陳育娟， 吳培陽， 高瑞秋

(1. 廈門市婦幼保健院產(chǎn)科， 福建 廈門 361000; 2. 廈門大學附屬第一醫(yī)院醫(yī)務(wù)科， 福建 廈門 361000)

MiR-218對滋養(yǎng)層細胞遷移侵襲的影響及其機制研究*

陳育娟1△， 吳培陽2， 高瑞秋1

(1. 廈門市婦幼保健院產(chǎn)科， 福建 廈門 361000; 2. 廈門大學附屬第一醫(yī)院醫(yī)務(wù)科， 福建 廈門 361000)

目的：研究miR-218是否通過下調(diào)SOX4影響滋養(yǎng)層細胞系HTR-8細胞的遷移和侵襲。方法：妊娠期高血壓疾病(HDCP)患者46例，平均年齡(31±4.6)歲，收縮期血壓≥140 mmHg和/或舒張期血壓>90 mmHg；以血壓正常孕婦50例為對照，實時熒光定量PCR(RT-PCR)檢測兩組患者靜脈血中miR-218的表達情況。轉(zhuǎn)染miR-218mimic和miR-NC至離體培養(yǎng)的HTR-8細胞中，將細胞分為對照組(加入DMEM)、空質(zhì)粒組(加入miR-NC)和過表達miR-218組(加入miR-218 mimic)3組，檢測細胞的遷移侵襲情況以及細胞中MMP-2和MMP-9的表達，，生物信息學預測miR-218潛在靶基因為SOX4，利用熒光素酶素試驗驗證SOX4是miR-218的靶基因；再通過轉(zhuǎn)染過表達SOX4的質(zhì)粒至HTR-8細胞，HTR-8細胞分為過表達miR-218組、過表達miR-218+空質(zhì)粒組、過表達miR-218+SOX4組，以上方法檢測HTR-8細胞的遷移侵襲情況。結(jié)果：相比于正常孕婦組，HDCP組患者血清中miR-218表達減少(P<0.01)。相比于空質(zhì)粒組，轉(zhuǎn)染miR-218mimic后，HTR-8細胞中MMP-2、MMP-9、SOX4的表達減少(P<0.01)，細胞遷移和侵襲能力下降(P<0.01)；熒光素酶試驗結(jié)果顯示，miR-218能夠顯著降低 SOX4-3'-UTR 質(zhì)粒的熒光素活性(P<0.01)；相比于miR-218+空質(zhì)粒組，轉(zhuǎn)染過表達SOX4質(zhì)粒后，HTR-8細胞遷移和侵襲能力增加(P<0.01)。結(jié)論：HDCP患者血清中miR-218表達減少，miR-218可以通過下調(diào)SOX4從而抑制HTR-8細胞的遷移和侵襲。

妊娠期高血壓疾??；微小RNA218；SOX4；滋養(yǎng)層細胞；侵襲

【DOI】 10.12047/j.cjap.5453.2017.043

功能性胎盤的形成是胚胎正常發(fā)育的基礎(chǔ)，

在胎盤發(fā)育過程中，滋養(yǎng)層細胞的遷移與侵襲受到機體嚴格的調(diào)節(jié)。目前研究表明滋養(yǎng)層細胞的過度遷移和侵襲在早期流產(chǎn)、妊娠期高血壓疾病(hypertensive disorder complicating pregnancy，HDCP)以及胎兒宮內(nèi)發(fā)育遲緩等妊娠期疾病的發(fā)生發(fā)展中具有重要的作用[1]。

