朱威　高兆建　李勇　焦魏　曹澤虹　孫會(huì)剛

摘要[目的]選育高富硒酵母菌株，優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)條件，以提高酵母生物富集、轉(zhuǎn)化有機(jī)硒的能力。[方法]以耐受亞硒酸鈉強(qiáng)的菌株為出發(fā)菌株，研究該菌株在培養(yǎng)過(guò)程中的亞硒酸鈉添加量、添加時(shí)間、酵母菌接種齡、培養(yǎng)溫度等參數(shù)，從而達(dá)到最優(yōu)的酵母生物量及富硒量。[結(jié)果]研究表明，酵母菌FX5菌株具有較高的耐受性和富硒能力。發(fā)酵條件優(yōu)化表明，F(xiàn)X5菌株在亞硒酸鈉添加量為20 g/L、添加硒的時(shí)間為6 h，富硒效果最好。在最佳的搖瓶培養(yǎng)條件下（初始硒濃度20 μg/mL，接種量10%，裝液量50/250 mL，溫度28 ℃，初始pH 6.0，搖床轉(zhuǎn)速160 r/min，接種齡84 h，培養(yǎng)60 h后），該釀酒酵母的生物量及富硒量分別達(dá)到40.1 g/L、1 120 mg/L。[結(jié)論]該研究可為富硒農(nóng)牧業(yè)生產(chǎn)提供一種安全的有機(jī)硒源。

關(guān)鍵詞生物富硒；酵母；有機(jī)硒

中圖分類(lèi)號(hào)TS201.3文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)0517-6611（2017）33-0087-03

Screening and Optimized Culture of Seleniumenriched Saccharomyces cerevisiae

ZHU Wei1，GAO Zhaojian2*， LI Yong2 et al

（1. Jiangsu Zhi Hui Biotechnology Co. Ltd.， Xuzhou ，Jiangsu 221008；2.College of Food （Biological） Engineering， Xuzhou Institute of Technology， Xuzhou，Jiangsu 221008）

Abstract[Objective]To select high selenium enriched yeast strains and optimize fermentation conditions to improve yeast bioaccumulation and transformation ability of organic selenium. [Method]With sodium selenite tolerance strong strain as the starting strain， the strain in the training process of sodium selenite adding amount and adding time， yeast inoculation age， culture temperature and other parameters， so as to achieve the optimal amount of biomass and selenium enriched yeast. [Result]The results showed that yeast FX5 strain had high tolerance and selenium accumulation ability. The optimization of fermentation conditions showed that the addition of sodium selenite was 20 g/L and the time of adding selenium was 6 h， and the effect of selenium enrichment was best for FX5 strain. In the best shake flask culture conditions （initial selenium concentration 20 g/mL， inoculum size 10%， medium volume 50/250 mL， temperature 28 ℃， initial pH 6， rotation speed of 160 r/min， 84 h age of inoculation， after cultured for 60 h）， biomass and Se content of the yeast were respectively 40.1 g/L， 1 120 mg/ L. [Conclusion]The study can provide a safe organic selenium source for the production of selenium enriched agriculture and animal husbandry.

Key wordsBioconcentration of selenium；Yeast；Organic selenium

硒是人和動(dòng)物所必需的微量元素，在生物體內(nèi)是谷胱甘肽過(guò)氧化物酶的活性中心元素，該酶能夠清除人體中的自由基并防止細(xì)胞膜氧化受損[1]。缺硒可能引起人體重要器官功能失調(diào)并導(dǎo)致癌癥、心腦血管疾病、糖尿病、肝病、甲狀腺激素失衡、免疫機(jī)能低下等多種疾病的發(fā)生[2-4]。隨著生物醫(yī)學(xué)技術(shù)的發(fā)展，微量元素硒已經(jīng)引起人們的高度重視。硒的補(bǔ)充主要通過(guò)無(wú)機(jī)硒及有機(jī)硒2種方式，而無(wú)機(jī)硒對(duì)人體有一定的毒性，故主要采用有機(jī)硒的補(bǔ)充方式[5]。酵母菌能夠在細(xì)胞內(nèi)將無(wú)機(jī)硒取代含硫氨基酸中的硫，生成硒代氨基酸，從而將無(wú)機(jī)硒轉(zhuǎn)化為有機(jī)硒，消除有機(jī)硒的毒害作用。因此酵母硒具有更易為機(jī)體吸收、利用性高、安全性強(qiáng)等優(yōu)勢(shì)[6-7]。因此，富硒酵母是營(yíng)養(yǎng)功能更全面的有機(jī)硒補(bǔ)充劑。臨床試驗(yàn)證明，通過(guò)服用富硒酵母可以提高血漿中的硒含量，并能有效降低癌癥的發(fā)生率和死亡率[8]。

