100mL，混勻，制成1:10的供試液。

2.2.3 外用液體供試品：取樣品10mL，加含2%吐溫-80的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100mL，混勻，制成1:10的供試液。

2.2.4 外用固體供試品：取樣品10g，加含2%吐溫-80的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100mL，混勻，制成1:10的供試液。

2.3 驗(yàn)證方法

2.3.1 細(xì)菌、霉菌和酵母菌計(jì)數(shù)法回收率的測(cè)定。

2.3.1.1 試驗(yàn)組：平皿法：取1mL1：10供試品溶液和50～100cfu菌液注入1個(gè)平皿中，迅速倒入15～20mL45℃左右的瓊脂培養(yǎng)基，每個(gè)菌株制備2個(gè)平皿。細(xì)菌在35℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3d，霉菌在25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5d，計(jì)數(shù)，取平均值。

培養(yǎng)基稀釋法：取0.2mL/皿1：10供試品溶液和50～100cfu菌液注入1個(gè)平皿中，照常規(guī)法進(jìn)行試驗(yàn)。

薄膜過濾法：取1：10供試液1mL加入薄膜過濾器中，沖洗液100mL/膜，在最后一次沖洗液中加入50～100cfu試驗(yàn)菌，后取膜貼于瓊脂平板，按薄膜過濾法測(cè)定其菌數(shù)。

2.3.1.2 菌液組：測(cè)定所加的試驗(yàn)菌數(shù)。

2.3.1.3 供試品對(duì)照組：取規(guī)定量供試品溶液，按菌落計(jì)數(shù)方法測(cè)定供試品本底菌數(shù)。

2.3.1.4 稀釋劑對(duì)照組：取相應(yīng)的稀釋液代替供試品溶液，加入試驗(yàn)菌，按試驗(yàn)組方法測(cè)定其菌落數(shù)。

回收率(%)=(試驗(yàn)組菌數(shù)-供試品組菌數(shù))/菌液組菌數(shù)×100%

2.3.2 控制菌檢驗(yàn)方法驗(yàn)證

2.3.2.1 大腸埃希菌：取供試液10mL及10～100cfu大腸埃希菌加至100mL膽鹽乳糖增菌液中，培養(yǎng)18～24h后，按《中國(guó)藥典》2010年版控制菌檢驗(yàn)方法檢查。

2.3.2.2 大腸菌群：取供試液1.0mL及10～100cfu大腸埃希菌加至10mL膽鹽乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基中，培養(yǎng)18～24h后，按《中國(guó)藥典》2010年版控制菌檢驗(yàn)方法檢查。

2.3.2.3 沙門菌：取供試液10mL及10～100cfu金黃色葡萄球菌加至200mL營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，培養(yǎng)18～24h后，按《中國(guó)藥典》2010年版控制菌檢驗(yàn)方法檢查。

2.3.2.4 金黃色葡萄球菌：取供試液10mL及10～100cfu金黃色葡萄球菌加至100mL營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，培養(yǎng)18～24h后，按《中國(guó)藥典》2010年版控制菌檢驗(yàn)方法檢查。

2.3.2.5 銅綠假單孢菌：取供試液10mL及10～100cfu銅綠假單孢菌加至100mL膽鹽乳糖增菌液培養(yǎng)基中，培養(yǎng)18～24h后，按《中國(guó)藥典》2010年版控制菌檢驗(yàn)方法檢查。

2.4 結(jié)果

2.4.1 常規(guī)法測(cè)定3家醫(yī)院15種供試品的回收率，進(jìn)行3次獨(dú)立平行試驗(yàn)，稀釋劑對(duì)照組回收率均高于70%，試驗(yàn)組結(jié)果見表1。復(fù)方比黑馬爾江膠囊、黑種草子油、依提爾菲力開西尼孜丸、小茴香露劑、復(fù)方安吉杷爾糖漿、止咳祖帕片、清血吾血白片采用常規(guī)法5種試驗(yàn)菌的回收率均高于70%，證明無抑菌現(xiàn)象。加瓦日西庫(kù)木尼蜜膏、驅(qū)白馬日白熱斯丸、瑪里抗瘤丸、加瓦日西昆都爾蜜膏、止痛蘇潤(rùn)江片等5種對(duì)枯草芽孢桿菌有明顯抑制作用，其中加瓦日西昆都爾蜜膏采用薄膜過濾法(100mL/膜)可消除其抑菌作用，其他4種采用培養(yǎng)基稀釋法(0.2mL/皿)可消除其抑菌作用。艾合米爾散、復(fù)方合牙日仙拜爾片、那尼花米西克片對(duì)金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌均有明顯抑制作用，采用培養(yǎng)基稀釋法(0.2mL/皿)可消除其抑菌作用。

