陳偉娜　陳嘉璐　曾華哲　王燕清

[摘要]目的通過檢驗、控制丹曲林鈉原料藥的內(nèi)毒素水平以期控制注射用丹曲林鈉的內(nèi)毒素限值，因此需要建立丹曲林鈉原料藥的細(xì)菌內(nèi)毒素驗證方法。方法用DMF溶解丹曲林鈉至0.12mg/mL，以靈敏度為0.06EU/mL的兩個廠家的鱟試劑，按照內(nèi)毒素檢測方法進(jìn)行了鱟試劑靈敏度復(fù)核實驗、溶劑干擾試驗、樣品干擾試驗等方法學(xué)驗證實驗。結(jié)果兩個廠家鱟試劑的入c均為0.06EU/mL，在0.5～2入之內(nèi)；采用上述方法進(jìn)行驗證，溶劑及樣品均無干擾。結(jié)論丹曲林鈉原料內(nèi)毒素驗證需要DMF溶解樣品，按照最低稀釋濃度要求配制的供試品對內(nèi)毒素的檢測也沒有干擾，因此可以判定可用該方法對本品進(jìn)行內(nèi)毒素檢查。

[關(guān)鍵詞]丹曲林鈉；細(xì)菌內(nèi)毒素；方法學(xué)驗證；DMF

[中圖分類號]R927

[文獻(xiàn)標(biāo)識碼]A

[文章編號]2095-0616（2017）03-53-04

丹曲林鈉的商品名為Dantrium，是美國保潔（P&G）公司研制的藥物，于1979年被美國FDA批準(zhǔn)上市。丹曲林鈉用于治療惡性高熱。惡性高熱（malignant hyperthermia，MH）是一種嚴(yán)重的骨骼肌肉代謝亢進(jìn)綜合征，是一種常染色體顯性遺傳性疾病。MH的發(fā)生主要是基于骨骼肌細(xì)胞內(nèi)迅速且不可控的ca2+濃度增加，進(jìn)而產(chǎn)生致死性的代謝亢進(jìn)危象，在沒有特異性治療藥物的情況下，一般的臨床降溫措施難以控制體溫的增高，最終可導(dǎo)致患者死亡。據(jù)報道，在接受全身麻醉的患者中MH發(fā)生率在1：10000到1：250000，且各地發(fā)生率各有差異。有丹麥研究稱MH發(fā)病率在1：250000，紐約的一項研究稱MH發(fā)病率在1：100000，同時，另一項法國的研究發(fā)現(xiàn)全身麻醉中MH發(fā)生率可達(dá)1：10000，而且他們發(fā)現(xiàn)利用基因檢測的方法預(yù)估其發(fā)病率應(yīng)該在1：2000到1：3000之間。近來，有研究稱攜帶MH相關(guān)治病基因的幾率可高達(dá)1：400。丹曲林鈉是特異性RYRl受體拮抗劑，是目前公認(rèn)的治療MH發(fā)作的特效藥，它能夠關(guān)閉RYRl受體的異常開放，迅速減少肌質(zhì)網(wǎng)釋放Ca2+，從而終止MH發(fā)作。其具體作用位點尚不明確，有研究稱可通過改變RYRl與DHPR間的聯(lián)系從而抑制DHPR通道，或者通過與RPRl特異性位點結(jié)合而抑制該通道。丹曲林鈉自1979年使用以來，MH的死亡率大大降低，從80%降低至不足10%。有研究稱在MH發(fā)生早期（30min內(nèi)）使用丹曲林鈉，其死亡率有明顯降低。

內(nèi)毒素（endotoxin）是一種革蘭陰性細(xì)菌細(xì)胞壁外膜的主要組成成分，其化學(xué)本質(zhì)為脂多糖（1ipopolysaccharide，LPS），是誘發(fā)炎癥反應(yīng)過程中主要的致病成分。因此，對于注射劑必須嚴(yán)格控制產(chǎn)品中的內(nèi)毒素。本文主要闡述如何控制丹曲林鈉的內(nèi)毒素方法，具體研究如下。

1.材料

1.1實驗器材

DZKW-2型恒溫水浴鍋（上海路達(dá)實驗儀器有限公司），XW-80型旋渦混合儀（上海精科實業(yè)有限公司），101-2-BS型烘箱（上海市實驗儀器總廠）。

1.2樣品

丹曲林鈉原料，由麗珠醫(yī)藥集團(tuán)研究所提供。

1.3細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品及檢查用水

細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品：批號為150601-200968，效價150EU/支；購自中檢所；細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水：批號為1608220，裝量為5mL/支，購自湛江安度斯生物有限公司。

1.4鱟試劑

鱟試劑1：靈敏度為0.06EU/mL；批號為1601042，裝量：0.1mI/支；購自湛江安度斯生物有限公司；鱟試劑2：靈敏度為0.06EU/mL；批號為160201，裝量：0.1mI]支；購自廈門市鱟試劑實驗廠有限公司。

