王玲玲　陳東亮　黃叢林

摘要SSR分子標(biāo)記是目前應(yīng)用較廣泛的分子標(biāo)記技術(shù)之一。對(duì)SSR標(biāo)記的原理、特點(diǎn)和開(kāi)發(fā)方法進(jìn)行了總結(jié)，綜述了SSR分子標(biāo)記技術(shù)在植物DNA指紋圖譜構(gòu)建、遺傳多樣性分析、種子純度及真?zhèn)舞b定、遺傳圖譜構(gòu)建、分子標(biāo)記輔助育種等方面的應(yīng)用現(xiàn)狀，并對(duì)目前SSR標(biāo)記應(yīng)用中出現(xiàn)的問(wèn)題進(jìn)行了討論，以期為下一步開(kāi)展西藏野生觀賞植物資源的分子研究奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞SSR分子標(biāo)記；開(kāi)發(fā)方法；遺傳多樣性；DNA指紋圖譜

中圖分類號(hào)S188文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼

A文章編號(hào)0517-6611（2017）36-0123-04

AbstractSSR molecular markers are one of the most widely used molecular marker technologies.This paper summarized the principles，characteristics and development methods of SSR markers，and summarized the SSR technique in plant DNA fingerprinting，genetic diversity analysis，seed purity and authenticity identification，genetic map construction，molecular marker assisted breeding and other aspects of the application of the status quo，and the current application of SSR markers were discussed in order to carry out the next step in Tibet wild ornamental plant resources to lay the foundation for molecular research.

Key wordsSSR molecular markers；Development method；Genetic diversity；DNA fingerprints

SSR簡(jiǎn)單重復(fù)序列（Simple Sequence Repeat，SSR），也稱為微衛(wèi)星DNA（Microsatellite DNA），由1～6個(gè)堿基為重復(fù)單位，形成長(zhǎng)達(dá)數(shù)十個(gè)核苷酸的串聯(lián)重復(fù)序列，如（AT）n、（AC）n、（GA）n、（AAG）n、（AAT）n、（CATG）n等。微衛(wèi)星序列廣泛分布于植物基因組中，且SSR序列在不同物種中長(zhǎng)度、重復(fù)單位次數(shù)、突變情況有所不同，在染色體上的分布也存在差異，等位基因的多樣性也由此形成。基于SSR標(biāo)記技術(shù)的共顯性、分布廣、多態(tài)性高、低成本、高效率等優(yōu)點(diǎn)，SSR標(biāo)記已廣泛應(yīng)用于動(dòng)植物群體分析[1]、構(gòu)建DNA指紋圖譜[2-5]、品種鑒定以及輔助育種等多個(gè)方面[4-9]。西藏?fù)碛蟹N類多樣、形態(tài)各異的野生觀賞植物資源，長(zhǎng)期以來(lái)，西藏野生觀賞植物資源研究主要集中于表現(xiàn)型差異比較、培育技術(shù)研究方面，缺乏基于分子層面的深入研究[10]。為進(jìn)一步探明西藏野生觀賞植物多樣性形成的分子機(jī)理，該研究對(duì)SSR標(biāo)記的方法、應(yīng)用進(jìn)行了總結(jié)分析，并對(duì)相關(guān)問(wèn)題進(jìn)行了討論，以期為開(kāi)展西藏野生觀賞植物資源的分子研究奠定基礎(chǔ)。

1SSR標(biāo)記的原理及特點(diǎn)

SSR重復(fù)單位的大小、序列和拷貝數(shù)呈多態(tài)性，但是基因組中某一特定的微衛(wèi)星的側(cè)翼序列保守性較強(qiáng)，因此根據(jù)保守側(cè)翼序列可設(shè)計(jì)特異引物，通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR）技術(shù)擴(kuò)增出SSR DNA序列，再利用不同的電泳方法分離片段，獲得長(zhǎng)度多態(tài)性，即為SSR分子標(biāo)記。

SSR標(biāo)記具有較多優(yōu)點(diǎn)[11-13]：多態(tài)性高，均勻分布于整個(gè)基因組；共顯性遺傳，可有效鑒別雜合個(gè)體；帶型簡(jiǎn)單、易識(shí)別、可自動(dòng)化分析；穩(wěn)定性、重復(fù)性好；操作簡(jiǎn)便，試驗(yàn)周期短；成本較低，對(duì)DNA 質(zhì)量要求低。因此SSR 標(biāo)記在DNA指紋圖譜構(gòu)建、品種鑒定、遺傳分析、分子輔助育種等方面得到廣泛應(yīng)用。

