宗凱 趙營(yíng)莉 周莉質(zhì) 李秀秀 宮鵬 夏泉

摘要 [目的]建立并優(yōu)化黃芪甲基化敏感擴(kuò)增多態(tài)性（MSAP）技術(shù)擴(kuò)增反應(yīng)體系，對(duì)中藥材黃芪甲基化水平進(jìn)行研究。[方法]磁珠法提取黃芪DNA后，采用Hpa II/Msp I 2種內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，將酶切產(chǎn)物加上連接接頭序列，經(jīng)預(yù)擴(kuò)增和選擇性擴(kuò)增反應(yīng)，最終從黃芪 MSAP的256對(duì)引物中篩選出最佳分辨引物4對(duì)。應(yīng)用篩選到的4對(duì)引物，分析12種不同產(chǎn)地黃芪的甲基化模式，并對(duì)甲基化水平聚類分析。[結(jié)果]經(jīng)MSAP檢測(cè)12個(gè)黃芪樣本半甲基化率在12.5%～26.7%，全甲基化率在25.6%～51.1%，總甲基化率在48.7%～735%，總體上黃芪樣本的全甲基化率大于半甲基化率。采用NTSYSpc軟件對(duì)黃芪樣品Hpa II和Msp I多態(tài)性數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，獲得UPGMA聚類圖和主成分分析PCA圖。[結(jié)論]MSAP技術(shù)能夠很好地用于黃芪的甲基化分析，結(jié)合NTSYSpc軟件能對(duì)不同產(chǎn)地黃芪之間甲基化水平進(jìn)行聚類分析，且初步分析結(jié)果表明從UPGMA和PCA圖上來(lái)看，地區(qū)相近的單株聚類分析表現(xiàn)出了一定的地域性。

關(guān)鍵詞 黃芪；甲基化敏感擴(kuò)增多態(tài)性；選擇性擴(kuò)增；聚類分析

中圖分類號(hào) S188 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2017）29-0149-04

Primer Screening and Preliminary Application of MSAP for Radix astragali

ZONG Kai1，ZHAO Yingli2，ZHOU Lizhi1，XIA Quan2* et al

（1.Anhui EntryExit Inspection and Quarantine Bureau， Hefei，Anhui 230022；2.The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University， Hefei，Anhui 230022）

Abstract [Objective] To establish and optimize the amplification system of methylation sensitive polymorphism （MSAP） to study the methylation level of Radix astragali. [Method] DNA of Radix astragali was extracted by magnetic bead method and digested with HpaII/MspI endonuclease. The digested products were connected with the linker sequence， and then preamplification and selectively amplification were carried out. Four pairs of primers were screened out from the 256 pairs of primers of MSAP， and were used to analyze the methylation levels for 12 different habitat samples of R. astragali. [Result] For 12 samples， the rate of half methylation and full methylation were 12.5%-26.7% and 256%-51.1%， respectively. The total methylation rate was 48.7%-73.5%. The UPGMA clustering and principal component analyses （PCA） were obtained by analyzing the HpaII and MspI polymorphism data with NTSYSpc software. [Conclusion] MSAP technology can be used for the methylation analysis of R.astragali. The preliminary analysis of cluster analysis showed some regional characteristics of R. astragali from the UPGMA and PCA plots.

Key words Radix astragali；MSAP；Electively amplification；Cluster analysis

基金項(xiàng)目 國(guó)家質(zhì)檢總局科技計(jì)劃項(xiàng)目（2015IK001）。

作者簡(jiǎn)介 宗凱（1985— ），男，安徽合肥人，工程師，碩士，從事中藥材質(zhì)量安全研究。

*通訊作者，主任藥師，副教授，博士，從事中藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)研究。

收稿日期 2017-07-26

黃芪（Radix astragali）為豆科植物蒙古黃芪[Astragalus membranaceus（Fisch）Bge.var.mongholicus（Bge）Hsiao]或膜莢黃芪[Astragalus membranaceus（Fisch）Bge.]的干燥根[1]。黃芪屬于傳統(tǒng)的補(bǔ)虛藥，其化學(xué)成分主要為多糖類、皂苷類、黃酮類、氨基酸及微量元素等，具有抗腫瘤、增強(qiáng)免疫力、抗衰老、保肝、增強(qiáng)心肌收縮力和利尿等作用，被廣泛用于養(yǎng)生保健及相關(guān)疾病的臨床治療[2]。蒙古黃芪主產(chǎn)于內(nèi)蒙古、山西、甘肅和黑龍江，膜莢黃芪主要分布于我國(guó)東北、華北、甘肅、四川、西藏等省區(qū)，其化學(xué)成分存在顯著差異[3]。

