張泳 王建華 李迎春

shRNA-PTTG對A549肺癌細(xì)胞株生物學(xué)功能的影響

張泳 王建華 李迎春

目的 探討shRNA-PTTG對肺癌A549細(xì)胞生物學(xué)功能的影響。方法 采用shRNA技術(shù)沉默PTTG蛋白的表達(dá)，使用western blot與RT-PCR檢測沉默效率，使用western blot檢測沉默PTTG后VEGF蛋白的表達(dá)影響，使用MTT檢測細(xì)胞增殖，使用流式細(xì)胞儀檢測周期。結(jié)果 western blot與PCR結(jié)果顯示shRNA成功沉默PTTG蛋白的表達(dá)，且VEGF表達(dá)明顯下降，MTT結(jié)果顯示沉默PTTG后，細(xì)胞生長明顯收到抑制，流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示，沉默PTTG后G2-M期明顯延緩。結(jié)論 PTTG基因具有促進(jìn)肺癌A549細(xì)胞株增殖的作用，且可能是通過VEGF而發(fā)揮作用。

PTTG；VEGF；肺癌；增殖

肺癌是當(dāng)今世界上對人類健康與生命危害最大的惡性腫瘤之一。世界上許多國家和地區(qū)肺癌的發(fā)病率和死亡率都有所增加，今后30年內(nèi)肺癌將成為中國居民的主要死亡原因[1]。目前,肺癌患者的5年生存率為10%[2]，非小細(xì)胞肺癌早期確診手術(shù)切除率低，對放化療均不太敏感，因此針對該腫瘤的生物學(xué)和基因療法尤為重要。研究PTTG在肺癌中的表達(dá)對于進(jìn)一步了解非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生、浸潤和轉(zhuǎn)移機(jī)制，探討新的有效治療方法具有重要意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 小量質(zhì)粒提取試劑盒為中鼎試劑公司產(chǎn)品。Lipofectamine2000購自Invitrogen公司。編碼針對PTTG的shRNA由上海吉瑪生物工程技術(shù)有限公司合成。RNA提取試劑盒及RT-PCR試劑盒為TaKaRa公司產(chǎn)品。一抗分別為兔抗人PTTG抗體，兔抗人VEGF抗體，B-actin抗體購自博奧森生物工程有限公司，二抗為辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔抗體為北京中山金橋。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 人肺癌細(xì)胞株A549（上海細(xì)胞生物學(xué)研究所），采用DMEM培養(yǎng)基、10%胎牛血清、37℃、5%CO，的條件下培養(yǎng)。針對人PTTG的shRNA質(zhì)粒的構(gòu)建委托上海吉瑪生物有限公司合成確定三條shRNA-PTTG以及一條NC對照組。嚴(yán)格按照lipofectamine2000（Invitrogen公司）試劑說明說進(jìn)行細(xì)胞的轉(zhuǎn)染，取對數(shù)生長期的細(xì)胞，接種于6孔板或96孔板內(nèi)，待細(xì)胞達(dá)到85%～90%的融合，按照質(zhì)粒：轉(zhuǎn)染試劑比例為4μg∶6μL分別加入質(zhì)粒與轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，6h后換上新鮮的培養(yǎng)液，24h后查看轉(zhuǎn)染效率，轉(zhuǎn)染48h后進(jìn)行后續(xù)檢測。

1.3 western blot檢測VEGF蛋白表達(dá) 取轉(zhuǎn)染效率達(dá)較高的細(xì)胞，提取細(xì)胞蛋白，定量，置于-20%保存，每樣品取15μL加入等體積loading buffer，于聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，濃縮膠電壓80V，分離膠電壓120V，電泳時(shí)間約1h。半干轉(zhuǎn)移法，恒流轉(zhuǎn)移2h；電轉(zhuǎn)移后的PVDF膜用依次進(jìn)行脫脂奶粉封閉，在一抗四度過夜（PTTG與VEGF稀釋比例為

1∶200和1∶100），PBST溶液洗膜，二抗室溫孵育2h（稀釋比例為1∶1000），暗房中用ECL溶液顯色，壓片，顯影。

1.4 RT-PCR檢測PTTG mRNA表達(dá) 根據(jù)PTTG序列在Qiagen公司設(shè)計(jì)其特異性引物，收集轉(zhuǎn)染48h后的A549肺癌細(xì)胞，按Trizol操作說明書提取細(xì)胞總RNA，按照RT—PCR試劑盒說明書檢測PTT GmRNA含量。取PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，凝膠成像系統(tǒng)掃描鑒定。

