丁汀 蘭海平 柯強 毛詠旻 婁國強 施軍平*

茜草素聯(lián)合標(biāo)準(zhǔn)抗結(jié)核化療方案對耐多藥肺結(jié)核患者免疫功能的影響

丁汀 蘭海平 柯強 毛詠旻 婁國強 施軍平*

目的探討茜草素聯(lián)合標(biāo)準(zhǔn)抗結(jié)核化療方案對耐多藥肺結(jié)核患者免疫功能的影響。方法將200例耐多藥肺結(jié)核患者隨機分為單純抗結(jié)核化療組（對照組）和茜草素聯(lián)合抗結(jié)核化療組（觀察組），每組各100例。對照組采用中國全球基金耐多藥結(jié)核病項目標(biāo)準(zhǔn)方案治療，觀察組在對照組基礎(chǔ)上聯(lián)合茜草素治療。另將醫(yī)院健康體檢人員30例設(shè)為正常組。分析二組患者治療前和治療8個月后免疫功能變化。結(jié)果與正常組比較，治療前兩組IgA、IgE含量和CD19+表達升高（P<0.05），補體C3、C4含量和CD3+、CD4+、CD8+表達降低（P<0.05）。治療后觀察組IgA、IgE含量下降，C3和C4水平增高（P>0.05）；CD3+、CD4+、CD8+表達增高，CD19+表達下降（P>0.05）；對照組IgA、IgE含量仍增高，C3和C4水平仍降低（P<0.05）；CD3+、CD4+和CD8+表達仍降低，CD19+表達仍增高（P<0.05）。結(jié)論茜草素聯(lián)合標(biāo)準(zhǔn)抗結(jié)核化療方案可改善患者免疫功能，具臨床應(yīng)用價值。

結(jié)核，肺 耐藥 茜草素 免疫

我國結(jié)核病疫情嚴(yán)重，>1/3 初復(fù)治肺結(jié)核患者均表現(xiàn)為耐藥肺結(jié)核（multidrug-resistant pulmonary tuberculosis，MDR-PTB），MDR-PTB病程遷延、費用昂貴、病死率高，嚴(yán)重影響患者身心健康，對其防治不僅是醫(yī)學(xué)問題，已上升為社會問題［1］。文獻表明，肺結(jié)核患者多伴免疫功能紊亂［2］，中藥茜草素具有抑制結(jié)核胞內(nèi)菌感染、調(diào)節(jié)免疫功能等廣泛藥理作用［3］。本研究通過觀察茜草素聯(lián)合標(biāo)準(zhǔn)抗結(jié)核化療方案對MDR-PTB患者免疫功能的影響，進一步闡明茜草素抗結(jié)核菌的作用。

1 臨床資料

1.1 一般資料 收集2013年6月至2015年6月本院結(jié)核科納入第七輪全球基金耐多藥結(jié)核病項目［4］MDR-PTB患者200例，按隨機數(shù)字表，采用盲法隨機分為單純抗結(jié)核化療組（對照組）、茜草素聯(lián)合抗結(jié)核化療組（觀察組），每組各100例。其中觀察組100例，男47例，女53例；年齡21~82歲，平均年齡（53±12）歲。對照組男54例，女46例；年齡26~80歲，平均年齡（52±10）歲。入選標(biāo)準(zhǔn)：（1）痰菌培養(yǎng)陽性，經(jīng)菌種鑒定為結(jié)核分枝桿菌，藥敏試驗結(jié)果證實至少同時對異煙肼（H）和利福平（R）耐藥；（2）無精神病、癲癇等精神疾病家族史；（3）無肝腎、免疫和血液系統(tǒng)功能異常；（4）本研究方案經(jīng)醫(yī)院倫理委員會通過，患者及家屬簽署知情同意書。另將醫(yī)院健康體檢人員30例設(shè)為正常組，其中男11例，女9例；年齡18~60歲，平均年齡（39±16）歲。臨床和實驗室檢查排除哮喘、肺炎和肺癌等呼吸系統(tǒng)疾病和明顯感染癥狀。