MiRNAs是一類內(nèi)源性的非編碼RNA，由19～25個左右核苷酸組成，通過與靶mRNA的3’-UTR堿基互補配對，從而抑制mRNA翻譯或直接使其降解，導致靶基因的表達在轉(zhuǎn)錄后水平受到抑制，最終調(diào)控基因表達。現(xiàn)已有多個研究發(fā)現(xiàn)miRNAs參與HDCP的進程[4,5]。MiR-218是一種miRNA，我們前期研究發(fā)現(xiàn)miR-218在HDCP患者血清中表達降低，推測miR-218的表達失衡可能參與HDCP的病理生理過程。生物信息檢索發(fā)現(xiàn)性別決定區(qū)域轉(zhuǎn)錄因子4(sex determining region Y-box 4，SOX4)基因為miR-218的潛在作用位點，而SOX4在調(diào)控細胞的遷移和侵襲功能中具有重要的作用[6]。本研究擬通過用miR-218干預滋養(yǎng)層細胞系HTR-8細胞，探索miR-218對HTR-8細胞遷移侵襲能力的影響，并擬進一步用熒光酶素試驗和轉(zhuǎn)染過表達SOX4質(zhì)粒至HTR-8細胞的方法驗證miR-218是通過靶向抑制SOX4的表達從而發(fā)揮抑制HTR-8細胞遷移侵襲的作用，探討miR-218在HDCP發(fā)病機制中的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集廈門市婦幼保健院HDCP患者46例，平均年齡(31±4.6)歲，行孕檢的無高血壓孕婦50例，平均年齡(29±4.1)歲。采集患者靜脈血后立即離心，上清液-80℃冰箱保存。HDCP患者血壓：收縮期血壓≥140 mmHg和/或舒張期血壓>90 mmHg；正常孕婦血壓：收縮期血壓<140 mmHg和/或舒張期血壓<90 mmHg。本研究中患者均簽署知情同意書，并由醫(yī)學倫理委員會審核通過。

1.2 實驗試劑

滋養(yǎng)層細胞系HTR-8細胞購于上海拜力生物公司；限制性內(nèi)切酶BamHⅠ、T4 DNA連接酶、XhoⅠ、RNA提取試劑(Invitrogen公司)；DMEM培養(yǎng)液、胰蛋白酶(Sigma公司)；胎牛血清(GIBCO公司)；takara逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(大連寶生物公司)；SYBR Green熒光染料試劑盒(Roche公司)；無內(nèi)毒素質(zhì)粒小、大提取試劑盒；兔或鼠抗人MMP-2、MMP-9、SOX4、GAPDH、β-actin多克隆抗體(ABCAM公司)；脂質(zhì)體2000(上海英駿公司)；DAPI(Rcohe公司)；辣根過氧化酶標記的山羊抗兔或者抗鼠二抗、FITC標記的山羊抗兔IGg(jackson公司)；Western blot相關(guān)試劑(江蘇碧云天生物技術(shù)研究所)。

1.3 實驗分組

在miR-218mimic轉(zhuǎn)染HTR-8細胞后，將細胞分為對照組、空質(zhì)粒組和過表達miR-218組3組；在用過表達SOX4的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HTR-8細胞后，將HTR-8細胞分為過表達miR-218組、過表達miR-218+空質(zhì)粒組、過表達miR-218+SOX4組。

1.4 轉(zhuǎn)染細胞株

過表達質(zhì)粒的構(gòu)建：miR-218-mimic由上海吉瑪公司設(shè)計合成，miR-218-mimic序列為，正義鏈：5'- ACAUGGUUAGAUCAAGCACAA-3'，反義鏈：3'- UGUACCAAUCUAGUUCGUGUU-5'[7]。SOX4過表達質(zhì)粒由上海吉瑪公司設(shè)計合成，通過Pubmed查找SOX4基因的序列，引物根據(jù)Genebank中SOX4 mRNA序列設(shè)計引物。其上游引物： 5′-CTTGACATGATTAGCTGGCATGATT -3′；下游引物：5′-CCTGTGCAATATGCCGTGTAGA -3′。Sox4基因和質(zhì)粒DNA連接后，篩選重組質(zhì)粒，測序驗證。

轉(zhuǎn)染：將HTR-8細胞接種至6孔板，待細胞生長至50%～70%密度時，以脂質(zhì)體2000分別轉(zhuǎn)染miR-218mimic或mimic-對照；SOX4過表達質(zhì)?；蚩召|(zhì)粒，各100 pmol 24 h后，提取總RNA或者蛋白后，通過PCR或者Western blot鑒定轉(zhuǎn)染的效率，進行后續(xù)試驗。

由于飛機所包含的參數(shù)量是巨大的，涉及飛機的各個方面，管理和調(diào)用的難度很大。使用數(shù)據(jù)庫技術(shù)可以高效地管理飛機數(shù)據(jù)，其與互聯(lián)網(wǎng)的結(jié)合使信息的傳播速度和范圍都有了大幅度的提升，也有利于數(shù)據(jù)庫的進一步完善。將飛機數(shù)據(jù)庫的搭建與“互聯(lián)網(wǎng)+”相結(jié)合，飛機設(shè)計者能夠便捷地使用飛機數(shù)據(jù)庫中現(xiàn)有的飛機數(shù)據(jù)作為依據(jù)，為今后的飛機設(shè)計進行指導，對于飛機設(shè)計者而言具有深遠的意義。