2SSR分子標(biāo)記的開(kāi)發(fā)方法

2.1構(gòu)建文庫(kù)篩選SSR標(biāo)記傳統(tǒng)的開(kāi)發(fā)SSR標(biāo)記方法是構(gòu)建基因組文庫(kù)篩選SSR標(biāo)記，也是公認(rèn)的經(jīng)典方法。這類方法要求提取高質(zhì)量的基因組DNA，對(duì)于基因組很大的物種，全基因組測(cè)序較為困難，可以利用部分基因組序列開(kāi)發(fā)SSR位點(diǎn)[14]。目前也有利用轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)篩選SSR位點(diǎn)的報(bào)道，Luro等[15]基于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)開(kāi)發(fā)了克萊門(mén)柚（Citrus clementina）的 SSR 標(biāo)記，發(fā)現(xiàn)研究中的41個(gè)標(biāo)記通用性都較好，可以用于柑橘屬內(nèi)的其他物種中，既能檢測(cè)柑橘內(nèi)的遺傳多樣性，還可進(jìn)行種間分類研究。鄢秀芹等[16]利用MISA軟件篩選刺梨（Rosa roxburghii）轉(zhuǎn)錄組測(cè)序獲得的106 590條Unigene，共檢測(cè)出21 711個(gè)SSR位點(diǎn)，分布于18 155條Unigene中，出現(xiàn)頻率為20.37%，平均分布距離為1.68 kb。但是傳統(tǒng)的文庫(kù)法需要對(duì)每個(gè)克隆進(jìn)行篩選鑒定，工作量大，費(fèi)用高，效率低，因此在實(shí)際應(yīng)用中又產(chǎn)生了富集技術(shù)。

2.2富集技術(shù)篩選SSR標(biāo)記為提高SSR開(kāi)發(fā)效率、降低成本，提高陽(yáng)性克隆率，人們先用SSR探針雜交技術(shù)來(lái)富集基因DNA片段，然后建立基因組文庫(kù)。季麗靜[17]以芍藥（Paeonia lactiflora）品種Charlies White為材料，利用磁珠富集法構(gòu)建微衛(wèi)星富集文庫(kù)，再經(jīng)過(guò)陽(yáng)性克隆、篩選、測(cè)序，獲取了82個(gè)SSR位點(diǎn)，設(shè)計(jì)引物50對(duì)。李亞慧[18]利用磁珠富集法開(kāi)發(fā)菊花（Chrysanthemum morifolium）微衛(wèi)星位點(diǎn)，最終根據(jù)88個(gè)完整的可用于引物設(shè)計(jì)的微衛(wèi)星序列設(shè)計(jì)了142對(duì)引物。劉路賢[19]利用生物素-磁珠吸附微衛(wèi)星富集法開(kāi)發(fā)了菊花SSR標(biāo)記，用含5個(gè)群體的44個(gè)菊花品種對(duì)8對(duì)引物進(jìn)行檢測(cè)，其中6對(duì)具有多態(tài)性，2對(duì)沒(méi)有多態(tài)性。雖然這種方法提高了篩選SSR的效率，縮短了試驗(yàn)周期，但是操作過(guò)程相對(duì)繁瑣且需要構(gòu)建和篩選基因組文庫(kù)。

2.3基于 PCR 技術(shù)開(kāi)發(fā) SSR 標(biāo)記

Cifarelli等[20]利用隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA（Random Amplified polymoerphic DNA，RAPD）策略將SSR與隨機(jī)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行雜交，在甜菜（Beta vulgaris）、向日葵（Helianthus annuus）、橄欖（Canarium album）等植物中分離出SSR標(biāo)記，但是陽(yáng)性克隆率較低。繼而Lunt等[21]在Cifarelli等的研究基礎(chǔ)上，提出了SSR序列PCR分離技術(shù)——PIMA（PCRbased isolation of microsatellites arrays，PIMA），實(shí)現(xiàn)快速分離基因組中的SSR及其側(cè)翼序列。后來(lái)，F(xiàn)isher 等[22]為增加獲得SSR標(biāo)記的概率，提出了利用 5' 錨定PCR法開(kāi)發(fā)SSR標(biāo)記，該方法對(duì)于缺乏基因組信息的物種來(lái)說(shuō)，是一種開(kāi)發(fā)SSR標(biāo)記簡(jiǎn)便有效的方法。李明芳等[23]利用5' 錨定PCR技術(shù)在荔枝（Litchi chinensis）無(wú)核品種A4號(hào)試驗(yàn)材料中克隆出100個(gè)SSR序列，陽(yáng)性克隆率達(dá)93%，Ai等[24]用此方法從歐洲甜櫻桃（Cerasus avium）中得到24對(duì)SSR引物，且多態(tài)性較好。

