邵晨霞，靳 磊，唐少軍，劉惠知，楊 祎，吳勝蓮

（湖南省微生物研究院，湖南 長(zhǎng)沙 410009）

〈生理生化〉

7株桑黃遺傳親緣關(guān)系和栽培特性研究*

邵晨霞，靳 磊，唐少軍，劉惠知，楊 祎，吳勝蓮**

（湖南省微生物研究院，湖南 長(zhǎng)沙 410009）

對(duì)7株桑黃（Inonotus sanghuang）開(kāi)展了菌絲特性、菌絲拮抗、酯酶同工酶和栽培試驗(yàn)。結(jié)果表明，桑黃SH3和SH7菌絲無(wú)拮抗現(xiàn)象，且兩菌株間酯酶同工酶聯(lián)合系數(shù)最大，遺傳親緣關(guān)系可能相同或非常近，其余菌株間遺傳親緣關(guān)系較遠(yuǎn)；人工栽培SH3、SH6和SH7可獲得子實(shí)體。

桑黃；菌絲特性；親緣關(guān)系；栽培特性

桑黃（Inonotus sanghuang） 是目前國(guó)際公認(rèn)抗腫瘤效果好的大型藥用真菌，按照現(xiàn)代分類(lèi)系統(tǒng)該菌屬于纖孔菌屬（Inonotus）。自20紀(jì)以來(lái)，桑黃相關(guān)研究逐步成為熱點(diǎn)，其中日本、韓國(guó)和中國(guó)研究最多，對(duì)桑黃的命名[1]、藥理和產(chǎn)品開(kāi)發(fā)進(jìn)行了廣泛研究[2－3]，對(duì)桑黃的認(rèn)識(shí)進(jìn)一步提高[4]。我國(guó)目前多個(gè)省份有野生桑黃發(fā)現(xiàn)，針對(duì)桑黃子實(shí)體成分、形態(tài)比較、分子鑒定研究和遺傳結(jié)構(gòu)分析不斷深入[5－6]，桑黃形態(tài)學(xué)和分子系統(tǒng)學(xué)的研究取得了重要進(jìn)展[7－8]，但目前湖南省未見(jiàn)有野生桑黃相關(guān)的報(bào)道。桑黃的分類(lèi)和命名一直存在爭(zhēng)議，對(duì)保藏的桑黃菌株開(kāi)展遺傳親緣關(guān)系鑒定研究，是認(rèn)識(shí)和開(kāi)發(fā)桑黃的基礎(chǔ)，對(duì)桑黃產(chǎn)業(yè)發(fā)展具有重要意義。本研究對(duì)從湖南張家界桑植地區(qū)采集的2株桑黃，與本中心原保藏的5株桑黃開(kāi)展了菌絲特性、菌絲拮抗、酯酶同工酶和人工栽培特性進(jìn)行研究，旨在研究各菌株間的遺傳親緣關(guān)系和桑黃的栽培特性，為進(jìn)一步開(kāi)展桑黃的分類(lèi)鑒定和相關(guān)產(chǎn)品開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

桑黃菌株7株，依次編號(hào)SH1～SH7，保藏于湖南省微生物研究院菌種保藏中心。SH1購(gòu)自中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心，菌株編號(hào)5.95；SH2購(gòu)自華中農(nóng)業(yè)大學(xué)菌種實(shí)驗(yàn)中心；SH4、SH5、SH6購(gòu)自陜西科技大學(xué)；SH3、SH7由湖南張家界桑植地區(qū)采集的野生桑黃子實(shí)體分離獲得。

1.2 平板培養(yǎng)基配方

綜合馬鈴薯培養(yǎng)基：馬鈴薯（去皮）煮汁200 g、葡萄糖20 g、蛋白胨2 g、磷酸二氫鉀0.5 g、硫酸鎂0.1 g、維生素B110 mg、瓊脂18 g，加水至1 000 mL，pH自然。

1.3 酯酶同工酶染色液

稱(chēng)取25 mg乙酸-1-奈酯和25 mg乙酸-2-萘酯，用3 mL丙酮溶解。50 mg固藍(lán)RR鹽，再加入磷酸緩沖液（pH6.5）50 mL，過(guò)濾后與上述3 mL丙酮溶液混合，過(guò)濾后使用，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.4 原種和栽培培養(yǎng)基