1.5 MTT測細(xì)胞增殖 將實(shí)驗(yàn)共分為5組，無質(zhì)粒陰性對照組，PTTG-shRNA-NC，PTTG-shRNA-1，PTTG-shRNA-2，PTTG-shRNA,3，每組設(shè)置5復(fù)孔，每孔5×103個(gè)細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中。培養(yǎng)24,48,72h后每孔加入0.5g/L的MTT，孵育4h后，每孔加入150μL二甲基亞砜（DMSO)溶解結(jié)晶，選擇波長490nm吸光度讀取數(shù)值，時(shí)間為橫軸，吸光度值為縱軸繪制細(xì)胞生長曲線。重復(fù)3次。

1.6 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期 A549細(xì)胞轉(zhuǎn)染48h候，取

2×106個(gè)細(xì)胞，PBS洗滌，70%冰乙醇固定，加入500μg/mL的碘化丙啶(PI)和10mg/mLRNA酶A，37℃避光染色30min，流式細(xì)胞儀檢測，分別計(jì)算出G0/G1期、S期細(xì)胞所占的百分比。每組重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行處理，正態(tài)計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)分析RT-PCR、westemblot，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 shRNA-PTTG在體外A549細(xì)胞中可以明顯降低PTTG蛋白與VEGF蛋白的表達(dá) RT-PCR檢測后發(fā)現(xiàn)

shRNA-PTTG-1，shRNA-PTTG-2，shRNA-PTTG-3轉(zhuǎn)染組中PTTG 蛋白的表達(dá)明顯低于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，見圖1）；western blot檢測后發(fā)現(xiàn)shRNAPTTG-1，shRNA-PTTG-2，shRNA-PTTG-3轉(zhuǎn)染組中PTTG蛋白的表達(dá)明顯低于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，見圖2）。表明構(gòu)建的shRNA-PTTG質(zhì)粒成功，可有效降低PTTG在肺癌A549細(xì)胞中mRNA水平與蛋白水平的表達(dá)。而PTTG被沉默后其靶基因VEGF蛋白的表達(dá)明顯下降。提示PTTG可能是通過VEGF而發(fā)揮作用（見圖1）。

圖1 sh-RNA-PTTG對A549細(xì)胞內(nèi)PTTG蛋白以及VEGF蛋白的影響

2.2 shRNA-PTTG對肺癌細(xì)胞株A549細(xì)胞增殖的影響MTT結(jié)果顯示shRNA-PTTG-1，-2，-3組A549肺癌細(xì)胞增殖與對照組相比明顯降低，細(xì)胞生長明顯收到抑制，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，見圖2）。

圖2 shRNA-PTTG對AS49細(xì)胞增值的影響

2.3 shRNA-PTTG對細(xì)胞周期的影響 流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示shRNA-PTTG組A549肺癌細(xì)胞與其對照組相比G2-M明顯延緩，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而S期與G0-G1未見顯著差異（見表1）。

表1 shRNA-PTTG對細(xì)胞周期的影響

3 討論

PTTG是Pei[3]等于1997年采用PCR方法分離出的一種新型原癌基因。該課題組將轉(zhuǎn)染PTTG基因的成纖維細(xì)胞種植于無胸腺裸鼠皮下后，發(fā)現(xiàn)其于3周后形成腫瘤，因而將這一基因定名為垂體瘤轉(zhuǎn)化基因。在隨后的研究中，Zhang[4]等發(fā)現(xiàn)PTTG基因(hPTTG)定位于染色體的5q33區(qū)，并且含有603個(gè)堿基對組成的開放閱讀框，編碼產(chǎn)生一個(gè)26KD的蛋白。隨著越來越多的基因研究發(fā)現(xiàn)，PTTG在人類多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用。

