趙勝男，龔自珍，周潔菲，吳瑾

(1.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院，上海 200092； 2.上海市兒科醫(yī)學(xué)研究所，上海 200092)

·論 著·

脫氧膽酸促進(jìn)腸道組織產(chǎn)生IL- 1β及誘導(dǎo)腸道炎癥作用的研究

趙勝男1,2，龔自珍1,2，周潔菲1,2，吳瑾1,2

(1.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院，上海 200092； 2.上海市兒科醫(yī)學(xué)研究所，上海 200092)

目的：研究高脫氧膽酸(DCA)對腸道促炎因子IL- 1β等的表達(dá)及腸道炎癥的誘導(dǎo)作用。方法：給予小鼠添加DCA的膳食，建立小鼠腸道高DCA模型，采用HE染色觀察小鼠腸道病理損傷情況；以Western Blot檢測結(jié)腸組織成熟IL- 1β的產(chǎn)生；以實時PCR檢測IL- 6、MCP- 1的表達(dá)水平；通過髓過氧化物酶(MPO)活力檢測腸道炎癥情況。結(jié)果：給予小鼠添加0.2% DCA的膳食3個月后，其結(jié)腸長度明顯縮短[對照組(8.1±0.5)cmvsDCA組(7.3±0.3)cm，P<0.01]；代表腸道炎癥程度的指標(biāo)MPO活性顯著上升[對照組(1.6±0.4)U·g-1vsDCA組(3.0±0.5)U·g-1，P<0.01]；HE染色可見結(jié)腸黏膜破損，黏膜下水腫及炎癥細(xì)胞浸潤。同時DCA膳食可明顯誘導(dǎo)結(jié)腸組織成熟IL- 1β的產(chǎn)生，并導(dǎo)致促炎因子IL- 6(對照組1.0±0.1vsDCA組174.6±45.9，P<0.01)及髓系趨化因子MCP- 1(對照組1.0±0.1vsDCA組187.8±26.2，P<0.001)的mRNA水平表達(dá)顯著升高。結(jié)論：高水平DCA可誘導(dǎo)腸道炎癥發(fā)生，激活炎癥小體、促進(jìn)成熟IL- 1β產(chǎn)生可能是其重要作用機(jī)制之一。

炎癥性腸病； 脫氧膽酸； 白細(xì)胞介素1β； 炎癥小體； 小鼠

炎癥性腸病(inflammatory bowel disease, IBD)是一種慢性非特異性腸道炎癥性疾病，根據(jù)其病理特征可分為克羅恩病(Crohn’s disease， CD)和潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis， UC)[1]。其病情遷延、難以治愈，并且IBD患者發(fā)生結(jié)直腸癌的風(fēng)險率明顯增高，嚴(yán)重危害人類健康[2]。IBD的確切發(fā)病機(jī)制未明，除了遺傳等因素之外，環(huán)境因素被認(rèn)為發(fā)揮重要作用。流行病學(xué)研究顯示高脂飲食可增加CD和UC的發(fā)病率[3]，發(fā)達(dá)國家與城市人口IBD的發(fā)病率高于發(fā)展中國家和鄉(xiāng)鎮(zhèn)人口，尤其是西方高脂飲食人群，表明膳食脂肪可能是IBD發(fā)病的重要危險因素之一。目前越來越多的證據(jù)顯示高脂飲食誘導(dǎo)的腸道膽汁酸水平升高，尤其是脫氧膽酸(deoxycholic acid, DCA)水平的增加在誘導(dǎo)IBD發(fā)病的過程中發(fā)揮重要作用[4- 6]，然而高水平DCA誘導(dǎo)腸道炎癥的機(jī)制尚不明了。