培養(yǎng)基配方：木屑48%、棉籽殼30%、麩皮15%、玉米粉 5%、石膏 1.5%、MgSO40.2%、KH2PO40.3%，含水量60%。

1.5 方法

1.5.1 菌絲生長(zhǎng)特性研究

桑黃接種至直徑為9 cm的平板培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度28℃，4次重復(fù)，3 d后每4天測(cè)量1次菌絲直徑（cm），計(jì)算平均值。第15天計(jì)算菌絲平均生長(zhǎng)速度（cm·d-1）為菌絲直徑除以培養(yǎng)天數(shù)，對(duì)各菌株菌絲平均生長(zhǎng)速度進(jìn)行差異顯著性分析（顯著水平P＜0.05）。

1.5.2 菌絲拮抗試驗(yàn)

將菌種接種到平板上，每個(gè)平板接種3個(gè)菌株，培養(yǎng)7 d～10 d觀察菌種菌絲間是否有拮抗現(xiàn)象。

1.5.3 菌絲酯酶同工酶電泳試驗(yàn)

取培養(yǎng)皿培養(yǎng)的菌絲0.5 g，液氮研磨后加入1 mL磷酸緩沖液（pH 7.5），4℃，10 000 r·min-1離心10 min，取上清液，蔗糖溴酚藍(lán)溶液（1∶1）與樣品上清液2∶5混勻，即為電泳樣品。采用聚丙烯酰胺凝膠電泳，濃縮膠5%，分離膠8%，垂直電泳槽電泳試驗(yàn)，點(diǎn)樣量20 μL，4℃～10℃電泳，60 V電壓電泳1 h，100 V電壓電泳4 h結(jié)束電泳。電泳結(jié)束后放入酯酶同工酶染色液37℃染色20 min至酶帶清晰，用清水漂洗數(shù)次，置乙酸溶液（70 mL·L-1）中固定，照相。酶譜分析得出各譜帶相對(duì)遷移率（Rf），計(jì)算聯(lián)合系數(shù)（S），即兩菌株共有酶帶數(shù)與兩菌株酶帶數(shù)之和減去共有酶帶數(shù)的比值，公式為：式中：a表示A菌株酶帶數(shù)；b表示B菌株酶帶數(shù)；c表示A、B兩菌株共有酶帶數(shù)。

1.5.4 栽培試驗(yàn)

栽培和原種培養(yǎng)基裝入直徑15 mm的栽培袋，滅菌后接種。原種培養(yǎng)22 d左右，轉(zhuǎn)接至栽培種培養(yǎng)基，26℃培養(yǎng)28 d左右，菌絲長(zhǎng)滿袋。置于溫度20℃～25℃，濕度90%左右的出菇室進(jìn)行出菇。

2 結(jié)果與分析

2.1 平板培養(yǎng)桑黃菌絲生長(zhǎng)特性

7株桑黃菌絲平均生長(zhǎng)速度和菌絲長(zhǎng)勢(shì)見(jiàn)表1。

表1 7株桑黃菌絲平均生長(zhǎng)速度和菌絲長(zhǎng)勢(shì)Tab.1 Mycelium average growth rate and growth vigor of 7 Inonotus sanghuang strains

桑黃接種第3天至第9天菌絲生長(zhǎng)速度快，之后逐漸減慢，15 d后菌絲生長(zhǎng)非常慢。第15天測(cè)量菌絲直徑（表1），SH3菌絲直徑最大7.92 cm，菌絲平均生長(zhǎng)速度為0.53 cm·d-1，其次為SH7和SH6，菌絲直徑分別為7.46 cm和6.95 cm，平均生長(zhǎng)速度為0.50 cm·d-1和0.46 cm·d-1，3個(gè)菌株菌絲平均生長(zhǎng)速度不顯著；SH1和SH4菌絲直徑小，分別為3.75 cm和3.95 cm，平均生長(zhǎng)速度為0.25 cm·d-1和0.26 cm·d-1，與SH3、SH7和SH6菌株相比菌絲平均生長(zhǎng)速度差異達(dá)顯著水平。菌絲長(zhǎng)勢(shì)方面SH1和SH4一般，其余幾個(gè)菌株菌絲長(zhǎng)勢(shì)旺盛，培養(yǎng)過(guò)程中觀察SH3和SH7菌絲生長(zhǎng)最旺盛。