DNA甲基化（DNA methylation）是表觀遺傳學(xué)的一種重要修飾形式，已有大量研究證實(shí)其在植物的基因表達(dá)、生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中起著重要作用，進(jìn)而影響植物化學(xué)成分的變化[4]。

DNA甲基化水平分析是研究表觀遺傳學(xué)的重要內(nèi)容，目前分析植物基因組總甲基化水平主要有甲基化敏感擴(kuò)增多態(tài)性技術(shù)（MSAP）、高效液相色譜法、5-甲基胞嘧啶免疫學(xué)抗體技術(shù)、SssI甲基轉(zhuǎn)移酶分析、氯乙醛反應(yīng)法等[5]。MSAP技術(shù)是由Reyna-López等[6]首次提出，并成功用于檢測(cè)真菌的DNA甲基化。后來(lái)MSAP技術(shù)開始應(yīng)用于多種植物甲基化水平的檢測(cè)，涉及植物抗逆性研究、發(fā)育調(diào)控與基因差異表達(dá)、種質(zhì)資源鑒定、組織培養(yǎng)材料的鑒定等方面[7]；在中藥的資源研究方面，MSAP技術(shù)也得到廣泛的應(yīng)用，如白術(shù)、川牛膝、丹參和廣藿香等[8-11]，但目前國(guó)內(nèi)對(duì)黃芪基因組甲基化方面的研究還較少[12]。該研究以黃芪為材料，利用MSAP技術(shù)篩選合適的擴(kuò)增引物，分析12組不同產(chǎn)地黃芪和對(duì)照藥材的甲基化水平，初步建立MSAP技術(shù)分析黃芪DNA甲基化的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黃芪藥材10個(gè)，經(jīng)河北省邯鄲市藥品檢驗(yàn)所孔增科教授鑒定為蒙古黃芪和膜莢黃芪，用前粉碎并過(guò)80目篩；黃芪對(duì)照藥材2個(gè)，購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院，分別為蒙古黃芪和膜莢黃芪（表1）。

Hpa II內(nèi)切酶（ER0511）、Msp I內(nèi)切酶（1ER0541）、EcoR I內(nèi)切酶（ER0271）和T4連接酶（EL0014）均購(gòu)自Thermo公司。2×Taq PCR Master Mix（kt201）和DL2000 Maker（md114）均購(gòu)自天根生化公司。引物和接頭由南京金斯瑞科技服務(wù)有限公司合成。磁珠提取試劑盒：ME1裂解緩沖液（20160530），ME2吸附緩沖液（20160530），ME3磁珠（20160607），ME4洗滌緩沖液（20160530）。

1.2 儀器與設(shè)備

5424小型高速離心機(jī)（Eppendorf公司）；Nanodrop 2000核酸蛋白分析儀（Thermo公司）；veriti梯度PCR儀（ABI公司）；全自動(dòng)DNA/RNA分析系統(tǒng)QIAxcel（QIAGEN公司）；全自動(dòng)DNA磁珠提取儀（Invitrogen公司）。

1.3 方法

1.3.1 基因組DNA的提取。

按照磁珠提取試劑盒的方法 對(duì)黃芪基因組DNA進(jìn)行提取，用Nanodrop 2000核酸蛋白分析儀進(jìn)行純度和濃度測(cè)定。

1.3.2 酶切反應(yīng)。

10 μL體系包括50～100 ng DNA、1.5 μL EcoR I、1.5 μL Hpa Ⅱ/Msp I、2 μL Buffer，ddH2O補(bǔ)至10 μL。37 ℃酶切6 h，80 ℃滅活15 min，取酶切產(chǎn)物上QIAxcel電泳檢測(cè)。

