李祖建?李偉

摘要：隨著Ⅱ型糖尿病發(fā)病率的逐年升高，尋找安全且可長(zhǎng)期使用的治療手段已成為醫(yī)學(xué)界研究的熱點(diǎn)。已有的研究表明運(yùn)動(dòng)干預(yù)可明顯改善胰島素抵抗，但關(guān)于其具體的分子機(jī)制尚不清楚。證據(jù)表明SIRT1表達(dá)下降或活性改變可能與胰島素抵抗相關(guān)性疾病的發(fā)病相關(guān)。通過(guò)研究，證實(shí)不同運(yùn)動(dòng)干預(yù)方案對(duì)SIRT1在Ⅱ型糖尿病大鼠腎臟中表達(dá)的影響，明確SIRT1在胰島素抵抗中的作用。

關(guān)鍵詞：有氧運(yùn)動(dòng)；Ⅱ型糖尿病；沉默信息調(diào)節(jié)因子

Ⅱ型糖尿病所引起的各種并發(fā)癥，已經(jīng)成為致死、致殘并造成醫(yī)療費(fèi)用增高的一個(gè)主要原因[1]。自上個(gè)世紀(jì)以來(lái)，適當(dāng)合理的運(yùn)動(dòng)對(duì)糖尿病的預(yù)防和控制作用已得到了學(xué)術(shù)界和大眾的認(rèn)可。近年來(lái)，沉默信息調(diào)節(jié)因子1（SIRT1）的功能在改善胰島素抵抗的作用中日益受到關(guān)注。越來(lái)越多的證據(jù)表明SIRT1 表達(dá)下降或其活性改變可能參與胰島素抵抗相關(guān)性疾病的發(fā)生發(fā)展。SIRT1在線粒體生物發(fā)生、脂肪代謝、抗氧化等一系列與胰島素抵抗產(chǎn)生相關(guān)的病理生理過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用。運(yùn)動(dòng)在預(yù)防和控制胰島素抵抗、Ⅱ型糖尿?。═2DM）以及與糖尿病相關(guān)的合并癥中起重要作用[3]。本項(xiàng)目擬通過(guò)高糖高脂飲食和鏈脲佐菌素誘導(dǎo)建立T2DM模型，探討T2DM大鼠腎臟SIRT1的表達(dá)和相關(guān)指標(biāo)的變化。采用不同的運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度對(duì)高脂飲食實(shí)驗(yàn)大鼠進(jìn)行運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練，研究合理的運(yùn)動(dòng)干預(yù)對(duì)T2DM大鼠腎臟SIRT1的表達(dá)的影響。

一、研究方法

（一）T2DM大鼠模型建立

造模組大鼠在高糖高脂飲食喂養(yǎng)4周后，左下腹腔注射STZ（30mg/kg，隔日1次，共2次）。健康對(duì)照組以普通飼料喂養(yǎng)4周后，注射等量檸檬酸緩沖液（30mg/kg，隔日1次，共2次）。注射藥物后間隔7天血糖測(cè)試儀檢測(cè)大鼠空腹血糖（測(cè)試前禁食12 h）即注射后血糖，以血糖含量16.7 mmol/L為Ⅱ型糖尿病大鼠模型判定標(biāo)準(zhǔn)。造模成功后繼續(xù)以普通飼料喂養(yǎng)，并定期測(cè)試每組大鼠血糖指標(biāo)。

（二）T2DM大鼠實(shí)驗(yàn)分組

造模成功的T2DM大鼠，隨機(jī)分為高脂飲食組（HFD組）、高脂飲食后低強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組（HFD-LE組）、高脂飲食后中等強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組（HFD-ME組），高脂飲食后高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組（HFD-HE組）。同時(shí)，普通飼料大鼠作為正常飲食健康對(duì)照組（H）。

（三）運(yùn)動(dòng)干預(yù)方案的實(shí)施

參照相關(guān)文獻(xiàn)的大鼠游泳運(yùn)動(dòng)方法，采用無(wú)負(fù)重耐力游泳運(yùn)動(dòng)方案，游泳水溫（30±2）℃，水深50cm，每只大鼠有200cm2的活動(dòng)面積以保證其持續(xù)活動(dòng)。高脂飲食后低強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組（HFD-LE組，10只）每天游泳30min，高脂飲食后中等強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組（HFD-ME組，10只）每天游泳60min，高脂飲食后高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組（HFD-HE組，10只）每天游泳90min，每周游泳6d，共持續(xù)6周。

（四）血樣及組織標(biāo)本采集

實(shí)驗(yàn)結(jié)束各組大鼠禁食12h（自由飲水），用10%的水合氯醛腹腔麻醉大鼠，固定，解剖。心尖取血于抗凝管中，3000r/min離心15min，分離血漿后置于-70℃冰箱冷凍保存。迅速取出大鼠腎臟標(biāo)本于冰袋上，剝離表面脂肪組織，置于-70℃冰箱保存，待作組織勻漿檢測(cè)。

