鄭國淀 陳佳輝 滕飛 鄭國威 呂航 程向東*

跨膜受體-整合素β5亞基在胃腺癌中低表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系

鄭國淀 陳佳輝 滕飛 鄭國威 呂航 程向東*

目的檢測整合素β5（ITGB5）在胃癌中的表達(dá)情況，探討其與胃癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系，以尋找胃癌新的診斷和治療靶點。方法采用組織芯片技術(shù)構(gòu)建包含101例胃癌組織和72例配對的癌旁組織共173點陣石蠟組織芯片，用免疫組化法檢測該芯片中整合素β5的表達(dá)，分析其與胃癌臨床病理及預(yù)后的關(guān)系。結(jié)果整合素β5在胃癌組織和癌旁組織高表達(dá)率分別為50.5%（51/101）和 94.4%（68/72），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=37.82，P<0.001），低表達(dá)的整合素β5與腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床分期有關(guān)（P<0.05），單因素分析顯示低表達(dá)組的生存率比高表達(dá)組低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.003），并且COX風(fēng)險模型中提示整合素β5是胃癌預(yù)后的獨立危險因素（P=0.026）。結(jié)論整合素β5的低表達(dá)與胃癌發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)系，可能是新的治療靶點或預(yù)后評估指標(biāo)。

胃癌 整合素β5 組織芯片 免疫組織化學(xué)

胃癌是病死率最高的惡性腫瘤之一［1］。盡管手術(shù)仍然是胃癌最主要的治療方式，但是由于大部分胃癌發(fā)現(xiàn)時都已經(jīng)處于進(jìn)展期，因此多得不到令人滿意的預(yù)后［2］。目前分子靶向藥物對胃癌的治療效果有限。因此，亟待尋找新的診斷及預(yù)后的腫瘤標(biāo)志物和治療靶點。整合素β5是一種重要的細(xì)胞粘附分子，其表達(dá)能力減弱使細(xì)胞間粘附能力降低，有利于癌細(xì)胞從原發(fā)部位脫落、轉(zhuǎn)移，可能是促使腫瘤轉(zhuǎn)移的原因之一［3］。已有研究顯示整合素β5參與一些腫瘤的耐藥、血管生成、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換等作用［4-6］，但其在胃癌中的研究仍然較少，因此本研究通過組織芯片（highdensity tissue microarrays，TMAs）以及免疫組化技術(shù)（immunohistochemistry，IHC）檢測了整合素β5在胃癌組織和癌旁組織中的表達(dá)情況，分析其與胃癌臨床病理因素及預(yù)后的關(guān)系，為今后的腫瘤治療和預(yù)后評估提供借鑒意義。

1 臨床資料

1.1 一般資料 浙江省腫瘤醫(yī)院2008年8月至2011年3月的胃癌術(shù)后患者101例，均為腺癌，其中胃癌組織101例，癌旁組織72例，均經(jīng)過病理確診，胃癌患者未患有其它腫瘤，均為Ⅱ期和Ⅲ期患者，并且未經(jīng)過放化療等干預(yù)治療。所有病例臨床資料完整，包括年齡、性別、腫瘤大小、分化程度、靜脈侵犯及TNM分期等。其中男75例，女26例；年齡31~80歲，平均年齡（61±10）歲；按分化程度不同分為高分化組11例、中分化組41例和低分化組49例；TNM分期：Ⅱ期25例，Ⅲ期76例。所有對象通過電話隨訪生存情況，隨訪終止日期2016年4月30日。

1.2 TMA芯片組制作 構(gòu)建10×14點陣的組織芯片，包含101例胃癌組織和72例配對的癌旁組織共173點陣，對所制成芯片的所有組織（須有與其匹配的標(biāo)記完成的HE片）進(jìn)行點陣。根據(jù)標(biāo)記，利用點陣儀對標(biāo)記完成的組織進(jìn)行打點取樣，粘附于涂有多聚賴氨酸的載玻片上。每例胃癌標(biāo)本和癌旁組織標(biāo)本均取1個點。烤片6h，芯片制作完成。