表1 15種維藥醫(yī)院制劑微生物限度檢查方法驗(yàn)證結(jié)果

2.4.2 15種樣品控制菌檢查均可采用常規(guī)法進(jìn)行檢驗(yàn)，說明對(duì)各類控制菌均無抑制作用。

表2 控制菌檢查方法驗(yàn)證結(jié)果

3 討論

3.1 細(xì)菌、霉菌及酵母菌及控制菌檢查方法的確立：通過對(duì)15種維藥醫(yī)院制劑微生物限度檢查法的建立研究，表明對(duì)于細(xì)菌、霉菌及酵母菌的檢驗(yàn)，復(fù)方比黑馬爾江膠囊、黑種草子油、依提爾菲力開西尼孜丸、小茴香露劑、復(fù)方安吉杷爾糖漿、止咳祖帕片、清血吾血白片可采用平皿法(1mL/皿)，加瓦日西庫(kù)木尼蜜膏、驅(qū)白馬日白熱斯丸、瑪里抗瘤丸、止痛蘇潤(rùn)江片、艾合米爾散、復(fù)方合牙日仙拜爾片、那尼花米西克片可采用培養(yǎng)基稀釋法(0.2mL/皿)，加瓦日西昆都爾蜜膏采用薄膜過濾法(100mL/膜)進(jìn)行檢驗(yàn)。15種維藥醫(yī)院制劑控制菌檢查均采用常規(guī)法。

3.2 方法確立結(jié)果的討論：通過方法學(xué)驗(yàn)證試驗(yàn)，能有效地消除或減弱制劑中抑菌成分的影響，增加了實(shí)際用藥檢測(cè)的方法借鑒和數(shù)據(jù)支持，使檢測(cè)結(jié)果與實(shí)際更接近，進(jìn)一步說明了維藥醫(yī)院制劑微生物檢查方法驗(yàn)證的必要性和重要性。

3.3 小結(jié)：本研究采用中國(guó)藥典規(guī)定的藥品微生物限度檢查方法對(duì)15種維藥醫(yī)院制劑微生物限度檢查方法進(jìn)行驗(yàn)證，藥品微生物限度檢測(cè)是反映藥品質(zhì)量的重要依據(jù)。藥品出現(xiàn)微生物污染會(huì)導(dǎo)致患者出現(xiàn)嚴(yán)重的腸道反應(yīng)、甚至引發(fā)失明、敗血癥等嚴(yán)重后果[8]。目前，新疆維吾爾自治區(qū)共有民族醫(yī)醫(yī)療機(jī)構(gòu)48家，民族醫(yī)醫(yī)療機(jī)構(gòu)制劑室22個(gè)，可配制制劑品種1545個(gè)，新疆民族藥事業(yè)發(fā)展步入了標(biāo)準(zhǔn)化、規(guī)范化軌道。民族藥標(biāo)準(zhǔn)化帶來的是人們?nèi)罕姷挠盟幇踩?，是市?chǎng)對(duì)民族藥產(chǎn)品的認(rèn)可，科學(xué)合理地制定民族藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，將對(duì)推進(jìn)民族藥及其生產(chǎn)的規(guī)范化、標(biāo)準(zhǔn)化、現(xiàn)代化產(chǎn)生積極而深遠(yuǎn)的影響[9]。開展民族藥研究，對(duì)于保證和提高民族藥用藥安全，促進(jìn)各民族間文化交流和地區(qū)經(jīng)濟(jì)發(fā)展，將發(fā)揮極大作用[10]。藥品安全性是臨床應(yīng)用的重要前提以及必要保證，其對(duì)于避免將受到微生物污染的制劑應(yīng)用于人體，危害患者生命安全具有重要意義。因此，依據(jù)相關(guān)規(guī)定對(duì)藥品進(jìn)行無菌檢測(cè)是保證患者用藥安全的必要環(huán)節(jié)[11]。

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2016年11月29日收稿

The microbial limit test of 15 Uighur medicine hospital preparations.

HAO Juan CHANG Jin WANG Yi

(Kashi district institute for food and drug control in Xinjiang)

Objective To establish a method for the microbial limit test of 15 Uighur medicine hospital preparations.Methods A validation on the microbial limit test method was conducted in accordance with the counting method of bacteria,mycetes and yeasts and the control bacteria test method stated in the Appendix of China Pharmacopoeia (2010 edition).Results The recoveries of five test organisms were higher than 70%,the control microorganisms were properly detected .Conclusion Uighur medicine hospital preparations should undergo validation with the microbial limit test method to ensure the correctness of test results.

Uighur medicine hospital preparations;microbiallimit;validation of method;recovery rate

R291.5

B

1006-6810(2017)04-0039-04