研究報(bào)道，富硒酵母在培養(yǎng)過(guò)程中，亞硒酸鈉的添加量、添加時(shí)間、培養(yǎng)基組成等因素對(duì)酵母細(xì)胞的細(xì)胞濃度、富硒量等均有明顯的影響[9]。因此，筆者從實(shí)驗(yàn)室保存的眾多酵母菌株中篩選耐受亞硒酸鈉強(qiáng)的菌株為出發(fā)菌株，研究該菌株在培養(yǎng)過(guò)程中的亞硒酸鈉添加量、添加時(shí)間、酵母菌接種齡、培養(yǎng)溫度等參數(shù)，從而使酵母的生物量及富硒量達(dá)到最優(yōu)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1菌種。釀酒酵母（Sacharomyces cerevisiae）菌株均由徐州工程學(xué)院食品生物工程實(shí)驗(yàn)中心分離保存。

1.1.2培養(yǎng)基。

種子培養(yǎng)基：葡萄糖2.0%，蛋白胨2.0%，酵母膏1.0%。固體培養(yǎng)基添加瓊脂1.5%。

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖4.0%，蛋白胨1.5%，牛肉膏2.0%，硫酸銨0.5%，磷酸氫二鉀1.0%，pH 6.0。

1.1.3儀器與試劑。

儀器：UV-1750紫外分光光度計(jì)，日本島津公司；SIGMA-3k15臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，德國(guó)SIGMA公司；THZ225大容量恒溫振蕩器，太倉(cāng)市華美生化儀器廠。

試劑：亞硒酸鈉、濃硝酸、乙二胺四乙酸二鈉（EDTA-2Na）、甲酸、甲苯、3，3-二氨基聯(lián)苯胺（DAB）、甲酸、氟化鈉、95%乙醇，均為分析純；消化液為濃硝酸∶高氯酸=4∶1（V/V）。

1.2方法

1.2.1硒含量的測(cè)定方法。

1.2.1.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作。

用體積百分比50%鹽酸溶液溶解亞硒酸鈉，至濃度為1 μg/mL，得到標(biāo)準(zhǔn)硒溶液。吸取以上標(biāo)準(zhǔn)硒溶液0、5、10、15、20、25 mL于50 mL燒杯中，加無(wú)菌雙蒸水至35 mL，加入2 mL 0.1 mol/l EDTA-2Na，各加5 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5% 3，3-二氨基聯(lián)苯胺（DAB）溶液，用甲酸調(diào)pH為2.0～3.0，反應(yīng)30 min，再用質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%的NaOH調(diào)節(jié)pH至6.0～7.0，轉(zhuǎn)入分液漏斗，加入10 mL甲苯萃取，分離甲苯部分，紫外分光光度計(jì)于420 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以O(shè)D值為橫坐標(biāo)，硒含量為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.1.2細(xì)胞內(nèi)硒含量的測(cè)定。

準(zhǔn)確稱(chēng)取干燥菌體置于燒杯中，加入消化液，通風(fēng)櫥內(nèi)用電爐緩慢加熱進(jìn)行消化，將消化好的樣品加入35 mL蒸餾水，然后加入2 mL 0.1 mol/l EDTA-2Na，0.2 mL 4%氟化鈉；調(diào)節(jié)pH 2.0～3.0，加入0.5% 3，3-二氨基聯(lián)苯胺2 mL反應(yīng)30 min。NaOH調(diào)pH至6.0～7.0，轉(zhuǎn)入分液漏斗，加入甲苯萃取，用752紫外分光光度計(jì)測(cè)定甲苯部分，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算菌體中有機(jī)硒的含量。

