梁 健, 李煥春

(華南師范大學(xué)體育科學(xué)學(xué)院, 廣東 廣州 510631)

預(yù)熱處理對(duì)離心運(yùn)動(dòng)大鼠骨骼肌超微結(jié)構(gòu)、血清CK、LDH及氧化應(yīng)激的影響*

梁 健, 李煥春△

(華南師范大學(xué)體育科學(xué)學(xué)院, 廣東 廣州 510631)

目的：采用離心運(yùn)動(dòng)和熱處理研究預(yù)熱處理對(duì)離心運(yùn)動(dòng)大鼠骨骼肌的保護(hù)作用。方法：SD大鼠分安靜組(n=8)，運(yùn)動(dòng)組(n=32)和預(yù)熱處理運(yùn)動(dòng)組(n=40)，運(yùn)動(dòng)組運(yùn)動(dòng)完成后分為運(yùn)動(dòng)即刻組(E1)、運(yùn)動(dòng)后24 h組(E2)、運(yùn)動(dòng)后48 h組(E3)和運(yùn)動(dòng)后6 d(E4)組，熱處理組在4個(gè)周期熱處理后分熱處理安靜組(HE)、熱處理運(yùn)動(dòng)即刻組(HE1)、熱處理運(yùn)動(dòng)后24 h組(HE2)、熱處理運(yùn)動(dòng)后48 h組(HE3)和熱處理運(yùn)動(dòng)后6 d(HE4)組；運(yùn)動(dòng)采用-16°坡度、速度20 m/min、時(shí)間120 min的一次性離心力竭跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)至力竭模型；預(yù)熱處理采用每4 d為一個(gè)周期, 3 d進(jìn)行熱處理、1 d休息，共4個(gè)周期，期間濕度控制在50%，肛溫起始溫度從39±0.5℃，依次遞增到39.5±0.5℃、40.5±0.5℃和41.5±0.5℃，監(jiān)測(cè)大鼠直腸溫度達(dá)到預(yù)定值以后維持15 min。實(shí)驗(yàn)后取血和骨骼肌，觀察骨骼肌超微結(jié)構(gòu)和血清肌酸激酶(CK)、乳酸脫氫酶(LDH)及氧化應(yīng)激指標(biāo)的變化。結(jié)果：預(yù)熱處理運(yùn)動(dòng)后不同時(shí)相血清CK、LDH值低于單純運(yùn)動(dòng)組，其中HE1及HE2組與同時(shí)相的E1、E2的CK值都呈顯著性差異(P<0.05)，HE1、HE2及HE3組的血清LDH值顯著低于同時(shí)相的E1、E2及 E3組(P<0.05)；HE2及HE3組的血清超氧化物歧化酶(SOD)值都分別高于同時(shí)相的E1、E2組，并且兩兩之間呈顯著性差異(P<0.05),HE2組的血清丙二醛(MDA)值顯著低于E2組(P<0.05)。結(jié)論：運(yùn)動(dòng)預(yù)熱處理對(duì)預(yù)防運(yùn)動(dòng)性骨骼肌損傷有一定作用。

預(yù)熱處理；大鼠；運(yùn)動(dòng)；骨骼肌；超微結(jié)構(gòu)；氧化應(yīng)激

preheat treatment; rat; exercise; skeletal muscle; ultrastructure; oxidative stress

【DOI】 10.12047/j.cjap.5505.2017.026

運(yùn)動(dòng)骨骼肌損傷在運(yùn)動(dòng)活動(dòng)中非常普遍，其生理特征非常復(fù)雜，一直是國(guó)內(nèi)外運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)界研究的重點(diǎn)。研究表明，高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)或者超過(guò)習(xí)慣負(fù)荷的運(yùn)動(dòng)都有可能導(dǎo)致出現(xiàn)骨骼肌損傷[1]，使骨骼肌超微結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，并伴隨著酶、血液氧化應(yīng)激等生化指標(biāo)的改變[3]。生物體會(huì)對(duì)加于它的任