近來研究數(shù)據(jù)顯示,NLRP3炎癥小體活化及其相關(guān)促炎癥細(xì)胞因子如白細(xì)胞介素(interleukin，IL)- 1β分泌在炎癥性腸病發(fā)病過程中至關(guān)重要[7- 8]。NLRP3炎癥小體是由胞漿內(nèi)模式識別受體(pattern recognition receptors， PRRs)參與組裝的多蛋白復(fù)合體，能夠識別多種病原體相關(guān)的分子模式(pathogen- associated molecular patterns， PAMPs)或損傷相關(guān)的分子模式(damage- associated molecular patterns， DAMPs)，募集和激活促炎蛋白Caspase- 1，活化的Caspase- 1切割I(lǐng)L- 1β前體并促進(jìn)其成熟釋放，參與一系列炎癥反應(yīng)[9]。因此，具有生物活性的IL- 1β產(chǎn)生依賴于炎癥小體活化[9]。研究表明IBD患者黏膜固有層巨噬細(xì)胞分泌高水平的IL- 1β，炎癥腸黏膜組織及血清IL- 1β水平顯著升高，并且IL- 1β水平與腸道炎癥嚴(yán)重程度正相關(guān)，而阻斷IL- 1β成熟的治療手段對于抑制腸炎具有明顯效果，支持NLRP3炎癥小體活化及IL- 1β分泌在促進(jìn)腸道炎癥中發(fā)揮重要作用[10]。腸道高水平DCA導(dǎo)致的腸道炎癥是否也通過激活炎癥小體來介導(dǎo)引起我們的關(guān)注，本研究通過給予小鼠添加DCA的膳食，觀察腸道促炎因子IL- 1β等的表達(dá)及腸炎發(fā)生的情況和特征，為闡明高水平DCA誘導(dǎo)腸道炎癥的機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

6～8周雌性C57BL/6小鼠，購自上海中國科學(xué)院實驗動物中心，在無特異病原菌(SPF)、安靜、恒溫(25 ℃)、晝夜光照節(jié)律(明暗周期為12 h：12 h)下飼養(yǎng)。給予足量的飼料以及飲水，保持墊料干燥清潔。

1.2 主要試劑

DCA、組織蛋白裂解液、β- actin抗體(Sigma，美國)，總RNA提取試劑盒(Promega，美國)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa，日本)，SYBR Green熒光染料(Life，美國)，BCA蛋白定量試劑盒、ECL化學(xué)發(fā)光液(Thermo，美國)，IL- 1β抗體、HRP標(biāo)記的抗鼠IgG二抗(CST，美國)，BSA(生工，中國)，髓過氧化物酶(MPO)測定試劑盒(南京建成，中國)，4%多聚甲醛(北京鼎國昌盛，中國)。

1.3 方法

1.3.1 動物模型建立 將6～8周雌性C57BL/6小鼠隨機(jī)分為對照組(常規(guī)飼料)與DCA組(常規(guī)飼料中按0.2%的比例添加DCA，由上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司制作)，每組各6只。3個月后頸椎脫臼法處死兩組小鼠，取結(jié)腸。測量小鼠結(jié)腸長度，冰生理鹽水洗凈結(jié)腸中的糞便后分別留取部分結(jié)腸組織進(jìn)行HE染色、MPO活性檢測、實時PCR以及Western Blot。

1.3.2 MPO活性檢測 切取相同部位腸段，冰生理鹽水洗凈腸內(nèi)糞便，去除脂肪系膜組織。稱重后按照1∶9(g·ml-1)的比例加冰生理鹽水，利用組織勻漿機(jī)制備成10%組織勻漿。后續(xù)操作步驟按照試劑盒說明書進(jìn)行。酶標(biāo)儀讀取460nm處的吸光度后，按照試劑盒說明書所給的公式計算MPO活力(U·g組織濕重-1)。

1.3.3 結(jié)腸病理損傷 每組小鼠處死后取近肛門處的結(jié)腸約1cm，1ml注射器抽取冰生理鹽水緩慢沖洗出結(jié)腸內(nèi)糞便，4%多聚甲醛溶液固定。脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、HE染色，普通光學(xué)顯微鏡下觀察結(jié)腸組織學(xué)改變并拍照。

1.3.4 實時PCR切取相同部位結(jié)腸，冰生理鹽水洗凈結(jié)腸內(nèi)糞便，去除腸外系膜及脂肪組織。按照試劑盒說明提取組織總RNA，定量后取3μgRNA逆轉(zhuǎn)錄制備cDNA。引物由英駿公司(Invitrogen，美國)合成，引物序列：IL- 6上游引物5′-TAGTCCTTCCTACCCCAATTTC- 3′，下游引物5′-TTGGTCCTTAGCCACTCC-TTC- 3′；MCP- 1上游引物5′-TTAAAAACCTGGATCGGAACCAA- 3′，下游引物5′-GCATTAGCTTCAGATTTACGGGT- 3′；β-actin上游引物5′-CCCATCTATGA-GGGTTACGC- 3′，下游引物5′-TTTAATGTCACGCACGATTTC- 3′。反應(yīng)條件為95 ℃ 3min、95 ℃ 15s、58 ℃ 15s、72 ℃ 1min、60 ℃ 30s，40個循環(huán)。