1.2.2生物量的測(cè)定。

將待用離心管編號(hào)，烘干后稱(chēng)重，記錄空管質(zhì)量，然后將培養(yǎng)好的酵母液倒入離心管中，6 000 r/min離心8 min收集菌體，蒸餾水洗滌3次，以除去雜質(zhì)，再于55～60 ℃下烘干至恒重，稱(chēng)重，前后兩次之差即為酵母生物量即。

1.2.3酵母菌的硒耐受性篩選[10]。

接種環(huán)分別從保存的斜面酵母菌株試管挑取一環(huán)菌至酵母菌液體培養(yǎng)基中，于27～30 ℃條件下振蕩培養(yǎng)18 h，然后再次按照10%的接種量，取以上培養(yǎng)的酵母菌液接種至新的酵母菌液體培養(yǎng)基中，相同條件下繼續(xù)活化培養(yǎng)。取活化好的菌液無(wú)菌水稀釋100倍，吸取100 μL，涂布于含亞硒酸鈉濃度分別為20、40、60、80、100 μg/mL的平板上，28 ℃培養(yǎng)48 h后觀察菌落顏色變化，選取在高濃度亞硒酸鈉平板上紅色的酵母菌落作為亞硒酸鈉高耐受菌株。選擇耐受性較強(qiáng)的菌株再進(jìn)行液體發(fā)酵試驗(yàn)，測(cè)定菌體生物量及富硒含量，選取富硒含量最高的菌株作為優(yōu)化目的菌株。

1.2.4不同硒添加量對(duì)富硒效果的影響。

將酵母菌株FX5于種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)至18 h，然后按照10%接種量接種至液體發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)基中培養(yǎng)至20 h，加入亞硒酸鈉，使發(fā)酵液中亞硒酸鈉的質(zhì)量濃度分別為5、10、15、20、25、30、35、40 g/L，30 ℃，180 r/min培養(yǎng)60 h后收集并干燥菌體，測(cè)定菌體的生物量和硒含量，分析不同加硒量對(duì)富硒效果的影響。

1.2.5不同加硒時(shí)間對(duì)酵母含硒量的影響。

設(shè)計(jì)7個(gè)不同加硒時(shí)間，分別在0、2、4、6、8、10、12 h時(shí)加入亞硒酸鈉至終濃度20 g/L，裝液量50 mL/250 mL，30 ℃，180 r/min下恒溫培養(yǎng)，60 h后分析不同加硒時(shí)間對(duì)酵母菌生物量及富硒量的影響。

1.2.6溫度對(duì)硒酵母生物量和含硒量的影響。

設(shè)定發(fā)酵溫度為18、20、22、24、26、28、30、32 ℃下培養(yǎng)60 h，接種量10%，最終硒濃度為20 g/L，裝液量50 mL/250 mL，30 ℃，180 r/min下恒溫培養(yǎng)，60 h后分析培養(yǎng)溫度對(duì)酵母菌生物量及富硒量的影響。

1.2.7培養(yǎng)基初始pH對(duì)硒酵母生物量和含硒量的影響。

將發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH設(shè)置為4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、75、8.0，加入亞硒酸鈉至終濃度20 g/L，裝液量50 mL/250 mL，30 ℃，180 r/min下恒溫培養(yǎng)，60 h后分析初始pH對(duì)酵母菌生物量及富硒量的影響。

1.2.8轉(zhuǎn)速對(duì)硒酵母生物量和含硒量的影響。

分別以100、120、140、160、180、200、220 r/min的轉(zhuǎn)速，加入亞硒酸鈉至終濃度20 g/L，裝液量50 mL/250 mL，30 ℃恒溫培養(yǎng)，60 h后分析初始搖床轉(zhuǎn)速對(duì)酵母菌生物量及富硒量的影響。