1.5 熒光定量RT-PCR檢測基因表達

提取血清或細胞中的總RNA，將提取的總RNA逆轉(zhuǎn)錄成 cDNA，反應體系為20 μl，反應條件為：16℃(30 min)，45℃(30 min)，85℃(5 min)。miR-128的引物為forward: 5′-CGGGCTTGTGCTTGATCTA-3′; reverse:5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′. U6的引物為forward: 5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′; reverse: 5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′.運用SYBR Green法檢測miR-218的表達情況，運用的反應條件為：94℃(15 min)，94℃(30 s)，60℃(30 s)，72℃(30 s)，共循環(huán)40次；最后72℃延伸8 min。每組樣品重復3次，試驗重復3次，統(tǒng)計分析各標本中miR-218的表達。

1.6 Western blot檢測蛋白表達量

提取細胞總蛋白，BCA法定量蛋白后，SDS-PAGE膠每孔加入20 μl的樣品，80 V 30 min進行蛋白濃縮，110 V 2 h進行蛋白分離，并用孔徑0.45 μm的PVDF膜250 mA 80 min進行蛋白轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜后常溫下TBST漂洗3次、封閉血清封閉1 h后，以1∶1 000濃度加入兔(鼠)抗人MMP-2一抗(或抗MMP-9、SOX4、β-actin一抗)，4℃孵育過夜，常溫下TBST洗膜3次，辣根過氧化物酶標記羊抗兔(鼠)二抗孵育后ECL化學發(fā)光法檢測。柯達膠片暗室顯影，Quantity one軟件分析。

1.7 劃痕實驗(Wound healing)

HTR-8細胞鋪滿板底后，無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h使細胞同步化，加入 1.8 mmol /L 羥基脲作用 12 h抑制細胞增殖，根據(jù)上述分組轉(zhuǎn)染細胞，轉(zhuǎn)染成功后。用100 μl槍頭垂直孔板制造劃痕，棄細胞培養(yǎng)液，PBS沖洗孔板3次，繼續(xù)在細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。拍照記錄0、24 h圖片，用image pro plus6.0分析計算出細胞遷移的面積，細胞遷移的面積與原劃痕面積比值表示各組細胞的遷移情況。

1.8 Transwell法測細胞遷移

1.9 熒光素酶試驗

設(shè)計合成SOX4-3'-UTR的序列及突變序列，以SOX4質(zhì)粒為載體，分別構(gòu)建能夠表達熒光素酶的包含SOX4-3'-UTR和SOX4-3'-UTR突變序列的質(zhì)粒，然后將HTR-8細胞按每孔1×105接種至24孔板，24 h后以脂質(zhì)體2000共轉(zhuǎn)染200 ng 包含SOX4-3'-UTR或SOX4-3'-UTR突變序列的熒光素酶質(zhì)粒和80 ng 海腎熒光質(zhì)粒以及60 pmol miR-218 mimic或?qū)φ眨?8 h后用熒光檢測儀檢測熒光強度，海腎熒光作為內(nèi)參照，每組試驗重復3次。

1.10 統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果

2.1 miR-218在HDCP患者和正常孕婦血清中的表達情況

實時熒光定量PCR檢測HDCP患者和正常孕婦血清中miR-218的表達情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HDCP患者血清中 miR-218的表達明顯低于正常孕婦(P<0.01，圖1)。

2.2 miR-218對HTR-8細胞遷移侵襲的影響

MiR-218 mimic轉(zhuǎn)染HTR-8細胞后，實時熒光定量PCR檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-218組中miR-218的表達較對照組和空質(zhì)粒組明顯升高(P<0.01，圖2A)。MiR-218mimic轉(zhuǎn)染HTR-8細胞細胞后，相比于對照組和空質(zhì)粒組，miR-218組中HTR-8細胞的遷移減少(P<0.01，圖2B)；侵襲能力降低(P<0.01，圖2C)。Western blot檢測發(fā)現(xiàn)，相比于空白對照組和空質(zhì)粒組，miR-218組HTR-8細胞中MMP-2、MMP-9這兩種與細胞侵襲遷移密切相關(guān)的蛋白表達減少(P<0.01，圖2D)。

Fig. 1 Expressions of miR-218 in the serum of normal pregnant woman and HDPC patients HDCP: Hypertensive disorder complicating pregnancyn(Normal control)=50;n(HDCP)=46**P<0.01vsnormal control

