胡婷婷 吳慧明 陳穎

摘要[目的]評價(jià)氯霉素對水生生物的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)。[方法]以大型溞為研究對象，探討不同濃度氯霉素對大型溞急性和慢性毒性。[結(jié)果]急性毒性試驗(yàn)結(jié)果表明，氯霉素對大型溞的48 h-EC50值為175.846 mg/L，屬于低等毒性。21 d慢性毒性試驗(yàn)中各濃度處理對大型溞生長繁殖相關(guān)指標(biāo)有不同程度的影響，且子代出現(xiàn)了不同程度的畸形現(xiàn)象。[結(jié)論]該研究結(jié)果為氯霉素水生生態(tài)毒性評價(jià)提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞氯霉素；大型溞；慢性毒性

中圖分類號S948文獻(xiàn)標(biāo)識碼A文章編號0517-6611（2017）36-0052-03

Abstract[Objective]In order to evaluate the ecological risk to aquatic organism. [Method]The acute and chronic toxicity of Chloramphenicol under different concertration on Daphnia magna was conducted. [Result]Acute toxicity test indicated that Chloramphenicol had low acute toxicity against Daphnia magna， the 48 h-EC50 was 175.846 mg/L. The 21 d chronic toxicity results showed Chloramphenicol exposure can effect the indices of Daphnia magna growth and reproduction， even malformation. [Conclusion]The study can provide reference for the safety evaluation of Chloramphenicol.

Key wordsChloramphenicol；Daphnia magna；Chronic toxicity

近年來，越來越多的抗生素類藥物用于在醫(yī)療、畜禽和水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)，由于機(jī)體代謝率低，抗生素難以被完全吸收。Kumar等[1]研究發(fā)現(xiàn)，40%～90%的抗生素會以母體或者代謝物的形式隨尿液或糞便排出體外，對生態(tài)環(huán)境產(chǎn)生毒害，最終影響人類健康。環(huán)境中抗生素大多數(shù)會進(jìn)入水環(huán)境，直接對浮游動植物造成毒害[2-3]。目前，相關(guān)研究表明，各國家和地區(qū)地表水、地下水和飲用水的抗生素污染比較普遍[4]。Mellon等[5]在大型養(yǎng)殖場的污水處理池中檢測到紅霉素、羅紅霉素和磺胺甲惡唑。章強(qiáng)等[6]對上海市水環(huán)境中抗生素的種類及其污染水平進(jìn)行調(diào)查，發(fā)現(xiàn)長江口水體中磺胺類和氯霉素類抗生素含量較高。

氯霉素是畜禽業(yè)和水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)上廣泛使用的一種廣譜性抗生素，能抑制多種好氧和厭氧菌感染，會造成再生障礙性貧血、神經(jīng)系統(tǒng)受損和灰嬰綜合征等不良副作用[7-8]。2002年我國農(nóng)業(yè)部正式將氯霉素作為禁藥列出，但水產(chǎn)養(yǎng)殖中違規(guī)添加氯霉素的行為屢不見鮮。徐維海等[9]對珠江廣州河段水體中抗生素含量的檢測數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，枯季和洪季河水中氯霉素的含量分別為54～187和11～266 ng/L，檢出率達(dá)100% 。由此可見，水體環(huán)境中的氯霉素污染不容忽視。目前，其生態(tài)毒理學(xué)方面的研究也越來越多，但主要集中于氯霉素對哺乳動物的毒性研究，對水生生物非靶標(biāo)生物的研究相對較少。大型溞（Daphnia magna）廣泛分布于淡水水域，因?qū)Νh(huán)境變化敏感性高、繁殖周期短和易培養(yǎng)等優(yōu)點(diǎn)在國際毒理學(xué)研究中常作為模式生物，被廣泛應(yīng)用于化學(xué)物質(zhì)的水生生態(tài)毒性研究[10-12]。筆者以大型溞為對象，研究不同濃度氯霉素暴露下的急性毒性和慢性毒性效應(yīng)，旨在為抗生素的毒理學(xué)研究提供參考。

1材料與方法

1.1試劑與儀器

氯霉素原藥（Fluka公司，純度>98%）；單道可調(diào)量程移液器（艾本德股份公司）；SMZ-140體視顯微鏡（麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司）；尼康Eclipse 80i顯微鏡（尼康公司）。