1.2 治療方法 對照組采用中國全球基金耐多藥結(jié)核病項目標(biāo)準(zhǔn)方案進行治療［4］，6 Z Km（Am，Cm） Lfx（Mfx）Cs（PAS，E） Pto/18 Z Lfx（Mfx） Cs（PAS，E） Pto ［Z：吡嗪酰胺；Km：卡那霉素；Am：阿米卡星；Cm：卷曲霉素；Lfx：左氧氟沙星；Mfx：莫西沙星；Cs：環(huán)絲氨酸；PAS：對氨基水楊酸；E：乙胺丁醇；Pto：丙硫異煙胺］。觀察組在對照組治療的基礎(chǔ)上，加用茜草素顆粒劑1g/次，2次/d。兩組患者均治療8個月，并禁止服用與本試驗藥物有同類作用藥物。

1.3 觀察指標(biāo) 兩組患者治療前后分別采集靜脈血，全自動特定蛋白儀檢測免疫球蛋白IgA、IgE、IgM、IgG及補體C3、C4。流式細胞技術(shù)檢測淋巴細胞亞群CD3+、CD4+、CD8+、CD19+和NK細胞活性表達。試劑和Immage全自動特定蛋白儀、Navios和FACSCanto- II流式細胞儀分別由美國BeckniEin公司、Beckman coulter公司、BD公司和Millipore公司提供。1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件。計量資料采用（±s）表示，組間比較采用t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 治療前后體液免疫變化 與正常組比較，治療前觀察組和對照組IgA、IgE含量均增高，血清補體C3、C4含量均降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）；觀察組和對照組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。治療后，觀察組IgA、IgE含量均降低，血清補體C3、C4含量均增高，和正常組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）；對照組IgA、IgE含量仍增高，血清補體C3、C4含量仍降低，和正常組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表1、2。

表1 兩組患者治療前體液免疫指標(biāo)變化［g/L，（x±s）］

表2 兩組患者治療后體液免疫指標(biāo)變化［g/L，（x±s）］

2.2 治療前后細胞免疫T淋巴細胞亞群表達變化 與正常組比較，治療前觀察組和對照組CD3+、CD4+和CD8+表達降低，CD19+表達增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）；觀察組和對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。治療后與正常組比較，觀察組CD3+、CD4+和CD8+表達增高，CD19+表達下降，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）；對照組CD3+、CD4+和CD8+表達仍偏低，CD19+表達仍增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表3、4。

表3 兩組患者治療前細胞免疫陽性表達率［%，（x±s）］

表4 兩組患者治療后細胞免疫陽性表達率［%，（x±s）］

3 討論

肺結(jié)核是我國最常見慢性呼吸道傳染病之一，通常見于機體免疫功能低下，結(jié)核桿菌侵襲肺部組織，致使呼吸功能異常所致。雖然目前有關(guān)免疫機制尚不清楚，但大量研究表明，肺結(jié)核患者多合并免疫功能紊亂，表現(xiàn)為體液免疫亢進和細胞免疫減損［2］。

本研究耐藥患者IgA、IgE含量增高，可能機制是耐藥菌感染刺激肺部分泌特異性高水平IgA和IgE，IgA發(fā)揮重要呼吸道黏膜防御作用和免疫“屏障”［5］，IgE結(jié)合肥大細胞和嗜酸性粒細胞上的受體，釋放TNF-γ等化學(xué)介質(zhì)，促進B細胞分化并提高其活性，發(fā)生速發(fā)型和遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)，增加氣道阻力及高反應(yīng)性，加重結(jié)核病情［2，5］。耐藥患者補體C3和C4含量均下降，可能是耐藥菌通過更為強烈而復(fù)雜的免疫反應(yīng)，活化C3和C4促炎癥反應(yīng)［5］。本研究耐藥患者IgM和IgG含量與正常人群無差異，可能是IgM抗體主要在感染初期產(chǎn)生，與臨床診治因素相關(guān)性不強，活動期水平低，同時敏感性和特異性均較低有關(guān)［2，5-6］。IgG具促炎癥或抗炎癥反應(yīng)的雙向調(diào)節(jié)功能，發(fā)揮與細菌高負荷相關(guān)聯(lián)的抗感染及調(diào)理作用［5］。