1.3.5WesternBlot切取相同部位結(jié)腸，冰生理鹽水洗凈結(jié)腸內(nèi)糞便，去除腸外脂肪系膜組織，300μl組織蛋白裂解液制備成組織勻漿。1 200r·min-1離心10min后取上清進(jìn)行BCA蛋白定量。取70μg總蛋白通過12%SDS-PAGE電泳分離。90V恒壓轉(zhuǎn)PVDF膜1h，3%BSA室溫封閉2～3h，一抗4 ℃搖床過夜。PBST洗膜15min，3次，二抗室溫孵育1h，PBST洗膜15min，3次，ECL顯色拍照。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 腸道高DCA使小鼠結(jié)腸縮短

對照組和DCA組小鼠3個月后頸椎脫臼法處死，取結(jié)腸比較結(jié)腸長度改變。結(jié)果顯示(圖1)：DCA組小鼠結(jié)腸長度[(7.3±0.3)cm]與正常對照組[(8.1±0.5)cm]相比，結(jié)腸明顯變短(P<0.01)。

2.2 腸道高DCA導(dǎo)致MPO活性升高

造模結(jié)束后，頸椎脫臼處死小鼠取結(jié)腸制備成10%組織勻漿。按照試劑盒說明測量并計算MPO活力，比較兩組小鼠結(jié)腸炎癥程度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)(圖2)：與對照組小鼠結(jié)腸MPO活力[(1.6±0.4)U·g-1]相比，DCA組[(3.0±0.5)U·g-1]顯著增高 (P<0.01)。

a與對照組相比，P<0.01

圖1 DCA對小鼠結(jié)腸長度的影響

Fig 1 Effects of DCA on the colon length in mice

a與對照組相比，P<0.01

圖2 DCA對小鼠結(jié)腸MPO活性的影響

Fig 2 Effects of DCA on the colonic MPO activity in mice

2.3 腸道高DCA損傷小鼠結(jié)腸黏膜

分別對兩組小鼠結(jié)腸進(jìn)行HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照。對照組結(jié)腸黏膜結(jié)構(gòu)清晰，腸腺排列整齊、規(guī)則，結(jié)腸黏膜上皮完整，無明顯的炎癥細(xì)胞浸潤(圖3A)。給予小鼠添加0.2% DCA的膳食3個月后可見腸黏膜絨毛損傷，腸上皮完整性破壞，黏膜下水腫以及炎癥細(xì)胞浸潤(圖3B)。

2.4 腸道高DCA誘導(dǎo)IL- 1β表達(dá)

兩組小鼠結(jié)腸組織勻漿后，通過Western Blot法檢測兩組小鼠結(jié)腸組織中IL- 1β成熟片段的表達(dá)情況。結(jié)果顯示：與對照組相比，DCA組小鼠結(jié)腸成熟的IL- 1β蛋白表達(dá)明顯增多(圖4A)。使用Image Lab軟件對Western Blot結(jié)果灰度掃描后做統(tǒng)計分析(圖4B)，兩組小鼠結(jié)腸IL- 1β表達(dá)量的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(對照組1.1±0.3vsDCA組3.2±0.5,P<0.001)。

圖3 DCA對小鼠結(jié)腸組織病理學(xué)影響 HE染色×200

Fig 3 Effects of DCA on histopathologic features of the colon in mice HE staining×200

a與對照組相比，P<0.001

圖4 DCA對小鼠結(jié)腸組織成熟IL- 1β蛋白表達(dá)的影響

Fig 4 Effects of DCA on the mature IL- 1β expression of colon tissue in mice

2.5 腸道高DCA誘導(dǎo)IL- 6和單核細(xì)胞趨化蛋白- 1(monocyte chemotactic protein 1,MCP- 1)表達(dá)

小鼠結(jié)腸組織勻漿后提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA后利用實時PCR技術(shù)分別測組織IL- 6和MCP- 1的mRNA相對表達(dá)量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對照組小鼠結(jié)腸 IL- 6 mRNA表達(dá)量(1.0±0.1)相比，DCA組小鼠IL- 6 mRNA表達(dá)量(174.6±45.9)明顯升高(圖5A，P<0.01)。同時，DCA組小鼠結(jié)腸的MCP- 1 mRNA表達(dá)量也顯著升高(圖5B，對照組1.0±0.1vsDCA組187.8±26.2，P<0.001)。