1.2試驗(yàn)生物

大型溞為浙江大學(xué)農(nóng)藥與環(huán)境毒理研究所引種的62 D.M純品系生物株，采用經(jīng)曝氣的M4培養(yǎng)液培養(yǎng)（20±2 ℃，光照∶黑暗為16 h∶8 h），培養(yǎng)密度為每只溞50 mL 培養(yǎng)液，每2 d更換1次培養(yǎng)液，每天喂食小球藻。投餌密度2.0×105～3.0×105個/mL，每天監(jiān)測小球藻密度。

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1急性活動抑制試驗(yàn)。

挑取個體大、懷卵多、游泳能力強(qiáng)的母溞單獨(dú)培養(yǎng)，對產(chǎn)下的幼溞進(jìn)行試驗(yàn)（溞齡小于24 h）。根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，設(shè)置氯霉素濃度為0、30、60、120、240 mg/L，每個濃度20只溞，分成4組，每組5只幼溞，試驗(yàn)期間不對受試溞進(jìn)行投喂，分別于24、48 h后觀察并記錄幼溞的活動抑制情況[13]。

1.3.2慢性繁殖試驗(yàn)。

慢性繁殖試驗(yàn)參照OECD化學(xué)品測試準(zhǔn)則“211”[14]，采用半靜態(tài)法，每隔48 h更換試驗(yàn)溶液，每天投喂新鮮小球藻。根據(jù)急性活性抑制試驗(yàn)結(jié)果設(shè)置4個試驗(yàn)濃度，分別為48 h EC50的1/135、1/45、1/15和1/5（1.304、3.911、11.730、35.200 mg/L），另設(shè)空白對照組（CK）。在100 mL加蓋燒杯中加入50 mL溶液，1只幼溞，每個處理組20只幼溞。試驗(yàn)期內(nèi)每隔24 h觀察1次，新生的幼溞及時取出，并記錄母溞的第1次產(chǎn)溞時間、第1次產(chǎn)溞數(shù)，計(jì)算整個試驗(yàn)期間的產(chǎn)溞次數(shù)、總產(chǎn)溞數(shù)、蛻殼次數(shù)、胎數(shù)、觀察后代畸形和死亡率，并于21 d在體視鏡下測量體長。采用Lotka方程∑lxmxe-rx=1計(jì)算內(nèi)稟增長力（rm），其中l(wèi)x為第x 天每只溞的存活率，mx為每只母溞在第x天的產(chǎn)溞數(shù)。

1.4數(shù)據(jù)處理

運(yùn)用SPSS 19.0數(shù)據(jù)處理軟件中Probit模塊求得大型溞48 h-EC50，采用Scheffe檢驗(yàn)法比較對照組與試驗(yàn)組間各指標(biāo)的差異。

2結(jié)果與分析

2.1急性活動抑制試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)急性毒性的試驗(yàn)結(jié)果，用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件求得氯霉素對大型溞48 h-EC50為175.846 mg/L，95%置信區(qū)間為148.607 6～251.923 0 mg/L，劑量-效應(yīng)方程為 y=7.254 3x-11.286 8（相關(guān)系數(shù)r=0.871 8）。Wolleenberger等[15]研究報(bào)道，土霉素48 h-EC50 約為1 000 mg/L，四環(huán)素對大型溞的48 h-EC50值為617.2 mg/L，金霉素對大型溞48 h-EC50值為137.6 mg/L[16]。由此可見，不同抗生素對生物的毒性差異很大。根據(jù)國家環(huán)保局的新化學(xué)物質(zhì)危害評估準(zhǔn)則[17]中的危害分級標(biāo)準(zhǔn)，確定氯霉素對大型溞低毒。

2.2慢性繁殖試驗(yàn)

2.2.1

不同濃度氯霉素暴露下大型溞初次產(chǎn)卵時間和初次產(chǎn)卵數(shù)。

由表1可知，F(xiàn)0代及F1代恢復(fù)條件下的大型溞的初次產(chǎn)溞時間受氯霉素影響不明顯。F1代11.730 mg/L濃度組染毒條件下第1次產(chǎn)溞時間顯著（P<0.05）短于CK。氯霉素暴露下大型溞F0代、F1代染毒以及F1代恢復(fù)條件下第1次產(chǎn)溞數(shù)與CK差異不顯著。