本研究耐藥患者T細胞CD3+、CD4+、CD8+活性表達下降，可能機制是：（1）耐藥結(jié)核菌進一步促使機體內(nèi)的CD3+T 細胞凋亡消耗［6］；（2）耐藥患者感染時強烈抑制CD4+T淋巴細胞亞群Th l7分泌白細胞介素17，繼而引起機體CD4+Th 細胞下降［6］。（3）CD4+T淋巴細胞內(nèi)亞群CD4+CD25+CD127-Treg T淋巴細胞、叉頭-翼狀螺旋轉(zhuǎn)錄因子 Foxp 3增多，通過抑制細胞免疫反應(yīng)，形成保護性抑制，減輕過強免疫反應(yīng)對機體的損害［6］。Treg細胞通過分泌抑制性的細胞因子、細胞接觸和誘導(dǎo)凋亡等方式間接抑制CD4+、CD8+T細胞過強的特異性免疫反應(yīng)［6］。雖然本研究耐藥患者NK細胞水平與健康人群無明顯差別，可能與實驗樣本數(shù)不夠大以及NK細胞正負雙相調(diào)節(jié)機制有關(guān)［2，6］。本課題發(fā)現(xiàn)耐藥患者外周血CD19+細胞表達水平增高，可能與CD19+細胞重要亞群CD19+CD5+CDld+B細胞功能有關(guān)［2，6］：一是抗體分泌及調(diào)節(jié)IL-10作用；二是抗原遞呈功能。CD19+CD5+CD ld+B細胞Breg亞群具有不依賴抗體分泌的免疫負向調(diào)節(jié)功能，繼而引起CD19+細胞表達水平增高［2，6］。

茜草始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，據(jù)《本草綱目》記載，茜草科植物，味苦性寒，入肝心經(jīng)。具有涼血止血、行血祛瘀、止咳祛痰、通經(jīng)之功效。用于吐血、崩漏、外傷出血、瘀阻腫痛等治療，近年來對茜草的抗炎、增強免疫、護肝和抗癌等藥效學(xué)方面開展了研究。茜草素是從茜草根部提煉的羥基蒽醌衍生物，具有抑制結(jié)核胞內(nèi)菌等多種病原體感染、護肝、止血活血、化瘀通經(jīng)、免疫調(diào)節(jié)功能等廣泛藥理作用［3，7-8］。肺結(jié)核為慢性呼吸道傳染病，屬于中醫(yī)學(xué)“肺癆”，乃多種因素致正氣內(nèi)虛，癆蟲侵襲所致消耗性疫?。?］。雖肺癆病位始于肺，但肺氣陰兩虛、熱毒郁肺，久之由肺傳及脾、腎、心、肝，以至五臟互為傳變，終致氣滯血瘀、氣血不足。辨證基礎(chǔ)上選用茜草素苦寒之性“抑菌排毒”，入肝心二經(jīng)“活血化瘀”“通經(jīng)”［3，7-10］。茜草素聯(lián)合治療提高療效的可能機制是：（1）結(jié)核菌感染致患者體內(nèi)血清溶血素水平升高，茜草素通過降低血清溶血素含量抑制結(jié)核桿菌毒性作用［3，7-8，10］；（2）耐藥基因可導(dǎo)致結(jié)核菌氨基酸代謝表達紊亂，使抗結(jié)核化療藥物失去作用靶點或結(jié)合部位，發(fā)生細菌對化療藥物的逃逸或耐受現(xiàn)象，而茜草素含有8 個環(huán)肽類成分A~H，內(nèi)含的氨基丁酸、亮氨酸、蘇氨酸等成分，多表達為功能基因，較大程度上改善了耐藥結(jié)核菌表達的氨基酸代謝紊亂，同時提高了機體免疫力［10］；（3）抗結(jié)核化療藥物和耐藥基因均可誘導(dǎo)機體肝細胞DNA氧化損傷，產(chǎn)生大量氧自由基。茜草素含有的二聚環(huán)肽類化合物RA-dimer A能夠降低誘導(dǎo)劑對DNA 的氧化性損傷，清除自由基，對抑制基因毒性有著重要的調(diào)節(jié)作用。本研究采用茜草素聯(lián)合標(biāo)準(zhǔn)抗結(jié)核化療治療方案證實，茜草素可能通過改善患者免疫功能有效控制病情，具有重要研究價值。

［1］ Zhao Y,Xu S,Wang L,et al.National survey of drug-resistant tuberculosis in China .NEJM,2012,366(23):2161-2170.