1.3 免疫組織化學(xué)染色SP法染色 選用抗體：Integrin β5單克隆抗體（購自美國cell signaling technology公司），二抗為HRP標(biāo)記的山羊抗兔鼠（購自丹麥DAKO公司）。主要染色步驟：（1）TMA切片常規(guī)脫蠟至水。（2）組織切片置于盛滿檸檬酸抗原修復(fù)緩沖液（PH6.0）的修復(fù)盒中于微波爐內(nèi)進(jìn)行抗原修復(fù)。（3）3% H2O2阻斷內(nèi)源性過氧化物酶。（4）3%BSA室溫封閉30min。（5）一抗4℃孵育過夜。（6）二抗室溫孵育50min。（7）DAB顯色。（8）復(fù)染細(xì)胞核。（9）脫水封片。

1.4 結(jié)果判定 整合素β5染色主要是細(xì)胞膜出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性染色，細(xì)胞漿及細(xì)胞核表達(dá)較少，根據(jù)陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)占腫瘤實質(zhì)細(xì)胞的百分比區(qū)分表達(dá)等級：低表達(dá)（低）為陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)<25%，高表達(dá)（高）為陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)≥25%。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 17.0軟件和prism 6.0進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析和作圖，整合素β5在胃癌組織與癌旁組織中高表達(dá)率的比較及整合素β5與病理資料的相關(guān)性用連續(xù)矯正χ2檢驗（或者Fisher概率法），運用Kaplan-Meier和log rank方法進(jìn)行單因素生存分析并繪制生存曲線，Cox回歸分析法進(jìn)行多因素生存分析。P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 整合素β5在胃癌組織和癌旁組織中的表達(dá)情況 整合素β5蛋白主要表達(dá)于細(xì)胞胞膜，在胃癌及癌旁組織均有不同程度的表達(dá)（如圖1A-D），顯色為棕黃色顆粒，其高表達(dá)率分別為50.5%（51/101）和94.4%（68/72 ），因此整合素β5在癌旁組織中的表達(dá)高于胃癌組織，兩者差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.001），見表1。101例胃癌組織和72例（缺失2例）癌旁組織芯片染色所有結(jié)果見圖1E。

表1 胃癌組織、癌旁組織中整合素β5的表達(dá)

2.2 整合素β5表達(dá)與胃癌臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系 101例胃癌組織整合素β5的表達(dá)與腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床分期有關(guān)（P<0.05），而與性別、年齡、脈管侵犯、腫瘤大小、浸潤深度均無相關(guān)性（P>0.05），見表2。

圖1 A：整合素β5在胃癌組織中的表達(dá)（×100）；B：整合素β5在癌旁組織中的表達(dá)（×100）；C：整合素β5在胃癌組織中的表達(dá)（×400）；D：整合素β5在癌旁組織中的表達(dá)（×400）；E：（左）101例胃癌組織和72例癌旁組織的染色結(jié)果，（右）陣列排列示意圖，藍(lán)色為胃癌組織，黃色為癌旁組織

表2 整合素β5表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系（n）

2.3 胃癌組織整合素β5的表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系 胃癌組織中整合素β5高表達(dá)患者的5年生存率高于低表達(dá)患者，分別為64.7%（33/51）和36.0%（18/50），兩者間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.004）。影響胃癌總生存時間的單因素分析顯示整合素β5蛋白低表達(dá)與患者術(shù)后預(yù)后較差顯著相關(guān)（P=0.003）；另外術(shù)前臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤深度、分化程度與胃癌患者總生存期相關(guān)，性別、年齡、腫瘤大小、脈管侵犯、浸潤深度與總生存期無關(guān)。將單因素分析有意義的變量淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤深度、分化程度、整合素β5進(jìn)行COX風(fēng)險模型分析顯示淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤深度、整合素β5表達(dá)為胃癌預(yù)后的獨立危險因素（P<0.05），見表3。

表3 胃癌預(yù)后因子的單因素與多因素分析

3 討論

整合素是細(xì)胞表面重要的粘附分子，其由α和β兩個糖蛋白亞單位構(gòu)成的跨膜蛋白，是許多細(xì)胞外基質(zhì)成分的受體，參與和調(diào)節(jié)腫瘤的增殖、浸潤、遷移和轉(zhuǎn)移等［7］。在腫瘤細(xì)胞中，整合素可出現(xiàn)異常升高和降低，或者出現(xiàn)新的整合素表達(dá)［8］。同時整合素對腫瘤細(xì)胞的作用復(fù)雜多樣，其在不同腫瘤中的表達(dá)和作用不同，比如，卵巢癌中高表達(dá)的整合素α5β1促進(jìn)其轉(zhuǎn)移、侵襲及影響預(yù)后［9］，而其在肝癌中高表達(dá)后可抑制肝癌細(xì)胞的生長和侵襲［10］。整合素β5是整合素家族中重要的亞單位，能與不同的α亞單位結(jié)合，與一些腫瘤的發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)系，尤其與腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)系更加密切。有文獻(xiàn)報道高表達(dá)的整合素β5可促進(jìn)腫瘤增殖、轉(zhuǎn)移和血管生成等［11-12］。