1.2.9接種菌齡對(duì)硒酵母生物量和含硒量的影響。

分別接種菌齡為36、48、60、72、84、96、108 h的種子菌，加入亞硒酸鈉至終濃度20 g/L，裝液量50 mL/250 mL，30 ℃、180 r/min恒溫培養(yǎng)，60 h后分析接種菌齡對(duì)酵母菌生物量及富硒量的影響。

2結(jié)果與分析

2.1酵母菌的耐受性及富硒效果比較

采用酵母菌對(duì)亞硒酸鈉的抗性測(cè)定進(jìn)行篩選，測(cè)定了50株酵母菌對(duì)亞硒酸鈉的抗性，結(jié)果表明不同酵母菌株對(duì)亞硒酸鈉的抗性不同。選出對(duì)亞硒酸鈉抗性較高、菌落較大、顏色較淺的酵母菌進(jìn)行純培養(yǎng)，經(jīng)過(guò)多次劃線純化后，得到9株菌株（表1），其中FX5菌株生物量及富硒含量最高，以該菌進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)條件優(yōu)化。

2.2硒添加量對(duì)富硒效果的影響

從圖1可以看出，隨著亞硒酸鈉的增加硒含量逐漸增加，達(dá)20 g/L時(shí)，繼續(xù)增加硒含量反而降低。可能的原因是在沒(méi)有加入硒時(shí)，培養(yǎng)液中硒含量較低，不利于酶的合成，加入適量硒后，促進(jìn)了相關(guān)酶的合成，從而使含硒量提高。但是從圖1中的結(jié)果可以看出，當(dāng)硒濃度超過(guò)20 g/L后，酵母菌中硒含量隨著亞硒酸鈉的添加濃度的增加不再增長(zhǎng)，而是減小，很有可能是當(dāng)硒濃度進(jìn)一步增加時(shí)，抑制了相關(guān)酶的合成。故選取20 g/L為最佳加硒量。

2.3不同加硒時(shí)間對(duì)酵母菌含硒量的影響

由于菌體在不同時(shí)間段內(nèi)其生理狀況不同，所以在不同的時(shí)間段加入硒，菌體的最終含硒量不同。由圖2可見(jiàn)，隨著硒加入時(shí)間的不同，酵母菌含硒量有很大變化。在發(fā)酵培養(yǎng)6 h加入亞硒酸鈉可以明顯減弱環(huán)境對(duì)酵母生長(zhǎng)的抑制，促進(jìn)菌體數(shù)量增加的同時(shí)，更有利于酵母對(duì)無(wú)機(jī)硒最大限度地吸收和轉(zhuǎn)化。故培養(yǎng)6 h是最佳的加硒時(shí)間。

2.4溫度對(duì)硒酵母生物量和含硒量的影響

如圖3所示，在發(fā)酵溫度低于28 ℃時(shí)，隨著發(fā)酵溫度升高菌體生物量逐漸增加。因?yàn)樵诘蜏貤l件下菌體需要合成更多的多不飽和脂肪酸以維持細(xì)胞膜的流動(dòng)性。但在發(fā)酵溫度較高的情況下富硒能力下降明顯。由3圖可知，在28 ℃時(shí)菌體生物量及富硒含量最高。

2.5培養(yǎng)基初始pH對(duì)硒酵母生物量和含硒量的影響

pH是影響微生物生長(zhǎng)和產(chǎn)物合成的非常重要的狀態(tài)參數(shù)，是代謝活動(dòng)的綜合指標(biāo)，培養(yǎng)基初始pH對(duì)菌株生長(zhǎng)和含硒量具有重要影響，環(huán)境pH直接影響著細(xì)胞膜的活性、穩(wěn)定性以及產(chǎn)物代謝酶系的活性，從而間接影響著微生物對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收和酶的分泌。如圖4所示，初始pH 6.0時(shí)，菌株富硒量最高，生物量也最大；pH 4.5～6.0時(shí)，硒含量逐漸增加。綜合考慮，最佳的初始pH為6.0。