與對照組相比，aP<0.01；bP<0.001

圖5 DCA對小鼠結(jié)腸IL- 6、MCP- 1 mRNA表達(dá)量的影響

Fig 5 Effects of DCA on the mRNA level of IL- 6, MCP- 1 of colon tissue in mice

3 討 論

膽汁酸是雙親性膽固醇代謝產(chǎn)物，在肝臟合成，儲存于膽囊，然后釋放入腸道，肝臟合成的初級膽汁酸可在腸道細(xì)菌作用下進(jìn)行7- α脫羥作用生成次級膽汁酸，腸道中的各種膽汁酸經(jīng)肝腸循環(huán)重吸收由門靜脈進(jìn)入肝臟，少部分(約4%)留在腸道，主要為DCA、石膽酸，其中DCA約占人類糞便總膽汁酸的58%[11- 12]。研究發(fā)現(xiàn)，高脂飲食能引起膽汁的大量分泌，可導(dǎo)致腸道糞便中次級膽汁酸水平顯著增高，尤其是DCA。Stenman等發(fā)現(xiàn)高脂飲食的動物糞便DCA的含量較正常飲食升高近10倍，并且腸道防御功能也受到損傷[4]。臨床資料發(fā)現(xiàn)IBD患者腸道DCA水平升高，并且在炎癥病灶結(jié)腸組織積聚的DCA水平增高尤為顯著[10]。研究顯示，對大鼠進(jìn)行短暫的DCA灌腸可誘導(dǎo)輕度結(jié)腸炎和長久性內(nèi)臟痛覺過敏[13]。我們的研究發(fā)現(xiàn)，給予小鼠添加0.2% DCA的膳食3個月后其結(jié)腸長度明顯縮短，代表腸道炎癥程度的指標(biāo)MPO活性顯著上升。HE染色可見結(jié)腸黏膜破損，黏膜下水腫及大量炎癥細(xì)胞浸潤，類似于人類的IBD，提示高水平DCA可以誘導(dǎo)腸道炎癥；尤為重要的是，DCA膳食可明顯誘導(dǎo)結(jié)腸組織成熟IL- 1β的產(chǎn)生，提示炎癥小體活化的存在。IL- 1β作為參與腸道炎癥的重要促炎癥因子之一，處于炎癥反應(yīng)的上游，能引起多種炎癥細(xì)胞因子和效應(yīng)分子的產(chǎn)生(IL- 6、TNF- α等)，被認(rèn)為在腸道炎癥級聯(lián)反應(yīng)的早期階段尤為關(guān)鍵，因此，激活炎癥小體、促進(jìn)IL- 1β產(chǎn)生可能是高水平DCA誘導(dǎo)腸道炎癥的重要機(jī)制之一。

天然免疫系統(tǒng)在早期宿主防御病原體機(jī)制中起著舉足輕重的作用，被認(rèn)為是機(jī)體防御的第一道防線，其中單核- 巨噬細(xì)胞主要通過PRRs來識別和吞噬病原體。目前已知的PRRs主要包括Toll- like receptor(TLR)、NOD- like receptor(NLR)、RIG- I- like receptor(RLR)等，PRRs感知進(jìn)化保守的病原體相關(guān)分子模式PAMPs，觸發(fā)胞內(nèi)信號通路的活化，導(dǎo)致大量細(xì)胞因子的產(chǎn)生，進(jìn)而啟動和促進(jìn)適應(yīng)性免疫應(yīng)答。目前研究證明PRRs不僅識別PAMPs，也可識別宿主內(nèi)源性危險信號- 損傷相關(guān)分子模式DAMPs，在多種炎癥性疾病中發(fā)揮重要作用。NLRP3炎癥小體是天然免疫系統(tǒng)的重要組成部分，其異?；罨c多種感染性炎癥及無菌性炎癥密切相關(guān)，包括炎癥性腸病。NLRP3在CD患者和2,4,6- 三硝基苯磺酸(2,4,6- trinitrobenzenesulfonic acid, TNBS)誘導(dǎo)的小鼠腸炎模型中均高表達(dá)[10,14]；NLRP3敲基因小鼠對于葡聚糖硫酸鈉(dextran sulfate sodium salt, DSS)誘導(dǎo)的腸炎易感性明顯降低[7]。以往研究證明NLRP3炎癥小體可識別多種內(nèi)源性成分，如尿酸結(jié)晶、ATP等。目前已知激活NLRP3炎癥小體的方式主要包括促進(jìn)鉀離子外流、誘導(dǎo)活性氧(reactive oxygen species, ROS)產(chǎn)生以及溶酶體破壞(組織蛋白酶B釋放)等3種模式，不同的刺激因素可能通過一種或多種模式激活NLRP3炎癥小體[9]。DCA是否可以直接激活NLRP3炎癥小體，其激活特點及模式如何仍在探討之中。