1.3.3 連接反應(yīng)。

連接接頭引物和反應(yīng)體系、條件參考文獻(xiàn)[13]。

1.3.4 預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)體系。

10 μL體系包括1 μL連接產(chǎn)物、5 μL 2×Taq PCR Master Mix、上下游預(yù)擴(kuò)增引物各1 μL，剩下用ddH2O補(bǔ)至10 μL。PCR擴(kuò)增條件：94 ℃ 2 min；94 ℃ 40 s，56 ℃ 45 s，72 ℃ 90 s（30個(gè)循環(huán)）；72 ℃ 5 min，25 ℃ 3 min，預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物上QIAxcel電泳檢測(cè)。

1.3.5 選擇性擴(kuò)增反應(yīng)體系與引物篩選。

將預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋50倍作為模板，10 μL體系與預(yù)擴(kuò)增體系相似。選擇性擴(kuò)增的PCR程序采用Touchdown PCR：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，65 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min（13個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)退火溫度下降0.7 ℃）；94 ℃ 30 s，54 ℃ 30 s， 72 ℃ 1 min（22個(gè)循環(huán)）；72 ℃ 5 min，25 ℃ 2 min，選擇性擴(kuò)增產(chǎn)物上QIAxcel電泳檢測(cè)。

按照16×16共組合成256對(duì)引物進(jìn)行篩選，引物序列參考文獻(xiàn)[13]。用QIAxcel電泳檢測(cè)引物篩選情況，將條帶豐富、圖譜清晰、多態(tài)性高的引物對(duì)保留。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因組DNA提取和酶切結(jié)果

試驗(yàn)采用磁珠法提取出黃芪基因組DNA，經(jīng)Nanodrop 2000核酸蛋白分析儀測(cè)定其OD260/OD280值均在1.7～2.1，純度和濃度均滿足后續(xù)MSAP試驗(yàn)要求。采用10 μL酶切體系，在37 ℃恒溫酶切6 h后經(jīng)電泳檢測(cè)，結(jié)果顯示酶切完全，可進(jìn)行下一步連接反應(yīng)。

2.2 預(yù)擴(kuò)增和選擇性擴(kuò)增引物篩選

優(yōu)化預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)體系后，將預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋50倍，取1 μL作為選擇性擴(kuò)增反應(yīng)的模板，采用10 μL體系進(jìn)行選擇性擴(kuò)增。選擇性擴(kuò)增采用EcoRI引物16組（E1～E16）和Hpa II /Msp I引物16組（HM1～HM16），共組合成256對(duì)引物進(jìn)行篩選，引物序列參考文獻(xiàn)[13]。

以7號(hào)黃芪樣品作為引物篩選模板，對(duì)256對(duì)引物組合進(jìn)行篩選，在100～800 bp選擇擴(kuò)增條帶致密、多態(tài)性高的引物組合。從256對(duì)引物組合中，綜合比較了Hpa II和Msp I引物篩選電泳圖，篩選出4對(duì)條帶豐富且清晰的引物組合（H1E16、H3E7、H5E4、H5E15），對(duì)12組黃芪樣品進(jìn)行MSAP檢測(cè)（圖1）。

2.3 甲基化水平分析

通過(guò) MSAP分析，12組黃芪樣品的半甲基化率在12.5%～26.7%，全甲基化率在25.6%～511%，而總甲基化率在48.7%～73.5%?？傮w上黃芪樣本的全甲基化率大于半甲基化率，其中2號(hào)黃芪全甲基化率是半甲基化率的4倍，5號(hào)、7號(hào)和11號(hào)黃芪全甲基化率是半甲基化率的2倍多（表2）。