何應(yīng)激發(fā)生非特異性反應(yīng)，并通過(guò)綜合性生理體征表現(xiàn)出來(lái)。研究表明，熱處理能誘導(dǎo)大鼠骨骼肌產(chǎn)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)并誘導(dǎo)大鼠骨骼肌功能發(fā)生適應(yīng)性改變,有利于骨骼肌的保護(hù)[2]，這為預(yù)熱處理對(duì)運(yùn)動(dòng)性骨骼肌損傷的預(yù)防提供一種可能。目前預(yù)熱處理對(duì)運(yùn)動(dòng)骨骼肌損傷的研究少有報(bào)道，本文試圖研究預(yù)熱處理對(duì)大強(qiáng)度離心運(yùn)動(dòng)后大鼠骨骼肌超微結(jié)構(gòu)、血清CK、LDH及其血清氧化應(yīng)激變化影響，為預(yù)熱處理作為運(yùn)動(dòng)性骨骼肌損傷的預(yù)防措施提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

平均重量為140.25±12.34 g的清潔級(jí)雄性SD大鼠購(gòu)自南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，置于溫度為22±0.3℃，濕度50%～60%下清潔級(jí)動(dòng)物房中喂養(yǎng)。所有動(dòng)物自由飲食、飲水，適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后進(jìn)行隨機(jī)分組。大鼠分為安靜組(8只)、運(yùn)動(dòng)組(32只)及熱處理運(yùn)動(dòng)組(40只)，其中運(yùn)動(dòng)組隨機(jī)分為運(yùn)動(dòng)即刻組(E1)、運(yùn)動(dòng)后24 h組(E2)、運(yùn)動(dòng)后48 h組(E3)和運(yùn)動(dòng)后6 d(E4)組，每組8只，熱處理組在熱處理完成后隨機(jī)分為熱處理安靜組(HE)、熱處理運(yùn)動(dòng)即刻組(HE1)、熱處理運(yùn)動(dòng)后24 h組(HE2)、熱處理運(yùn)動(dòng)后48 h組(HE3)和熱處理運(yùn)動(dòng)后6 d(HE4)組，每組8只。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 運(yùn)動(dòng)方案 運(yùn)動(dòng)方案采用一次性離心力竭跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)模型。坡度設(shè)置為-16°，跑臺(tái)恒定速度20 m/min，運(yùn)動(dòng)持續(xù)時(shí)間120 min，直至運(yùn)動(dòng)力竭。運(yùn)動(dòng)后大鼠運(yùn)動(dòng)能力顯著下降，間歇次數(shù)明顯增多，不能再次完成運(yùn)動(dòng)，且運(yùn)動(dòng)后基本無(wú)逃避能力，呈明顯疲勞狀，表明符合離心力竭運(yùn)動(dòng)模型。

1.2.2 預(yù)熱處理的方法 大鼠置于恒溫桑拿環(huán)境中進(jìn)行預(yù)熱處理,并實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)肛溫。熱處理每4 d為一個(gè)周期,其中3 d進(jìn)行熱處理,1 d休息，共進(jìn)行4個(gè)周期。熱處理期間濕度控制在50%，熱處理肛溫起始溫度從(39±0.5)℃，依次遞增到(39.5±0.5)℃、(40.5±0.5)℃和(41.5±0.5)℃，監(jiān)測(cè)大鼠直腸溫度達(dá)到預(yù)定值以后維持15 min。熱處理期間,嚴(yán)格控制溫度和濕度,并觀察大鼠行為。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)樣本的選取與測(cè)定方法 大鼠在完成運(yùn)動(dòng)和熱處理后按分組分別進(jìn)行宰殺。采用7%水合氯醛(0.4 ml/100 g)腹腔注射麻醉后腹主動(dòng)脈取血。取血后立即置入抗凝管并分離血清，血清置于-70℃超冰箱中保存待用。取血后進(jìn)行比目魚肌分離，所得比目魚肌按電鏡要求快速切取小塊肌組織，放入2.5%戊二醛4℃固定。比目魚肌經(jīng)2.5%戊二醛4℃固定過(guò)夜后進(jìn)過(guò)漂洗、固定、脫水、浸透、包埋、聚合等過(guò)程后，制成超薄切片。將制備好的電鏡標(biāo)本置于HITACHI，H-7500透射電子顯微鏡下觀察、拍照。觀察內(nèi)容主要為肌原纖維、肌節(jié)排列的規(guī)則程度，A帶、I帶完整情況和位置關(guān)系，Z線和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體的改變。血清CK、LDH采用酶動(dòng)力進(jìn)行測(cè)定，血清SOD通過(guò)黃嘌呤氧化酶法測(cè)試，MDA采用硫代巴比妥酸(TBA)法進(jìn)行測(cè)試。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)后大鼠骨骼肌超微結(jié)構(gòu)的變化