此外，膽汁酸作用的發(fā)揮主要是通過其受體實現(xiàn)的，膽汁酸受體分為核受體和膜表面受體，主要包括法尼醇X受體(farnesoid X receptor, FXR)和G蛋白偶聯(lián)膽汁酸受體(the G- protein- coupled bile acid receptor， Gpbarl)即TGR5等[15]。研究表明,上述受體在巨噬細(xì)胞均有不同程度的表達(dá)。膽汁酸通過激活相應(yīng)受體控制脂肪和碳水化合物的平衡，參與能量平衡、血糖控制及免疫調(diào)節(jié)。對于介導(dǎo)DCA誘導(dǎo)腸道炎癥受體的研究將有助于發(fā)現(xiàn)IBD治療的新靶點。

綜上所述，我們的研究結(jié)果提示膽汁酸DCA可能通過激活炎癥小體、促進(jìn)IL- 1β分泌參與高脂飲食誘導(dǎo)的腸道炎癥，在此基礎(chǔ)上，對相關(guān)機(jī)制的進(jìn)一步深入探討可能為高脂飲食誘導(dǎo)腸炎的預(yù)防及藥物治療提供重要靶點，并為指導(dǎo)建立正確的飲食習(xí)慣提供理論依據(jù)。

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(本文編輯：周蘭波)

Study of deoxycholic acid on the production of IL- 1β and induction of intestinal inflammation

ZHAO Sheng- nan1,2,GONG Zi- zhen1,2, ZHOU Jie- fei1,2,WU Jin1,2

(1.XinhuaHospital,SchoolofMedicine,ShanghaiJiaoTongUniversity,Shanghai200092,China;2.ShanghaiInstituteforPediatricResearch,Shanghai200092,China)

Objective:To investigate the effect of high level deoxycholic acid(DCA)on the IL- 1β production and intestinal inflammation occurrence. Methods: Mice were fed with routine diet supplemented with 0.2% DCA, HE staining was performed to observe intestinal pathological injury; Western Blot and Realtime PCR were adopted to detect mature IL- 1β production and IL- 6, MCP- 1 expression respectively; intestinal inflammation was assessed by the measurement of MPO activity. Results: Mice fed the DCA- supplemented diet developed obvious intestinal inflammation and injury, as evidenced by significant shortening of colon length [control group(8.1±0.5) cmvsDCA group(7.3±0.3)cm,P<0.01] and much higher MPO activity [control group(1.6±0.4)U·g-1vsDCA group(3.0±0.5)U·g-1，P<0.01]; HE staining of colonic tissue in DCA group showed intestinal mucosal impairment, submucosal edema and inflammatory cell infiltration. Of note, the mature IL- 1β level in colon tissue was elevated dramatically in DCA- fed group. Meanwhile, the mRNA levels of IL- 6 (control group 1.0±0.1vsDCA group 174.6±45.9，P<0.01) and MCP- 1 (control group 1.0±0.1vsDCA group 187.8±26.2，P<0.001) in DCA group were significantly increased as well. Conclusion: High level DCA can induce the occurrence of intestinal inflammation, which may at least partially depend on the activation of inflammasome and production of IL- 1β.

inflammatory bowel disease; deoxycholic acid; IL- 1β; inflammasome; mice

2016- 09- 05

2016- 12- 20

上海市自然科學(xué)基金資助項目(16ZR1428500)

趙勝男(1991-)，女，山東濟(jì)寧人，在讀碩士研究生。E- mail:zhaoshn1991@126.com

吳瑾 E- mail:wujin51@yahoo.com

趙勝男,龔自珍,周潔菲,等.脫氧膽酸促進(jìn)腸道組織產(chǎn)生IL- 1β及誘導(dǎo)腸道炎癥作用的研究[J].東南大學(xué)學(xué)報:醫(yī)學(xué)版,2017,36(2):171- 176.

R574.62

A

1671- 6264(2017)02- 0171- 06

10.3969/j.issn.1671- 6264.2017.02.008