作者發(fā)現(xiàn)整合素β5在胃癌組織中的高表達(dá)率低于癌旁組織，胃癌組織中低表達(dá)的整合素β5與腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床分期有關(guān)（P<0.05），而與性別、年齡、脈管侵犯、腫瘤大小、浸潤深度均無相關(guān)性（P>0.05）。單因素分析顯示整合素β5與胃癌患者生存時間相關(guān)（P=0.003），而且COX回歸分析證明整合素β5是胃癌患者預(yù)后的獨立危險因子（P=0.026）。有研究發(fā)現(xiàn)在乳腺癌中，具有高轉(zhuǎn)移力的腫瘤中整合素αvβ5的表達(dá)降低后，使腫瘤細(xì)胞與基底膜的粘附作用降低，從而使腫瘤細(xì)胞易于脫落，促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移［13］。張琦等的研究發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌細(xì)胞中腫瘤細(xì)胞整合素αvβ5的降低可能與整合素αvβ6之間的內(nèi)吞胞吐循環(huán)有關(guān)［14］。殷蓮華等［15］發(fā)現(xiàn)過表達(dá)的整合素β5可抑制造血干細(xì)胞的增殖并且與細(xì)胞凋亡有關(guān)。因此，整合素β5表達(dá)降低可能參與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展，本研究為其提供了更詳實有效的依據(jù)。

總之，本資料結(jié)果提示，胃癌組織中整合素β5表達(dá)的檢測可用作臨床診斷及預(yù)后判斷的重要指標(biāo)。深入研究整合素β5的功能及其調(diào)節(jié)機(jī)制，將能更好地對腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移做出預(yù)測，更好地指導(dǎo)臨床治療，有助于開發(fā)以胃癌腫瘤干細(xì)胞為靶點的腫瘤治療新方法。當(dāng)然，本研究的樣本量較小，樣本在各組間的分布不均，需要加大樣本量來進(jìn)一步證實結(jié)果。

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ObjectivesTo investigate the expression of integrinβ5（ITGB5）in gastric adenocarcinoma（GC） for assessing the correlation between ITGB5 and clinical pathological characteristics，and identifying therapeutic targets for diagnosis and treatment of gastric adenocarcinoma.MethodsLevels of ITGB5 were detected in 101 cases of GC tissues and 72 cases of corresponding adjacent non-neoplastic tissues by using tissue microarray and immunohistochemistry（IHC）technique. Then，the correlation between expression of ITGB5 and clinicopathological features as well as prognosis of GC patients was evaluated.ResultsThe expressions of ITGB5 in gastric adenocarcinoma tissues were signifi cantly lower than adjacent non-neoplastic tissues（overexpression rate is 50.5% and 94.4%，respectively，χ2=37.82，P<0.001）. The low expression of ITGB5 was related to low differentiation of the tissues、tumor node metastasis classifi cation and clinical stage. Cox regression analysis indicated that low expression of ITGB5 was signifi cantly related to lower survival，and both Kaplan Meier survival and Cox regression analysis showed that low ITGB5 expression（HR=1.95，95%CI 1.08 to 3.51，P=0.026）was an independent prognosis factor.ConclusionsITGB5 is closely related to the occurrence and progression of GC patients，suggesting that it may be a potential therapeutic target and prognosis index in GC.

Gastric adenocarcinoma Integrinβ5 Tissue microarray Immunohistochemistry

國家自然科學(xué)基金項目（81573953），浙江省衛(wèi)生廳

基金項目（2016KYB220，2013KYA029，2017PY009）

310053 浙江中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院（鄭國淀 陳佳輝 滕飛 鄭國威）

310006 浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院胃腸外科（呂航程向東）

*通信作者