運(yùn)動(dòng)后即刻大多數(shù)肌原纖維正常，具有排列整齊的Z線，但見(jiàn)部分肌原纖維有小的肌溶灶，Z線模糊，肌質(zhì)網(wǎng)輕度擴(kuò)張；肌原纖維間線粒體形態(tài)、排列正常(圖A)；運(yùn)動(dòng)后24 h大多數(shù)肌原纖維正常，肌原纖維具有排列整齊的Z線，但見(jiàn)部分肌原纖維有小的肌溶灶，Z線消失；肌膜連續(xù)，肌膜偶見(jiàn)線粒體堆積，且伴有嵴疏松變性(圖B、圖C)。運(yùn)動(dòng)后48 h大多數(shù)肌原纖維正常，肌原纖維具有排列整齊的Z線，但見(jiàn)部分肌原纖維呈水紋樣疏松變性；肌膜連續(xù)，肌膜偶見(jiàn)線粒體堆積，細(xì)胞核周圍有線粒體堆積(圖D、圖E)。

熱處理后運(yùn)動(dòng)即刻大多數(shù)肌原纖維正常，具有排列整齊的Z線，肌原纖維間線粒體形態(tài)、肌膜連續(xù)，肌膜下偶見(jiàn)線粒體堆積，數(shù)量形態(tài)正常(圖F)。預(yù)熱處理運(yùn)動(dòng)后24 h后肌原纖維正常，肌膜下肌原纖維具有排列整齊的Z線，肌膜連續(xù)，肌膜下偶見(jiàn)線粒體堆積，數(shù)量形態(tài)正常，部分肌質(zhì)網(wǎng)輕度擴(kuò)張,肌原纖維間線粒體形態(tài)、排列正常(圖G，圖H)。電鏡觀察預(yù)熱適應(yīng)運(yùn)動(dòng)48 h后，肌膜下線粒體堆積較少，可見(jiàn)糖原顆粒；肌細(xì)胞核正常；肌膜連續(xù)(圖I)。肌膜下線粒體堆積較少，肌細(xì)胞核正常；肌原纖維結(jié)構(gòu)正常，具有排列整齊的Z線；肌原纖維間線粒體形態(tài)、排列正常(圖J)。

Fig. 1 The change chart of micro rat skeletal muscle after eccentric exercise(×10K) A: Exercise immediate group; B,C: 24-hour group after exercise; D,E: 48-hour group after exercise

Fig. 2 The change chart of micro rat skeletal muscle after prior heat treated and eccentric exercise(×10K) F: Preheated treatment and exercise immediate group; G,H: Preheated treatment exercise group after 24 hours; I,J: Preheated treatment exercise group after 48 hours

2.2 實(shí)驗(yàn)后大鼠血清CK、LDH、SOD活性、MDA濃度的變化

預(yù)熱處理運(yùn)動(dòng)后HE1及HE2組的CK值都分別低于同時(shí)相的E1、E2組，并且兩兩之間呈顯著性差異(P<0.05)；HE1、HE2及HE3組的值分別顯著低于同時(shí)相的E1、E2及 E3組(P<0.05)；HE4值高于E4，但兩者之間無(wú)顯著性差異(表1)。