2.3 miR-218通過識別3'-UTR抑制SOX4的表達

分別構(gòu)建包含SOX4-3'-UTR和其突變序列的熒光素酶質(zhì)粒(圖3A)，與miR-218-mimic或者空質(zhì)粒對照共轉(zhuǎn)HTR-8細胞，培養(yǎng)24 h后，檢測各組細胞熒光素酶活性。結(jié)果顯示，miR-218-mimic+WT-SOX4-3'-UTR組熒光素酶活性顯著低于空質(zhì)粒+WT-SOX4-3'-UTR組(P<0.01,圖3B)。Western blot檢測結(jié)果顯示，相比于對照組和空質(zhì)粒組，miR-218組HTR-8細胞中SOX4的表達明顯降低(P<0.01,圖3C)。

2.4 過表達SOX4可以逆轉(zhuǎn)miR-218對HTR-8細胞遷移侵襲的抑制作用

過表達Sox4的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HTR-8細胞后，相比于空質(zhì)粒組，Sox4組HTR-8細胞中Sox4的表達增加(P<0.01，圖4A)；相比于miR-218組和miR-218+空質(zhì)粒組，miR-218+Sox4組中HTR-8細胞的遷移和侵襲增加(P<0.01，圖4B)；Western blot檢測發(fā)現(xiàn)，相比于miR-218組和miR-218+空質(zhì)粒組，miR-218+Sox4組HTR-8細胞中MMP-2、MMP-9表達增加(P<0.01，圖4C、D)。

3 討論

蛋白的表達，從而發(fā)揮抑制多種腫瘤細胞增殖和侵襲的作用[10,11]。本研究通過用miR-218干預HTR-8細胞，發(fā)現(xiàn)miR-218可以抑制HTR-8細胞中MMP-2、MMP-9的表達，可以抑制HTR-8細胞的遷移和侵襲，這可能是miR-218參與HDPC病理生理進程的機制之一。

SOX4基因?qū)儆赟OX C亞族，主要表達于胚胎發(fā)育過程中的中樞神經(jīng)系統(tǒng)、心臟和胸腺。目前已有多個研究證實SOX4表達增加可以促進細胞的增殖和遷移[6,12]。Wang等人研究結(jié)果顯示miR-211可以通過靶向抑制Sox4的表達從而抑制胃癌細胞的增殖和遷移[6]。之后Jin等人的研究結(jié)果也顯示miR-388可以通過下調(diào)Sox4的表達，抑制乳腺癌細胞的侵襲[13]。本課題組通過生物信息檢索發(fā)現(xiàn)SOX4基因為miR-218的潛在作用位點，并在用miR-218mimic干預HTR-8細胞后，細胞中Sox4的表達減少。之后我們進一步通過熒光素酶素試驗發(fā)現(xiàn)miR-218可以與Sox4的3'-UTR靶向結(jié)合，從而減少Sox4的表達。鑒于Sox4在細胞遷移侵襲中的重要性，我們進一步用Sox4過表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HTR-8細胞，發(fā)現(xiàn)Sox4過表達質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染可以逆轉(zhuǎn)miR-218抑制HTR-8細胞遷移侵襲的作用。以上實驗結(jié)果提示miR-218是通過下調(diào)Sox4的表達，從而發(fā)揮抑制HTR-8細胞遷移侵襲的作用。這也是首次發(fā)現(xiàn)miR-128可以通過抑制Sox4發(fā)揮抗癌作用，為miR-218在腫瘤治療中的應用提供思路。

本實驗在發(fā)現(xiàn)miR-218在HDCP患者血清中表達降低的基礎(chǔ)上，進一步通過體外細胞實驗，發(fā)現(xiàn)miR-218可以抑制HTR-8細胞的遷移侵襲，并進一步通過螢光素酶和轉(zhuǎn)染過表達SOX4質(zhì)粒的方法證明其機制是通過靶向抑制SOX4的表達，進一步闡明miR-218在HDCP發(fā)病機制中的作用，為HDCP的診治提供新的思路。

[1] Zuo Y, Fu Z, Hu Y,etal. Effects of transforming growth factor-beta1 on the proliferation and invasion of the HTR-8/SVneo cell line[J].OncolLett, 2014, 8(5): 2187-2192.

[2] 張楹怡, 田衛(wèi)平, 梅 玫. miR-21與DNA甲基化在不同乳腺癌細胞中的相互作用[J]. 中國應用生理學雜志, 2015, 31(3): 220-224.

[3] 吳 揚, 耿 鵬, 王玉琴, 等. MicroRNA-1在心肌肥大中對L-型鈣通道β2亞基的負性調(diào)控作用[J]. 中國應用生理學雜志, 2012, 28(4): 304-308.