2.4 UPGMA聚類和主成分PCA分析

將黃芪樣品甲基化敏感多態(tài)性和甲基化不敏感多態(tài)性產(chǎn)生的0和1矩陣保存在Excel表中，采用NTSYSpc軟件進(jìn)行聚類分析，得到12組黃芪樣品聚類分析圖（圖2）。圖2A和圖2B分別是采用2種內(nèi)切酶Hpa II和Msp I分析后獲得的結(jié)果。從圖2A可以看出，當(dāng)相似系數(shù)為0.77時(shí)，12組黃芪樣品可以分為4類，即1號(hào)和12號(hào)為第1類；2號(hào)、3號(hào)、5～9號(hào)、11號(hào)共8組樣品為第2類，這類包含樣品數(shù)最多，它們之間有較近的親緣關(guān)系；10號(hào)和4號(hào)樣品分別為第3和第4類。從圖2B可以看出，當(dāng)相似系數(shù)為0.80時(shí)，12組黃芪樣品可以分為7類；當(dāng)相似系數(shù)調(diào)整為0.75時(shí)，12組黃芪樣品可以分為4類，即1號(hào)、2號(hào)和12號(hào)為第1類；5～10號(hào)共6組樣品為第2類；3號(hào)、11號(hào)為第3類；4號(hào)為第4類。從產(chǎn)地來(lái)源上看，Hpa Ⅱ和Msp I多態(tài)性數(shù)據(jù)UPGMA圖的5～9號(hào)樣品劃為同一類，而5～9號(hào)樣品均產(chǎn)自甘肅地區(qū)，可見聚類分析表現(xiàn)出一定的地域性特點(diǎn)。

使用NTSYSpc軟件分別對(duì)Hpa Ⅱ 和Msp I 2種酶酶切獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析，觀察不同黃芪樣品在多維空間的分布狀態(tài)，結(jié)果見圖3。圖3A顯示，5～9號(hào)為一個(gè)很近群體，表明有很近的親緣關(guān)系，與聚類分析結(jié)果相似。圖3B中5～10號(hào)共6組樣品為一個(gè)群體，也與上述聚類分析一致。從圖3A和圖3B中可以看出，第一維度的貢獻(xiàn)率均大于第二維度貢獻(xiàn)率。與聚類分析類似，5～9號(hào)樣品在Hpa Ⅱ 和Msp I獲得主成分分析PCA圖上都表現(xiàn)了一定程度的地域性特點(diǎn)。

3 結(jié)論與討論

3.1 引物篩選的原則是條帶多、清晰、多態(tài)性高

選擇性擴(kuò)增采用EcoR I引物16組和 Hpa Ⅱ/Msp I引物16組，共組合成256對(duì)引物進(jìn)行篩選，篩選工作量比較大，因此采用QIAxcel分析系統(tǒng)，其能自動(dòng)獲得電泳結(jié)果，與普通做膠瓊脂糖電泳相比具有全自動(dòng)、高通量和電泳圖譜清晰等諸多優(yōu)點(diǎn)；QIAxcel分析系統(tǒng)在獲得高質(zhì)量的電泳圖譜同時(shí)，能自動(dòng)對(duì)擴(kuò)增條帶進(jìn)行分析，使用標(biāo)準(zhǔn)Marker后能對(duì)每一條帶進(jìn)行大小和濃度確定，特別是能夠區(qū)分條帶差異小的帶型。該研究通過(guò)比較后選擇了4對(duì)條帶豐富且清晰的引物組合（H1E16、H3E7、H5E4和H5E15），對(duì)12組黃芪樣品進(jìn)行MSAP檢測(cè)和分析。

3.2 不同單株黃芪的聚類分析和主成分分析

采用NTSYSpc軟件分別對(duì)EcoR I/Hpa Ⅱ 和EcoR I/Msp I組合獲得的多態(tài)性數(shù)據(jù)進(jìn)行UPGMA聚類分析和PCA主成分分析，2種分析結(jié)果類似。來(lái)自不同地區(qū)的黃芪樣品，DNA甲基化水平和模式存在差異，但從UPGMA和PCA圖上來(lái)看地區(qū)相近的單株，比如產(chǎn)地為甘肅黃芪有著較近的聚類，表現(xiàn)出一定程度上的地域性特點(diǎn)。

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