熱處理后運(yùn)動(dòng)即刻大多數(shù)肌原纖維正常，具有排列整齊的Z線，肌原纖維間線粒體形態(tài)、肌膜連續(xù)，肌膜下偶見(jiàn)線粒體堆積，數(shù)量形預(yù)熱處理運(yùn)動(dòng)后不同時(shí)相血清SOD活性的變化，HE2及HE3組的值均明顯高于同時(shí)相的E2、E3組(P<0.05)，HE1及HE4組的值也分別高于同時(shí)相的E1、E4組，但沒(méi)有顯著性異性(表1)。

Tab. 1 The change of CK，LDH, SOD activity and MDA concentration comparison in different groups of rats between the exercise group and preheated exercise treatment group

C: Control group; E1: Exercise immediate group; E2: 24-hour group after exercise; E3: 48-hour group after exercise; E4: 6 d group after exercise; HE: Preheated treatment group; HE1: Preheated treatment and exercise immediate group; HE2: Preheated treatment and exercise group after 24 hours; HE3: Preheated treatment and exercise group after 48 hours; HE4: Preheated treatment exercise group after 6 d; CK: Creatine kinase; LDH: Lactic dehydrogenase; SOD: Superoxide dismutase; MDA: Malondialdehyde

*P<0.05vsE1 group；?##P<0.01vsE2 group；?△P<0.05vsE3 group

3 討論

機(jī)體在熱應(yīng)激下會(huì)產(chǎn)生內(nèi)源性保護(hù)蛋白抵抗機(jī)體抗損傷能力。結(jié)果顯示，預(yù)熱處理運(yùn)動(dòng)組與單純運(yùn)動(dòng)組比較，預(yù)熱處理運(yùn)動(dòng)后24 h后肌原纖維正常，肌膜下肌原纖維具有排列整齊的Z線，僅部分肌質(zhì)網(wǎng)輕度擴(kuò)張。但是在熱適應(yīng)運(yùn)動(dòng)48 h后，肌原纖維結(jié)構(gòu)正常，具有排列整齊的Z線，肌原纖維間線粒體形態(tài)，肌細(xì)胞核正常。預(yù)熱處理對(duì)運(yùn)動(dòng)性骨骼肌損傷具有一定的預(yù)防作用。其原因可能是機(jī)體在熱應(yīng)激下會(huì)發(fā)生熱應(yīng)激反應(yīng)并產(chǎn)生熱體克蛋白，提高細(xì)胞抗損傷能力，并可以通過(guò)預(yù)期熱刺激，使機(jī)體預(yù)先獲得抗損傷的能力，提高細(xì)胞對(duì)應(yīng)激的耐受性，從而減少細(xì)胞受損程度[3]。本實(shí)驗(yàn)熱處理骨骼肌運(yùn)動(dòng)后的生理特征也證實(shí)這一觀點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)證明，熱應(yīng)激產(chǎn)生的熱蛋白可以參與到細(xì)胞骨架和核骨架中，并且與核仁和細(xì)胞膜結(jié)合，使細(xì)胞結(jié)構(gòu)變得更加穩(wěn)定，降低核仁和細(xì)胞膜對(duì)熱的敏感性，增強(qiáng)細(xì)胞的熱耐受力[4]，因此本實(shí)驗(yàn)預(yù)熱處理離心運(yùn)動(dòng)后骨骼肌的超微結(jié)構(gòu)改變，可能與應(yīng)激蛋白穩(wěn)定骨架有關(guān)。