2.4利用數(shù)據(jù)庫(kù)信息開(kāi)發(fā)SSR標(biāo)記

近年生物信息技術(shù)發(fā)展迅速，人們可直接利用公共數(shù)據(jù)庫(kù)獲取大量信息，進(jìn)而開(kāi)發(fā)SSR引物。世界上有三大生物信息數(shù)據(jù)庫(kù)，分別是美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心的NCBI（National Center for Biotechnology Information，NCBI）數(shù)據(jù)庫(kù)、歐洲分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室建立的EMBL（Europe Molecular Biology Laboratory）數(shù)據(jù)庫(kù)以及日本DNA數(shù)據(jù)庫(kù)DDBJ（DNA Data Bank of Japan）。為保證數(shù)據(jù)盡可能完全，上述3個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)建立了相互交換數(shù)據(jù)的合作關(guān)系，3個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)均含有豐富資源，通過(guò)相應(yīng)的軟件對(duì)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行搜索可以獲取SSR信息。目前，已有不少植物基本上都可在專門(mén)的DNA數(shù)據(jù)庫(kù)中查找SSR位點(diǎn)，如擬南芥（Arabidopsis thaliana）、水稻（Oryza sativa）、油菜（Brassica rapa var.oleifera）、小麥（Triticum aestivum）、大豆（Glycine max）等。李炎林等[25]利用 Trinity 軟件對(duì)NCBI公共數(shù)據(jù)庫(kù)中公布的南方紅豆杉（Taxus wallichiana var. mairei）根、莖和葉的轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組重新拼接，對(duì)13 737 528條序列組裝得到96 279條Unigene（38 Mb），通過(guò)SSR檢測(cè)程序從96 279條 Unigene 中得到2 160個(gè)SSR位點(diǎn)（2.24%），平均發(fā)生率為1/18.01 kb，基序長(zhǎng)度為14～25 bp。優(yōu)勢(shì)重復(fù)基序?yàn)榱塑账岷腿塑账?，分別占總SSR位點(diǎn)的38.56%和37.08%。張晗等[26]對(duì)從Phytozome數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取的谷子基因組序列進(jìn)行SSR位點(diǎn)搜索，在21 150.78 kb序列中發(fā)現(xiàn)2 872個(gè)SSR位點(diǎn)，平均每7.36 kb就有1個(gè)SSR，共發(fā)現(xiàn)126種重復(fù)基元，其中二堿基和三堿基重復(fù)類型分別占63.41%和31.86%，設(shè)計(jì)的74對(duì)SSR引物中有64對(duì)可以穩(wěn)定擴(kuò)增。

近年，生物技術(shù)飛速發(fā)展，研究者得到的信息越來(lái)越多，并且可以將信息上傳到公共數(shù)據(jù)庫(kù)，也使得數(shù)據(jù)庫(kù)信息不斷豐富，進(jìn)而使更多的研究者從中尋找有效信息，節(jié)省大量時(shí)間和試驗(yàn)成本。總之，生物信息公共數(shù)據(jù)庫(kù)的存在實(shí)現(xiàn)了全世界生物信息資源的有效整合利用。

3SSR分子標(biāo)記在植物研究中的應(yīng)用分析

SSR分子標(biāo)記技術(shù)在植物DNA指紋圖譜構(gòu)建、遺傳分析、種子純度及真?zhèn)舞b定、遺傳圖譜構(gòu)建、分子標(biāo)記輔助育種等方面應(yīng)用廣泛。