2.2 桑黃菌絲拮抗試驗(yàn)

7個(gè)桑黃菌株菌絲培養(yǎng)7 d～10 d觀察拮抗情況，見(jiàn)圖1。

SH3和SH7之間拮抗線不明顯，其余各菌株菌絲間拮抗線明顯。初步推斷SH3和SH7可能為同一個(gè)種或遺傳親緣關(guān)系非常近，結(jié)果還需進(jìn)一步開(kāi)展分子鑒定、栽培試驗(yàn)等來(lái)進(jìn)行驗(yàn)證。

2.3 桑黃酯酶同工酶試驗(yàn)

圖1 7個(gè)桑菌株菌絲拮抗試驗(yàn)Fig.1 Mycelial antagonistic test of 7 Inonotus sanghuang strains

7個(gè)桑菌株菌絲酯酶同工酶電泳圖譜和模式圖見(jiàn)圖2。

圖2 7個(gè)桑菌株菌絲酯酶同工酶電泳圖譜和模式圖Fig.2 Mycelial esterase isozyme electrophoresis and pattern of 7 Inonotus sanghuang strains

桑黃SH1～SH7菌株共檢出12條不同酶帶，譜帶數(shù)分別為4條、4條、6條、5條、4條、3條、5條，菌株間酶譜差異較明顯，其中Rf=0.205酶帶是7個(gè)菌株共有的。SH3和SH7酶譜差異最小，SH3比SH7在Rf為0.477處多1條酶帶，其余5條帶的位置相同，結(jié)合菌絲拮抗試驗(yàn)結(jié)果，推斷SH3和SH7遺傳親緣關(guān)系較近。7個(gè)桑黃菌株酯酶同工酶相對(duì)遷移率（Rf）見(jiàn)表2。

表2 7個(gè)桑黃菌株酯酶同工酶相對(duì)遷移率Tab.2 Mycelial esterase isozyme mobility relative front of 7 Inonotus sanghuang strains

從7個(gè)桑黃菌株酯酶同工酶相對(duì)遷移率Rf值看出，7個(gè)菌株共有酶帶Rf=0.205；除SH1外，其余6個(gè)菌株共有酶帶Rf=0.295；SH1、SH3、SH4、SH7菌株共有酶帶Rf=0.695；SH1、SH3、SH7菌株共有酶帶Rf=0.727；同工酶譜帶7個(gè)桑黃菌株間既有各種差異，又有一定數(shù)量的共有酶帶，表明7個(gè)桑黃菌株的遺傳多樣性，同時(shí)其中某些菌株間可能遺傳關(guān)系較近。7個(gè)桑黃菌株間聯(lián)合系數(shù)（S）見(jiàn)表3。

聯(lián)合系數(shù)可以更好地反映菌株間的遺傳親緣關(guān)系，值在0.1～1之間，越小說(shuō)明兩菌種間親緣關(guān)系越遠(yuǎn)，反之則越近。7個(gè)桑黃菌株SH3和SH7聯(lián)合系數(shù)最大（S=0.833），說(shuō)明兩菌株遺傳親緣關(guān)系相同或非常近。其余幾個(gè)菌株的聯(lián)合系數(shù)都未超過(guò)0.5，可認(rèn)為它們之間的遺傳親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。SH1和SH2，SH1和SH5菌株的聯(lián)合系數(shù)都為0.143，推斷他們的相似程度最低，遺傳親緣關(guān)系可能最遠(yuǎn)。

2.4 桑黃人工栽培特性

桑黃人工栽培出菇特性見(jiàn)圖3。

圖3 桑黃人工栽培特性Fig.3 Artificial cultivation characteristics of Inonotus sanghuang strains

采用常規(guī)的栽培方式，7株桑黃中SH3、SH6和SH7這三株出菇，其余幾個(gè)菌株菌絲生長(zhǎng)良好，但未長(zhǎng)出子實(shí)體。3株桑黃的子實(shí)體成不規(guī)則的球蓋形，表面有微細(xì)絨毛，初期顏色為淺黃色，后期逐漸加深呈淺褐色，采收的子實(shí)體橫切面有同心環(huán)紋路。