2.6轉(zhuǎn)速對(duì)硒酵母生物量和含硒量的影響

調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速是酵母搖瓶發(fā)酵過(guò)程中控制溶解氧的主要方式，而溶解氧對(duì)酵母的生長(zhǎng)和繁殖均有重要作用。由圖5可知，隨著搖瓶轉(zhuǎn)速的提高，溶氧濃度加大，菌體干重和含硒量呈明顯上升趨勢(shì)，當(dāng)搖床轉(zhuǎn)速達(dá)160 r/min，菌體干重和含硒量已達(dá)到最大值；當(dāng)搖床轉(zhuǎn)速大于160 r/min 時(shí)，菌體干重和含硒量呈下降趨勢(shì)。說(shuō)明再增加通氣量會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞呼吸強(qiáng)度加大，細(xì)胞生長(zhǎng)速度過(guò)快而影響含硒量。因此，該試驗(yàn)選擇搖床轉(zhuǎn)速160 r/min。

2.7接種齡對(duì)硒酵母生物量和含硒量的影響

接種菌齡直接決定接入發(fā)酵培養(yǎng)基的菌體活躍度，因此對(duì)菌體生長(zhǎng)有一定影響，進(jìn)而會(huì)影響菌株的生長(zhǎng)和含硒量。該研究中針對(duì)不同接種菌齡對(duì)菌體生長(zhǎng)和富硒的影響進(jìn)行了探索，分析了接種菌齡為36、48、60、172、84、96、108 h時(shí)菌株的發(fā)酵情況，結(jié)果見(jiàn)圖6。隨著接種菌齡的增加，菌體干重和含硒量先增加后減小，接種菌齡為84 h時(shí)，菌體干重和含硒量達(dá)到最高。

以?xún)?yōu)化后的各個(gè)參數(shù)進(jìn)行酵母發(fā)酵培養(yǎng)試驗(yàn)，結(jié)果顯示，酵母菌體干重達(dá)40.1 g/L，含硒量達(dá)1 120 mg/L。

3結(jié)論

釀酒酵母在含有無(wú)機(jī)硒的環(huán)境中培養(yǎng)可以將無(wú)機(jī)硒轉(zhuǎn)化為有機(jī)硒。但是菌株的生長(zhǎng)及有機(jī)硒的轉(zhuǎn)化能力同時(shí)又受到初始硒濃度、接種菌齡、培養(yǎng)溫度等諸多因素的影響。其中培養(yǎng)基中的初始硒濃度對(duì)酵母菌的影響則較大，當(dāng)濃度超過(guò)一定范圍時(shí)，酵母菌的生長(zhǎng)代謝受到強(qiáng)烈的抑制，不利于其對(duì)硒的富集。該研究以實(shí)驗(yàn)室保藏的釀酒酵母為出發(fā)菌株，通過(guò)將活化好的菌株接種于不同濃度的亞硒酸鈉平板上，再通過(guò)進(jìn)一步的液體發(fā)酵復(fù)篩，得到一株生物量及富硒含量較高的菌株FX5。該酵母菌的最適硒濃度為20 μg/mL，酵母將無(wú)機(jī)硒轉(zhuǎn)化為有機(jī)硒的最佳培養(yǎng)條件：初始硒濃度20 μg/mL，接種量10%，裝液量50 mL/250 mL，溫度28 ℃，初始pH 6.0，搖床轉(zhuǎn)速160 r/min，培養(yǎng)60 h。在優(yōu)化后的富硒發(fā)酵條件下進(jìn)行釀酒酵母的發(fā)酵試驗(yàn)，其生物量達(dá)40.1 g/L，富硒量為1 120 mg/L。酵母在此最佳培養(yǎng)條件下有著較高的有機(jī)硒轉(zhuǎn)化率，為發(fā)酵罐放大培養(yǎng)奠定基礎(chǔ)，因此存在廣闊的應(yīng)用前景。

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