3.1基于SSR標(biāo)記構(gòu)建的植物DNA指紋圖譜

DNA 指紋圖譜是指品種間具有差異的、能夠鑒別不同品種的DNA電泳圖譜，個(gè)體間特異性及環(huán)境穩(wěn)定性高，且便于系統(tǒng)管理。SSR分子標(biāo)記是構(gòu)建 DNA 指紋圖譜的首選方法。借助DNA指紋圖譜可以進(jìn)行品種權(quán)保護(hù)、遺傳分析，為育種工作的材料選擇提供科學(xué)參考，為品種的穩(wěn)定性、特異性和一致性（Stability，Distinctness，Uniformity，DUS）鑒定提供技術(shù)支持，可與DUS測(cè)驗(yàn)形態(tài)鑒定完美結(jié)合[23]。

Duca等[27]使用10個(gè)SSR標(biāo)記對(duì)10個(gè)向日葵（Helianthm annum）親代品種進(jìn)行了遺傳多樣性分析，發(fā)現(xiàn)9個(gè)標(biāo)記具有多態(tài)性，利用其中7個(gè)條帶清晰、多態(tài)性高的標(biāo)記建立了所選品種的SSR指紋圖譜。季麗靜[17]對(duì)61個(gè)芍藥品種構(gòu)建了指紋圖譜，可以很好地反映出各品種的特異性，其中出現(xiàn)1～4條帶的情況，這與所用的芍藥新品種倍型豐富有關(guān)，對(duì)倍性確定有一定的參考價(jià)值。范建光等[28]構(gòu)建了788份西瓜品種的指紋圖譜庫(kù)，并形成自動(dòng)化、實(shí)用化、準(zhǔn)確化的數(shù)據(jù)庫(kù)。

玉米品種DNA指紋檢測(cè)平臺(tái)是目前我國(guó)作物中最成熟的檢測(cè)技術(shù)平臺(tái)，在玉米品種管理中應(yīng)用最為廣泛，也使得管理工作有了很大程度的提升。我國(guó)正在進(jìn)行的植物DNA指紋圖譜構(gòu)建研究不少，但在試驗(yàn)技術(shù)的穩(wěn)定性、方法的一致性、數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化、規(guī)范化采集以及數(shù)據(jù)庫(kù)存儲(chǔ)等方面還存在不足。為滿足植物品種鑒定、保護(hù)、分類等工作，加快構(gòu)建DNA指紋數(shù)據(jù)庫(kù)檢測(cè)平臺(tái)、軟件開(kāi)發(fā)、數(shù)據(jù)化、自動(dòng)化的研發(fā)成為亟待解決的問(wèn)題[29-31]。

3.2遺傳多樣性分析

在生物的長(zhǎng)期演化過(guò)程中，基因的多樣性是物種分化和生命進(jìn)化的基礎(chǔ)，產(chǎn)生多樣性的根本原因是遺傳物質(zhì)的改變。隨著生物學(xué)尤其是遺傳學(xué)和分子生物學(xué)的發(fā)展，檢測(cè)遺傳多樣性的方法在不斷提高和完善，目前SSR分子標(biāo)記是進(jìn)行遺傳多樣性分析最有效的方法之一。

黃丹娟[32]利用128個(gè)SSR 標(biāo)記分析了我國(guó)茶樹(shù)（Camellia sinensis）優(yōu)良品種的遺傳多樣性水平，在254個(gè)茶樹(shù)品種中共檢測(cè)到629個(gè)等位變異，可將這些材料成功分類。匡猛等[33]對(duì)我國(guó)棉花（Gossypium cvs.）主栽品種進(jìn)行了遺傳相似性分析，表明了雜交種間的遺傳差異大于常規(guī)種間的遺傳差異，源于同一棉區(qū)的品種在一定程度上親緣關(guān)系相近。段艷鳳等[34]利用SSR標(biāo)記構(gòu)建了我國(guó)2000—2007年審定的88個(gè)馬鈴薯（Solanum tuberosum）品種的指紋圖譜，同時(shí)進(jìn)行的遺傳多樣性分析結(jié)果與供試材料系譜來(lái)源相符，并且同一栽培區(qū)域育成的品種在不同程度上聚在一類。范建光[28]選取788份西瓜種質(zhì)材料進(jìn)行了遺傳多樣性分析，在遺傳距離為0.477處將所有材料分為5類?？傊?，利用SSR標(biāo)記進(jìn)行遺傳距離、聚類分析，可將所研究的材料劃分為不同的類群，為品種演化、類群分析提供參考；根據(jù)類群劃分，選擇育種材料時(shí)就可從大量的資源中快速選擇，加快育種進(jìn)程。