（五）指標(biāo)測(cè)試

1.比色法定量檢測(cè)SIRT1活性

50mg組織加入0.5mLPBS中勻漿并置于10mlL的EP管，隨后加入1ml裂解液。強(qiáng)力渦旋震蕩10s后置于冰槽里孵育15min，隨后加入4ml預(yù)冷的分離液中混勻。放入4℃臺(tái)式離心機(jī)離心1300RPM，10min。小心抽去上清液置于10 ml的EP管中并加入4mL預(yù)冷的清理液，然后放入4℃臺(tái)式離心機(jī)離心1300 RPM，10min。小心抽去1mL上清液到新的預(yù)冷的1.5mL離心管。小心加入 100?L預(yù)冷的萃取液并混勻。加入10%Triton 10?L，使終濃度為1%，震蕩 30s 至1min。置于冰槽里孵育30min后放入4℃臺(tái)式離心機(jī)離心16000 RPM，10min。小心移取上清液到新的預(yù)冷的1.5ml離心管。移取10?L進(jìn)行蛋白定量檢測(cè)，其余用作活性測(cè)定。開(kāi)啟并設(shè)定好分光光度儀（溫度為30℃）：波長(zhǎng)405nm，并置零；輕輕搖動(dòng)96孔酶標(biāo)板30s，放進(jìn)30℃培養(yǎng)箱里，孵育60min，避免光照。輕輕搖動(dòng)96孔酶標(biāo)板30s，放進(jìn)30℃培養(yǎng)箱里，孵育30min，即刻放入酶標(biāo)儀檢測(cè)。

計(jì)算公式：SIRT1 活性（U/mg）=（樣品讀數(shù)-背景讀數(shù)）×0.1（mL）× 樣品稀釋倍數(shù)/0.02（mL）/10.5（吸光系數(shù)）/1（反應(yīng)時(shí)間）/0.6（光徑距離：cm）；

2. real-time PCR檢測(cè)組織中SIRT1 mRNA的表達(dá)

以Trizol液提取腎臟組織的總RNA，用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。應(yīng)用Primer5.0軟件設(shè)計(jì)引物，SIRT1引物：正義鏈5?-AAACTTTTGCTGTAA CCCTG-3?，反義鏈5?-CAAGCCGCCTA CTAATCT-3?。以GAPDH作為內(nèi)參照，其引物正義鏈5?-GCACCGTCAAGGCT GAGAAC-3?，反義鏈5?-ATGGTGGTG AAGACGCCAGT-3?。引物濃度為200nmol/L，反應(yīng)體系25?L，反應(yīng)試劑為SYBR Green PCR Master Mix。

3.Western blot檢測(cè)組織中SIRT1蛋白的表達(dá)

收集待測(cè)組織，4℃離心5min，向沉淀中加入50?LRIPA裂解液，于冰水浴中裂解30min，4℃、12000r/min離心10min，取上清，BCA法測(cè)定蛋白濃度。行12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，電轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜。以5%脫脂奶粉室溫封閉1h，分別加入鼠抗SIRT1抗體（1：100）、鼠抗B-actin抗體（1：1000）4℃過(guò)夜。TBST（pH=7.5，含10mmol/L Tris-HCl、150mmol/L NaCl、0.1%Tween-20）漂洗4次，10 min/次。加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗大鼠二抗，37℃孵育1 h，TBST漂洗4次。電化學(xué)發(fā)光顯影，采用美國(guó)UVP公司的GelDot-It300全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行分析。

（六）數(shù)理統(tǒng)計(jì)

采用SPSS23.0進(jìn)行分析，計(jì)量資料以X±S，P<0.05表示有顯著性差異。

二、研究結(jié)果

通過(guò)各實(shí)驗(yàn)組腎臟組織SIRT1活性的比較發(fā)現(xiàn)，與H組相比，HFD組SIRT1活性無(wú)顯著變化（P>0.05），HFD-LE、HFD-ME和HFD-HE組SIRT1活性顯著升高（P<0.05），但HFD-LE、HFD-ME和HFD-HE之間無(wú)顯著性差異（P>0.05）。（見(jiàn)表1）

三、研究結(jié)論

該研究證實(shí)，不同運(yùn)動(dòng)干預(yù)方案對(duì)SIRT1在T2DM腎臟中表達(dá)的影響，確定SIRT1在胰島素抵抗中的作用。有研究證實(shí)，運(yùn)動(dòng)的這種腎臟保護(hù)功能可能與其能夠增加SIRT1的表達(dá)有關(guān)。運(yùn)動(dòng)干預(yù)可能通過(guò)增加SIRT1的表達(dá)，減少p38和p53的表達(dá)，從而改善糖尿病腎病氧化應(yīng)激狀態(tài)，保護(hù)腎功能。進(jìn)一步提示增加SIRT1的表達(dá)可能有助于糖尿病。在脲鏈菌素誘導(dǎo)的糖尿病腎病大鼠模型中發(fā)現(xiàn)，運(yùn)動(dòng)干預(yù)能減少丙二醛的產(chǎn)生，增加超氧化物歧化酶和谷胱甘肽的水平，改善其氧化應(yīng)激狀態(tài)，同時(shí)亦能減輕蛋白尿，延緩肌酐清除率的下降，從而改善腎功能。[3]高脂飲食是誘導(dǎo)肥胖及Ⅱ型糖尿病的重要環(huán)境因素。糖尿病以血糖升高及代謝紊亂為其特征。糖尿病腎病目前已成為終末期腎臟病最主要的病因之一。研究表明SIRT1可能參與了糖尿病腎病的發(fā)生與發(fā)展。

參考文獻(xiàn)：

[1]Pagel-Langenickel I，Bao J，Pang L，et al.The role of mitochondria in the pathophysiology of skeletal muscle insulin resistance[J].Endocr Rev，2010，31：25-51.

[2]張好好.SIRT1 在改善高脂飲食誘導(dǎo)的胰島素抵抗模型中的作用及其機(jī)制研究[D].武漢：華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院，2012.

[3]趙軍，李方暉，付強(qiáng).沉默信息調(diào)節(jié)因子2相關(guān)酶1與運(yùn)動(dòng)[J].中國(guó)老年學(xué)雜志，2011，31：906-910.

（作者單位：李祖建 贛南醫(yī)學(xué)院康復(fù)學(xué)院；李偉 福建師范大學(xué)體育科學(xué)學(xué)院 贛南醫(yī)學(xué)院康復(fù)學(xué)院）