［2］ Achkar JM,Casadevall A.Antibody-mediated immunity against tuberculosis:implications for vaccine development.Cell Host Microbe, 2013,13(3):250-262.

［3］ 蔡智群,蔡杏珊,鄧紅.茜草素抗結(jié)核分枝桿菌作用的實驗研究.廣州醫(yī)科大學(xué)學(xué)報,2015,43(5):71-73.

［4］ 中華醫(yī)學(xué)會結(jié)核病學(xué)分會.結(jié)核診斷和治療指南.中華結(jié)核和呼吸雜志,2013,20(2):70-74.

［5］ Feng Xiao yan,Yang Xiqin,Xiu Bing shui,et al.IgG,IgM and IgA antibodies against the novel polyprotein in active tuberculosis.BMC Infect Dis,2014,14:336.

［6］ 張影,陸堅,侯志平,等.肺結(jié)核患者療程中外周血輔助性和調(diào)節(jié)性T 細胞的動態(tài)研究.中國防癆雜志,2013,35(6):427-432.

［7］ Fan JT,Chen YS,Xu WY,et al.Rubi yunnanins A and B,two novel cyclic hexapeptides from Rubia yunnanensis. Tetrahedron Letters, 2010,51(52):6810-6813.

［8］ Fan JT,Su J,Peng YM,et al.Rubiyunnanins C-H,cytotoxic cyclic hexapeptides from Rubia yunnanensis inhibiting nitric oxide production and NF-B activation.Bioorganic & medicinal chemis try,2010,18(23):8226-8234.

［9］ 王懷沖,徐穎穎,張相彩,等.中藥與免疫調(diào)節(jié)劑輔助治療復(fù)治肺結(jié)核的療效及經(jīng)濟學(xué)評價.中國全科醫(yī)學(xué),2014,17(6):706-709.

［10］ Jeong GS, Lee DS, Kim DC, et al. Neuroprotective and antiinfIammatory effects of mollugin via upregulation of heme oxygenase-1 in mouse hippocampal and microglial cells.Eur J Pharmacol, 2011,654(3):226.

ObjectiveTo investigate the effects of alizarin combined with standard anti-tuberculosis chemical therapy on the immune function of patients with multidrug-resistant pulmonary tuberculosis.Methods200 cases of multidrug-resistant pulmonary tuberculosis patients were randomly divided into control group（n=100） and observation group（n=100）. The control group was given standard anti-tuberculosis chemical therapy，while the observation group was given alizarin based on standard anti-tuberculosis chemical therapy. The other 30 patients were set as normal group. The changes of immune function were analyzed before and after 8 months of treatment in the two groups.ResultsBefore treatment，compared with the ordinary people，the levels of IgA、IgE and CD19+of patients in the two groups increased signifi cantly （P<0.05） and the levels of C3、C4、CD3+、CD4+and CD8+decreased（P<0.05）. After treatment，compared with the control group，the levels of IgA、IgE and CD19+of patients in the observation group decreasedsignifi cantly（P<0.05），while C3、C4、CD3+、CD4+and CD8+ levels increased（P<0.05）.ConclusionAlizarin combined with standard anti-tuberculosis chemical therapy can signifi cantly improve the immune function of multidrug-resistant pulmonary tuberculosis Patients，which has promotion values.

Tuberculosis，pulmonary Drug resistance Alizarin Immune function

國家自然科學(xué)基金項目（81070316）；浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生項目（2013KYB212）；杭州市衛(wèi)生科技計劃項目（2013A20）

310053 浙江中醫(yī)藥大學(xué)［丁?。ㄔ诼氀芯可?10015 杭州師范大學(xué)附屬醫(yī)院（丁汀 蘭海平 柯強

毛詠旻 婁國強 施軍平）

*通信作者