3.3種子純度及真?zhèn)舞b定

我國(guó)是農(nóng)業(yè)種植大國(guó)，種子的真實(shí)性和純度是影響產(chǎn)量、質(zhì)量最重要的因素，也是種子質(zhì)量檢驗(yàn)和新品種鑒定最重要的指標(biāo)，直接影響種子企業(yè)的生存與否。因此，當(dāng)前種子生產(chǎn)經(jīng)營(yíng)企業(yè)及行業(yè)主管部門(mén)需要一套快速、準(zhǔn)確、可靠的檢測(cè)技術(shù)，目前的檢測(cè)方法主要有形態(tài)、生化和 DNA 分子標(biāo)記3個(gè)層次。傳統(tǒng)的形態(tài)鑒定法耗時(shí)耗力，易受外界因素影響，如氣候條件變化、人為主觀判斷的影響；生化法穩(wěn)定性差，且標(biāo)記數(shù)量有限，不能滿足生產(chǎn)和經(jīng)營(yíng)發(fā)展的要求；利用分子標(biāo)記方法，鑒定高效、準(zhǔn)確、數(shù)量多，且不易受環(huán)境、生長(zhǎng)周期、季節(jié)影響，成為種子純度及真?zhèn)舞b定技術(shù)必然的發(fā)展趨勢(shì)[35]。 SSR 標(biāo)記因多態(tài)性豐富、穩(wěn)定性好、易操作等突出優(yōu)點(diǎn)被廣泛用于指紋圖譜構(gòu)建，進(jìn)而進(jìn)行的種子純度及真?zhèn)舞b定具有可靠性。

王鳳格等[31]對(duì)玉米（Zea mays）審定品種雜合率水平進(jìn)行分析，平均品種雜合率達(dá)64%，主要集中在50%～80%（占89%），表明對(duì)大部分玉米審定品種而言，40對(duì)核心引物中均能篩選到20～30個(gè)雙親互補(bǔ)型引物，這對(duì)利用指紋庫(kù)篩選玉米審定品種的純度鑒定引物具有重要價(jià)值，利用雜交種指紋圖譜及其互補(bǔ)帶型，即可簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確鑒別出玉米雜交種的純度及真?zhèn)蝃29]。石星星等[35]利用SSR標(biāo)記對(duì)甘藍(lán)雜交種進(jìn)行真實(shí)性及純度鑒定，結(jié)果與形態(tài)鑒定結(jié)果吻合，2種鑒定方法存在顯著相關(guān)。

3.4遺傳圖譜構(gòu)建及QTL定位

遺傳圖譜即遺傳連鎖圖譜，是基因組研究中的一個(gè)重要組成部分。利用分子標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行遺傳圖譜構(gòu)建和數(shù)量性狀位點(diǎn)（Quantitative Trait Locus，QTL）定位，找到與目標(biāo)性狀緊密連鎖或者共分離的標(biāo)記。近幾年QTL定位應(yīng)用廣泛，在人類基因上與疾病有關(guān)的基因定位甚多，植物QTL研究主要集中在模式植物抗逆性基因的定位，借助標(biāo)記輔助選擇育種材料可以極大地縮短育種周期、提高育種效率[36]。目前已經(jīng)有花生（Arachis hypogaea）、油菜、甜瓜（Cucumis melo）、黃瓜（Cucumis sativus）、大白菜（Brassica pekinensis）、大豆、玉米、棉花、茶樹(shù)、梨（Pyrus cvs.）、橡膠樹(shù)（Hevea brasiliensis）、柴胡（Bupleurum chinense）等基于SSR標(biāo)記構(gòu)建的遺傳圖譜。馬建強(qiáng)[36] 以茶樹(shù)變種間雜交構(gòu)建的F1分離群體，采用SSR標(biāo)記技術(shù)和簡(jiǎn)化基因組測(cè)序技術(shù)（Genotypingbysequencing，GBS），結(jié)合擬測(cè)交策略分別構(gòu)建了雙親遺傳圖譜和雙親整合圖譜，并對(duì)控制茶樹(shù)新梢咖啡堿和可可堿含量以及芽葉形態(tài)等性狀的QTL進(jìn)行了定位分析。Moretzsohn等[37]利用SSR構(gòu)建了花生（Arachis duranensis × stenosperma）遺傳圖譜，此后，洪彥彬等[38]基于 SSR 標(biāo)記構(gòu)建的1張花生栽培種分子遺傳圖譜包含108個(gè)標(biāo)記、涉及20個(gè)連鎖群，今后花生栽培種上新開(kāi)發(fā)的標(biāo)記將可直接用于遺傳圖譜的加密，也可作為花生重要性狀的基因定位和QTL分析的框架。