3 討論

通過(guò)對(duì)7個(gè)來(lái)源不同的桑黃菌株進(jìn)行菌絲特性研究、拮抗試驗(yàn)、酯酶同工酶分析，表明湖南張家界桑植地區(qū)采集的野生桑黃SH3和SH7在綜合馬鈴薯培養(yǎng)基生長(zhǎng)較快；拮抗試驗(yàn)結(jié)果表明，SH3和SH7菌株之間拮抗現(xiàn)象不明顯，酯酶同工酶聯(lián)合系數(shù)最大，說(shuō)明兩菌株之間的遺傳差異性較小，很可能是同一個(gè)種，酯酶同工酶結(jié)果與菌絲特性和拮抗試驗(yàn)結(jié)果基本一致。同工酶作為基因表達(dá)的產(chǎn)物，它能反映出個(gè)體間在DNA水平上的某些差異，是1種比較科學(xué)的種性鑒定方法[9]。目前國(guó)內(nèi)桑黃人工栽培技術(shù)還不成熟，本研究中7株桑黃栽培有3株可長(zhǎng)出子實(shí)體，其余菌株可能本身不能出菇，或菌株已退化，也可能采用其它栽培方式能出菇，這還有待于開(kāi)展不同栽培試驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。

藥用真菌作為中藥寶庫(kù)中的重要組成部分，日益受到人們的關(guān)注并已成為研究的熱點(diǎn)。近年來(lái)桑黃鑒定主要依賴于子實(shí)體的形態(tài)特征，易受生長(zhǎng)環(huán)境等因素影響，這造成了目前桑黃研究及應(yīng)用中的混淆。分子生物學(xué)技術(shù)已被應(yīng)用于真菌鑒定[10]，有較多關(guān)于利用ITS對(duì)大型真菌進(jìn)行分子系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系的研究報(bào)道，目前在食（藥）用菌分類(lèi)鑒定、種質(zhì)資源評(píng)估、遺傳多樣性和親緣關(guān)系分析上也有廣泛應(yīng)用[11-12]，應(yīng)用rDNA ITS序列分析技術(shù)能夠較準(zhǔn)確區(qū)分桑黃真菌，有效鑒定桑黃[13]。因此下一步研究工作是廣泛引進(jìn)國(guó)內(nèi)外已有桑黃菌株，采用分子生物學(xué)技術(shù)手段對(duì)桑黃菌株進(jìn)行系統(tǒng)分類(lèi)和鑒定，掌握桑黃資源的遺傳特性基礎(chǔ)信息，為更好地開(kāi)發(fā)利用這一珍稀藥用真菌奠定基礎(chǔ)。

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Study on Genetic Relationships and Cultivate Characteristic of 7 Inonotus sanghuang Strains

SHAO Chen-xia,JIN Lei,TANG Shao-jun,LIU Hui-zhi,YANG Yi,WU Sheng-lian
(Hunan Province Microbiology Institute,Changsha 410009,China)

In this study,mycelial characteristics,antagonistic test,esterase isozyme and cultivation experiment of 7 Inonotus sanghuang strains were tested.Results showed that the mycelium of 7 I.sanghuang strains exsit obvious antagonism line to each other except SH3 to SH7,and esterase isozyme of SH3 and SH7 showed the largest similarity,which indicated that the genetic relationship of SH3 and SH7 may be the same or very close,and the rest strains were with great difference.SH3,SH6 and SH7 generated fruiting body by artificial cultivation.

Inonotus sanghuang strains;mycelium characteristics;genetic relationships;cultivation characteristic

S646.9

A

1003-8310（2017）03-0040-04

10.13629/j.cnki.53－1054.2017.03.010

湖南省財(cái)政預(yù)算項(xiàng)目（2015[湘財(cái)預(yù)]0001號(hào)）。

邵晨霞（1980－），女，碩士，助理研究員，主要從事食用菌栽培和產(chǎn)品開(kāi)發(fā)研究工作。E－mail:52073200＠qq.com

**通信作者：吳勝蓮（1977－），女，本科，高級(jí)農(nóng)藝師，主要從事食用菌菌種選育、栽培技術(shù)研究。E－mail:648289145＠qq.com

2017－03－15