2.方法與結(jié)果

2.1細(xì)菌內(nèi)毒素限值的計算

本原料制成的成品為注射用丹曲林鈉，為靜脈推注注射劑，已知注射劑最大可接受的內(nèi)毒素劑量K=5EU/kg/h，根據(jù)本品所制備成的注射用丹曲林鈉制劑說明書提供的臨床最大使用量，M=600mg/60kg/h（20mg×30瓶），細(xì)菌內(nèi)毒素限值L為：L=K/M=（5EU/kg/h）/600mg/60kg/h=0.5EU/mg，即每1mg丹曲林鈉中含內(nèi)毒素不超過0.5EU。

2.2最小稀釋濃度的確定

C=入/L=0.06/0.5=0.12mg/mL，因此擬定最小有效稀釋濃度為0.12mg，mL。

2.3鱟試劑靈敏度復(fù)核

將細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水溶解，在旋渦混合器上混合15min，然后分步稀釋制備成每1mL含內(nèi)毒素0.12，0.06，0.03，0.015EU的溶液，依法測定（中國藥典2015年版四部通則1143），結(jié)果見表1～2。

計算結(jié)果表明，鱟試劑1與鱟試劑2的入c均為0.06EU/mL，在0.5～2入之內(nèi)，因此鱟試劑標(biāo)示靈敏度為0.06EU/mL。

2.4干擾實驗

2.4.1供試液制備方法

取本品及參比樣品10mg，依法測定（中國藥典2015年版四部凡例），試驗結(jié)果表明本品在N，N-二甲基甲酰胺中溶解，在甲醇中微溶，在冰乙酸中極微溶解，在乙醚、水和乙酸中幾乎不溶。具體試驗結(jié)果見表3。

為了保證原料在較小體積的溶液中溶解，本品供試品制劑選用DMF溶解，制備成10mg/mL的溶液。

2.4.2溶劑干擾實驗驗證取溶劑DMF，分別制備溶液A、B、C、D，依法測定（中國藥典2015年版四部通則1143），結(jié)果見表4。

由以上數(shù)據(jù)可得知，溶液A和陰性對照溶液D的所有平行管都均為陰性，溶液C的結(jié)果Es為入，在0.5～2入之內(nèi)，Et為入，在0.5～2Es之內(nèi)，因此可認(rèn)為溶劑DMF在該檢測濃度下對鱟試劑無干擾作用。

2.4.3樣品干擾試驗驗證使用內(nèi)毒素檢查用水和濃度為0.12mg/mL的未檢出內(nèi)毒素的供試品溶液及細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品。按表5、6分別制備溶液A、B、C、D，依法測定（中國藥典2015年版四部通則1143），結(jié)果見表5～6。

由以上數(shù)據(jù)可得知，兩種鱟劑干擾試驗中溶液A和陰性對照溶液D的所有平行管都均為陰性，溶液C的結(jié)果Es為）L，在0.5～2入之內(nèi)；鱟試劑1干擾試驗溶液B的Et值為0.07，鱟試劑2干擾試驗溶液B的Et值為0.06，Et均在0.5～2Es之內(nèi)；因此可認(rèn)為供試品在該檢測濃度下對鱟試劑無干擾作用。

2.5試驗結(jié)果

由以上試驗可知，選用的兩種鱟試劑的靈敏度復(fù)核符合規(guī)定，而且選用的溶劑對內(nèi)毒素的檢測沒有干擾，按照最低稀釋濃度要求配制的供試品對內(nèi)毒素的檢測也沒有干擾，因此可以判定可用該方法對本品進(jìn)行內(nèi)毒素檢查。

3.討論

細(xì)菌內(nèi)毒素試驗是利用鱟試劑檢測供試品中或其表面可能存在的細(xì)菌內(nèi)毒素濃度的一種方法。細(xì)菌內(nèi)毒素試驗的方法有：凝膠法（gelation assay）、濁度法（turbidimetric assay）、顯色底物法（chlomogendcassay）、免疫法（immunology assay）等。其中經(jīng)典方法是凝膠法。目前，各國藥典收載的細(xì)菌內(nèi)毒素試驗法均包含凝膠法。

在凝膠法實驗中，需要保證樣品能夠完成溶解，才能準(zhǔn)確測定產(chǎn)品中的內(nèi)毒素限值，但是，由于丹曲林鈉幾乎不溶于水，所以在進(jìn)行內(nèi)毒素驗證時無法用水來溶解樣品進(jìn)行內(nèi)毒素的檢測。經(jīng)過對丹曲林鈉溶解度的系統(tǒng)考察，確定采用DMF來溶解。當(dāng)使用非水溶劑溶解時，需要考察溶劑是否對內(nèi)毒素的監(jiān)測產(chǎn)生干擾，本實驗進(jìn)行了溶劑干擾實驗，實驗結(jié)果證明DMF對產(chǎn)品檢測沒有干擾。

因該產(chǎn)品在使用過程中將根據(jù)患者的具體病癥進(jìn)行較大量的給藥，本品按照制劑說明書的最大給藥劑量進(jìn)行計算內(nèi)毒素的限值，所以本品的內(nèi)毒素限度較低，故選用靈敏度較高的（0.06EU/mL）鱟試劑。