3.5分子標(biāo)記輔助育種

隨著分子標(biāo)記技術(shù)的快速發(fā)展，與傳統(tǒng)育種技術(shù)相比，分子標(biāo)記輔助選擇育種更準(zhǔn)確、更高效的特點(diǎn)，可使育種周期大大縮減，且成本降低，因此近年來(lái)越來(lái)越受到關(guān)注。這種生物技術(shù)與常規(guī)育種技術(shù)進(jìn)行有機(jī)結(jié)合，將成為孕育植物遺傳育種的又一次技術(shù)突破。馮常輝等[39]利用長(zhǎng)江流域棉花育種重要親本蘇棉12和荊55173（感黃萎?。┡c抗黃萎病資源Sicala V1和中21373配制2套感病×抗病雜交組合（蘇棉12×Sicala V1和荊55173×中21373），在其雜交組合的自交子代群體中挑選與黃萎病抗性相關(guān)的9個(gè)SSR標(biāo)記實(shí)施分子標(biāo)記輔助選擇育種，通過(guò)單標(biāo)記選擇，8個(gè)SSR標(biāo)記的aa與AA 2種基因型個(gè)體間的黃萎病校正病情指數(shù)差異達(dá)到極顯著或者顯著水平。劉紅占[40]利用與抗白粉病基因Pm21共分離的SCAR標(biāo)記和與抗白粉病基因PmAS846緊密連鎖的SSR標(biāo)記，作為抗病性定向選擇分子標(biāo)記，進(jìn)行小麥抗病性鑒定和定向改良研究。

4討論

與其他分子標(biāo)記相比，SSR標(biāo)記數(shù)量豐富、多態(tài)性高、分布于整個(gè)基因組、以孟德?tīng)柗绞竭z傳、呈共顯性的優(yōu)點(diǎn)，在DNA指紋圖譜構(gòu)建、遺傳多樣性分析、品種鑒定等方面顯示出獨(dú)特的優(yōu)越性。

目前分子生物實(shí)驗(yàn)室常見(jiàn)的電泳檢測(cè)方法有瓊脂糖凝膠電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳以及毛細(xì)管電泳，前2種電泳方法分辨率低且數(shù)據(jù)讀取不方便，但是其成本低，可以滿足要求不高的試驗(yàn)需求，例如在前期大量篩選引物時(shí)使用，因此瓊脂糖凝膠電泳和聚丙烯酰胺凝膠電泳成為普遍的電泳方法。在利用SSR標(biāo)記構(gòu)建指紋圖譜及品種鑒定時(shí)，應(yīng)用最多的是熒光毛細(xì)管電泳法，該方法高效、準(zhǔn)確，然而其成本相對(duì)較高，主要表現(xiàn)在熒光引物電泳儀器昂貴、分子量?jī)?nèi)標(biāo)價(jià)格高、熒光引物較普通引物合成成本高。為了降低成本，提高工作效率，科研工作者從試驗(yàn)當(dāng)中總結(jié)經(jīng)驗(yàn)摸索新方法，形成了高通量多重PCR、核心引物組合法、五色熒光多重電泳技術(shù)。趙久然等[29]在玉米DNA指紋研究中，為提高檢測(cè)效率，通過(guò)多重PCR和五色熒光技術(shù)對(duì)每套引物構(gòu)建穩(wěn)定的十重PCR復(fù)合擴(kuò)增體系。在小麥、棉花、水稻等眾多植物SSR標(biāo)記構(gòu)建指紋圖譜及遺傳多樣性研究中均采用引物組合法進(jìn)行電泳，不僅使檢測(cè)效率提高數(shù)倍，也使分子量?jī)?nèi)標(biāo)成本節(jié)省數(shù)倍。