腫瘤是一種細(xì)胞周期，凋亡等因素發(fā)生紊亂的一種惡性程度極高的疾病，其根本原因在于細(xì)胞的正性因子表達(dá)增強(qiáng)或負(fù)性因子表達(dá)減弱，導(dǎo)致細(xì)胞過度生長、分裂，出現(xiàn)細(xì)胞生長失控。新近研究表明PTTG可能為一種腫瘤轉(zhuǎn)化基因，它可以通過多條途徑而誘導(dǎo)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，并且這種作用在沒有其他基因輔助時(shí)也存在，可能單獨(dú)發(fā)揮作用[5]。研究發(fā)現(xiàn)，PTTG具有刺激細(xì)胞有絲分裂因子和血管生長因子的分泌與表達(dá)，從而可以通過促進(jìn)血管的生成而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖作用。Zhang等[4]在研究垂體腺瘤時(shí)發(fā)現(xiàn)PTTG mRNA表達(dá)水平顯著升高，且其在分泌型腫瘤中，侵犯蝶竇者PTTG表達(dá)水平明顯高于未侵犯者。更有研究報(bào)道[6-7]，在112例垂體瘤標(biāo)本的檢測中發(fā)現(xiàn)PTTG與VEGF的mRNA水平和PTTG，VEGF蛋白水平以及KDF/ FIK-I mRNA及其蛋白在垂體腫瘤中的表達(dá)量明顯高于其在正常垂體組織的表達(dá)。堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)和血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)是調(diào)節(jié)血管生成的重要因子Heaney等[8]在表達(dá)小鼠的GH細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)bFGF的表達(dá)水平在24h內(nèi)增加了240%，并且PTTG mRNA與bFGF的最高水平同時(shí)出現(xiàn)，而加入bFGF抗體時(shí)，PTrG mRNA的水平又降低了。這似乎表明PTI'G和bFGF之間存在正反饋的調(diào)節(jié)機(jī)制。而本研究中發(fā)現(xiàn)在沉默PTTG后其A549肺癌細(xì)胞株中的VEGF表達(dá)亦降低[9]。更提示了PTTG基因可能調(diào)節(jié)血管生成生長因子的表達(dá)，從而擾亂腫瘤組織及其間質(zhì)內(nèi)的血管生成平衡，啟動(dòng)血管生成機(jī)制，促進(jìn)腫瘤的生長和侵襲等。隨著研究的深入，在轉(zhuǎn)染PTI'G的人胚腎細(xì)胞、子宮平滑肌瘤、甲狀腺癌等中發(fā)現(xiàn)FGF、VEGF的水平與PTTG呈劑量依賴性增高[10]。

MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在PTTG基因沉默后，A549細(xì)胞生長和存活能力受到明顯的影響，細(xì)胞活力產(chǎn)生了巨大的交化。這可能是由于PTTG激活脯氨酸的增殖基因C-myc，而其在調(diào)控細(xì)胞的增生中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。在酵母和哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，PTTG表達(dá)蛋白與異源性DNA結(jié)合區(qū)融合后，其酸性羧基末端具有反式激活作用。蛋白激酶級聯(lián)的活化可增強(qiáng)PTTG蛋自反式作用。而MAPK又可通過51-54氨基酸間的SH3結(jié)合位點(diǎn)與PTTG直接作用。MAPK磷酸化及MEKI與PTTG相互作用不僅能增強(qiáng)PTTG反式激活功能，也能促進(jìn)PTTG表達(dá)蛋自移位于核內(nèi)激活原癌基因生長因子從而促進(jìn)腫瘤生長[11]。

綜上所述，沉默PTTG基因在A549肺癌細(xì)胞中的表達(dá)后其下游基因VEGF的表達(dá)明顯下降，A549肺癌細(xì)胞株的增殖明顯收到抑制，且使A549肺癌細(xì)胞停滯在G2-M期，從而達(dá)到抑制腫瘤細(xì)胞生長的作用。

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Objective To explore the biological functions of shRNA - PTTG on A549 lung cancer cell. Methods The shRNA technology used to silence the expression of PTTG protein，and then using western blot and rt-pcr detection efficiency; The western blot was also used to detect the expression of VEGF protein after PTTG silenced. MTT was used to detect cell proliferation and using flow cytometry instrument testing cycle. Results Western blot and PCR showed that shRNA success silence the expression of PTTG protein and the expression of VEGF was decreased obviously. MTT and flow cytometry results showed that A549 cell growth is suppressed obviously and G2 -m period significantly down shifting after PTTG silence. Conclusion PTTG gene can promote the proliferation of A549 cell lines, and VEGF may be play a role in this procession.

PTTG; VEGF; Lung cancer; Proliferation

10.3969/j.issn.1009-4393.2014.20.001

陜西省教育廳專項(xiàng)科研項(xiàng)目（2010JK505）

陜西 712000 陜西中醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院外三科 （張泳 王建華）710054 解放軍323醫(yī)院護(hù)理部（李迎春）