[4] Xu P, Zhao Y, Liu M,etal. Variations of microRNAs in human placentas and plasma from preeclamptic pregnancy[J].Hypertension, 2014, 63(6): 1276-1284.

[5] Luo R, Shao X, Xu P,etal. MicroRNA-210 contributes to preeclampsia by downregulating potassium channel modulatory factor 1[J].Hypertension, 2014, 64(4): 839-845.

[6] Wang CY, Hua L, Sun J,etal. MiR-211 inhibits cell proliferation and invasion of gastric cancer by down-regulating SOX4[J].IntJClinExpPathol, 2015, 8(11): 14013-14020.

[7] Yang M, Liu R, Li X,etal. Epigenetic repression of miR-218 promotes esophageal carcinogenesis by targeting ROBO1[J].IntJMolSci, 2015, 16(11): 27781-27795.

[8] Anton L, Olarerin-George AO, Hogenesch JB,etal. Placental expression of miR-517a/b and miR-517c contributes to trophoblast dysfunction and preeclampsia[J].PLoSOne, 2015, 10(3): e0122707.

[9] Weedon-Fekjaer MS, Sheng Y, Sugulle M,etal. Placental miR-1301 is dysregulated in early-onset preeclampsia and inversely correlated with maternal circulating leptin[J].Placenta, 2014, 35(9): 709-717.

[10]Fu WM, Tang LP, Zhu X,etal. MiR-218-targeting-Bmi-1 mediates the suppressive effect of 1,6,7-trihydroxyxanthone on liver cancer cells[J].Apoptosis, 2015, 20(1): 75-82.

[11]Kong Y, Sun B, Han Q,etal. Slit-miR-218-Robo axis regulates retinal neovascularization[J].IntJMolMed, 2016, 37(4): 1139-1145.

[12]Sun R, Jiang B, Qi H,etal. SOX4 contributes to the progression of cervical cancer and the resistance to the chemotherapeutic drug through ABCG2[J].CellDeathDis, 2015, 6: e1990.

[13]Jin Y, Zhao M, Xie Q,etal. MicroRNA-338-3p functions as tumor suppressor in breast cancer by targeting SOX4[J].IntJOncol, 2015, 47(4): 1594-1602.

MiR-218 inhibits HTR-8 cells migration and invasion by targeting SOX4

CHEN Yu-juan1△, WU Pei-yang2, GAO Rui-qiu1

(1. Department of Obstetrics, Maternal and Child Hospital of Xiamen City, Xiamen 361000; 2.Department of Medical,the First Affiliated Hospital of Xiamen University, Xiamen 361000, China)

Objective: To verify whether miR-218 could inhibit human trophoblastic cell (HTR-8 cells) migration and invasion by targeting sex determining region Y-box 4(SOX4). Methods: The serum samples were collected from 46 hypertensive disorder complicating pregnancy (HDCP) and 50 normal pregnant women. RT-PCR was used to test the expression of miR-218 in the serum. In vitro, MiR-218 was transfected into HTR-8 cells. The HTR-8 cells were divided into three groups: normal control group, mimic control and miR-218 mimic group. The migratory and invasion ability of HTR-8 cells was tested, and the expressions of matrix metalloproteinase-2(MMP-2), MMP-9 and Sox4 were also investigated in the cells of each group. Luciferase assay was used to confirme whether Sox4-3'-UTR was the target gene of miR-218． Results: The expression of miR-218 was decreased in the serum of HDCP patients compared with the normal pregnant woman(P<0.01).Invitro, compared with the control group, the invasion and migration ability of HTR-8 cells and the expression of MMP-2 MMP-9 and SOX4 were decreased in the miR-218 group (P<0.01); The Luciferase activity of the SOX4-3'-UTR plasmid was significantly suppressed by miR-218 (P<0.01); Over expression of SOX4 could reverse the effect of miR-218 on HTR-8 cells(P<0.01). Conclusion: The expression of miR-218 decreases in the serum of HDPC patients and miR-218 inhibits HTR-8 cells invasion by targeting SOX4-3'-UTR.

hypertensive disorder complicating pregnancy(HDCP); miR-218; sex determining region Y-box 4; trophoblast cell; invasion

國家自然科學青年基金(U1204801)

2016-05-05

2016-12-09

R714.252

A

1000-6834(2017)02-169-06

△【通訊作者】Tel： 13950092828; E-mail: chenyujuanfzxm@sina.com