一種基于二代測(cè)序技術(shù)的SSR分型新方法SSRseq，幾乎克服了現(xiàn)存所有檢測(cè)方法的不足，尤其適合對(duì)多SSR位點(diǎn)、超高深度的分型，準(zhǔn)確度高，并且分辨率達(dá)到單堿基水平。因此適合所有二倍體動(dòng)植物及真核微生物的SSR位點(diǎn)分型。另外，還成功對(duì)六倍體植物油茶進(jìn)行了SSR分型。對(duì)于多倍體物種來(lái)說(shuō)，SSRseq可以提供不同等位基因的比例數(shù)據(jù)，從而提高多倍體物種遺傳多樣性分析的準(zhǔn)確度，獲得更加清晰的遺傳結(jié)構(gòu)圖。雖然SSRseq有諸多優(yōu)點(diǎn)，但也有一定的局限性：分型位點(diǎn)數(shù)和樣本量較小時(shí)不合適；必須基于已知的染色體倍數(shù)才能得到不同等位基因間的相互比例。該技術(shù)是否可在其他多倍體、非整倍體植物中應(yīng)用，在遺傳分析、指紋圖譜等分析中的實(shí)用性、適用性均有待進(jìn)一步證實(shí)。

當(dāng)前，國(guó)際植物新品種保護(hù)聯(lián)盟（International Union for the Protection of New Varieties of Plants ，UPOV）認(rèn)為SSR標(biāo)記和SNP技術(shù)（Single Nucleotide Polymorphisms，SNP，單核苷酸多態(tài)性）是構(gòu)建指紋圖譜庫(kù)最適合的2種技術(shù)，目前SSR標(biāo)記技術(shù)最為成熟。與SSR相比，SNP標(biāo)記是第三代分子標(biāo)記，因其在基因組中密度更高、分布更均勻、更易實(shí)現(xiàn)數(shù)據(jù)整合比較、更高通量、可能與功能基因相關(guān)的優(yōu)勢(shì)，在分子遺傳學(xué)、藥物遺傳學(xué)、法醫(yī)學(xué)以及疾病的診斷和治療等方面發(fā)揮了重要作用。近年來(lái)以SNP標(biāo)記為基礎(chǔ)構(gòu)建的Bin圖譜、高通量SNP芯片分型以及以SNP標(biāo)記為基礎(chǔ)進(jìn)行群體進(jìn)化研究等方面的應(yīng)用已有大量的報(bào)道，SNP被視為最具發(fā)展?jié)摿Φ臉?biāo)記技術(shù)。隨著測(cè)序成本不斷降低，SNP數(shù)據(jù)獲得也越來(lái)越便利，例如簡(jiǎn)化基因組測(cè)序技術(shù)GBS，具有低成本、高通量、不依賴參考基因組、高效率的特點(diǎn)[41-42]，使以前人們望而卻步的大樣本全基因組基因分型成為了可能，這對(duì)進(jìn)一步探明種質(zhì)資源的遺傳背景、系統(tǒng)演化具有深遠(yuǎn)意義[43-44]。通過(guò)拼接組裝GBS獲得的短讀序列，可獲得高密度SNP標(biāo)記，并在遺傳連鎖圖譜構(gòu)建[45-47]、遺傳群體分析[48]、全基因組關(guān)聯(lián)分析（GWAS）[49-50]、種質(zhì)鑒定[51]和輔助育種[52]等研究中開(kāi)始大量應(yīng)用?？傮w比較來(lái)說(shuō)，SNP開(kāi)發(fā)成本仍然高于SSR標(biāo)記。在遺傳多樣性、品種鑒定等研究中，一般SSR標(biāo)記即可滿足需求，但是對(duì)于遺傳背景復(fù)雜或者樣品間相似性大的材料則需要SNP技術(shù)進(jìn)行更準(zhǔn)確、深入的研究分析。因此，SNP可作為SSR標(biāo)記的補(bǔ)充數(shù)據(jù)庫(kù)，加以完善。

總而言之，分子標(biāo)記技術(shù)已經(jīng)在植物分類及品種鑒定、種質(zhì)資源親緣關(guān)系及進(jìn)化分析、觀賞性狀輔助選擇、構(gòu)建指紋圖譜等方面得到了應(yīng)用。西藏觀賞植物種類繁多，基于分子標(biāo)記的物種高效鑒定有助于物種保護(hù)和利用等工作的開(kāi)展，從而更好地指導(dǎo)西藏花卉產(chǎn)業(yè)發(fā)展實(shí)踐工作，形成高原生態(tài)安全屏障建設(shè)總規(guī)劃條件下，符合西藏特點(diǎn)的生態(tài)產(chǎn)業(yè)。

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