血液CK和LDH濃度與骨骼肌及細(xì)胞膜受損相關(guān)，血清CK、LDH活性的改變與運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度時(shí)間以及運(yùn)動(dòng)方式密切相關(guān)，本結(jié)果證實(shí)這一特征。在預(yù)熱處理后再進(jìn)行運(yùn)動(dòng)，發(fā)現(xiàn) HE1及HE2組CK 活性都分別低于E1、E2組，并呈顯著性差異(P<0.05)；而E1、HE2及HE3組LHD的活性也分別顯著低于同時(shí)相的單純運(yùn)動(dòng)組(P<0.05)。表明預(yù)熱處理可以對(duì)抗運(yùn)動(dòng)性疲勞或骨骼肌損傷對(duì)機(jī)體的影響。預(yù)熱處理對(duì)骨骼肌及細(xì)胞膜的保護(hù)作用，可能通過(guò)降低自由基，增強(qiáng)抗氧化機(jī)制來(lái)實(shí)現(xiàn)。其原理是預(yù)熱應(yīng)激提高機(jī)體抗氧化酶活性，抑制自由基對(duì)細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化，從而減輕骨骼肌組織結(jié)構(gòu)的損傷,進(jìn)而使CK和LDH釋放減少。結(jié)果顯示，預(yù)熱處理運(yùn)動(dòng)后不同時(shí)相血清SOD活性的變化，HE2及HE3組的值均明顯高于同時(shí)相的E2、E3組(P<0.05)，因此預(yù)熱處理預(yù)先可能提高骨骼肌抗氧化水平，有利于運(yùn)動(dòng)后骨骼肌自由基的消除，并在一定程度上可以防止運(yùn)動(dòng)性骨骼肌損傷。研究發(fā)現(xiàn)，預(yù)熱應(yīng)激可以使大鼠心肌抗氧化酶Mn-SOD和熱休克蛋白72表達(dá)增加，與應(yīng)激相關(guān)的HSP70在熱應(yīng)激后高表達(dá)，而HSP70具有對(duì)組織缺血-再灌注損傷的保護(hù)作用，這種作用可能是通過(guò)SOD產(chǎn)生的增加而實(shí)現(xiàn)減少自由基對(duì)機(jī)體的損傷[5]。

預(yù)熱處理能提高骨骼肌抗氧化酶SOD活性，降低劇烈運(yùn)動(dòng)過(guò)程中脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)對(duì)骨骼肌影響，對(duì)于運(yùn)動(dòng)性骨骼肌損傷或延遲性酸痛的機(jī)制預(yù)防具有較強(qiáng)的實(shí)踐指導(dǎo)意義。由于熱應(yīng)激機(jī)制的復(fù)雜性，熱處理預(yù)防干預(yù)運(yùn)動(dòng)性骨骼肌損傷應(yīng)急機(jī)制還需做進(jìn)一步研究。

[1] Butterfield TA, Herzog W. The magnitude of muscle strain does not influence serial sarcomere number adaptations following eccentric exercise [J].PtlugersArch, 2006, 451(5): 688-700.

[2] 李煥春，肖國(guó)強(qiáng). 鈣網(wǎng)蛋白介導(dǎo)熱處理對(duì)大鼠骨骼肌適應(yīng)性變化鈣調(diào)機(jī)制的研究[J]. 中國(guó)應(yīng)用生理學(xué)雜志, 2013, 29(1): 38-41.

[3] Webster KA. Serine phosphorylation and suppression of apoptosis by the small heat shock protein α B-crystallin[J].CircRes, 2003, 92(2): 130-132.

[4] Martin J, Langer T, Boteva R,etal. Chaperonin-mediated protein folding at the surface of groEL through a molten globule-like intermediate[J].Nature, 1991， 352(6330): 36-42.

[5] Bedirli A, Sakrak O, Muhtaroglu S,etal. Ergothioneine pretreatment protects the liver from ischemia-reperfusion injury caused by increasing hepatic heat shock protein 70[J].JSurgRes, 2004, 122(1): 96-102.

2016-10-11

2016-12-14

Q494

A

1000-6834(2017)02-102-03

△【通訊作者】Tel: 020-39310273; E-mail: li374@163.com