2.2.2不同濃度氯霉素暴露下大型溞產(chǎn)溞數(shù)和產(chǎn)胎數(shù)。

由表2可知，氯霉素對F0代、F1代染毒以及F1代恢復(fù)條件下的大型溞產(chǎn)幼溞數(shù)均有影響。3.911 mg/L暴露條件下F0代產(chǎn)溞數(shù)顯著（P<0.05）高于CK，而其他濃度均未表現(xiàn)出顯著差異（P>0.05）。各處理F1代產(chǎn)溞數(shù)明顯低于F0代相應(yīng)濃度的產(chǎn)幼溞數(shù)。F1代染毒試驗(yàn)中，除1.304 mg/L濃度處理外，其余濃度處理的產(chǎn)溞數(shù)均顯著低于CK（P<0.05）。在F1代恢復(fù)試驗(yàn)中，所有濃度處理的產(chǎn)幼溞數(shù)均顯著低于CK（P<0.05）。

21 d的暴露試驗(yàn)，F(xiàn)0代CK的產(chǎn)胎數(shù)平均為7.87代，各染毒組與CK相比無顯著差異（P>0.05），而F1代產(chǎn)胎數(shù)均少于F0代相應(yīng)濃度處理的產(chǎn)胎數(shù)。F1代恢復(fù)條件下大型溞的產(chǎn)胎數(shù)與CK相比均無顯著差異（P>0.05）。F1代染毒條件下11.730 mg/L濃度處理的產(chǎn)胎數(shù)最多。

2.2.3不同濃度氯霉素暴露下大型溞21 d體長和蛻皮次數(shù)。由表3可知，

低濃度暴露下F0代體長大于CK，F(xiàn)1代染毒組體長與CK比較，無顯著差異（P>0.05）。F1代恢復(fù)條件下，高于3.911mg/L濃度后體長與CK相比顯著減小（P<0.05）。F1代染毒組體長與F1代恢復(fù)組相比有所增加。不同濃度氯霉素處理的F0代和F1代大型溞的蛻殼次數(shù)差異不顯著（P>0.05）。

2.2.4不同濃度氯霉素暴露下大型溞的死亡率和內(nèi)稟增長力。由表4可知，

染毒條件下F0代在21 d內(nèi)均未死亡，但F1代的染毒和恢復(fù)試驗(yàn)中均出現(xiàn)了個體死亡，即11.730和35.200 mg/L氯霉素暴露條件下F1代染毒組大型溞分別出現(xiàn)了5%和10%的死亡率，而F1代恢復(fù)組中1.304 mg/L濃度組出現(xiàn)了10%的死亡率。由此推斷，氯霉素染毒后產(chǎn)生的F1代溞對環(huán)境的適應(yīng)力有所下降。

內(nèi)稟增長力可反映種群增長的瞬時速率。根據(jù)表4中大型溞在不同濃度氯霉素暴露下F0代、F1代染毒及F1代恢復(fù)試驗(yàn)中的死亡率，采用Lotka方法可計(jì)算得到不同處理大型溞的內(nèi)稟增長率。由表4可知，氯霉素染毒對F0代大型溞的內(nèi)稟增長影響不大。與CK相比，氯霉素染毒可降低F1代大型溞的內(nèi)稟增長力，且存在一定的劑量效應(yīng)關(guān)系。染毒條件下氯霉素對F1代大型溞的抑制作用隨著氯霉素濃度的升高而增強(qiáng)。由此可見，長期的氯霉素暴露會對大型溞種群的繁衍產(chǎn)生不同程度的影響。

2.2.5不同濃度氯霉素暴露下大型溞的后代畸形類型。由表5可知，

F0代僅在高濃度（35.200 mg/L）暴露下觀察到畸形的現(xiàn)象，如觸角不完整或發(fā)育不完全及完全流產(chǎn)。低濃度（3.911 mg/L）暴露下的大型溞僅在F1代出現(xiàn)完全流產(chǎn)現(xiàn)象，而F0和F1代恢復(fù)均未發(fā)現(xiàn)異常。劉曦薇等[18]通過研究氯霉素對斑馬魚早期發(fā)育的毒性，發(fā)現(xiàn)氯霉素對斑馬魚胚胎的自主運(yùn)動、心跳及孵化能力均會產(chǎn)生不利影響，且胚胎和仔魚在氯霉素暴露條件下均表現(xiàn)了明顯的畸形特征；劉臻等[19]研究了3種抗生素對熱帶爪蟾胚胎發(fā)育的毒性，發(fā)現(xiàn)氯霉素可抑制熱帶爪蟾的生長及導(dǎo)致胚胎產(chǎn)生圍心腔水腫。

3結(jié)論

（1）綜上所述，氯霉素暴露下F0代大型溞未發(fā)現(xiàn)致死現(xiàn)象，但F1代大型溞出現(xiàn)死亡。而對于F1代恢復(fù)試驗(yàn)，盡管大型溞在無毒培養(yǎng)基中進(jìn)行恢復(fù)，也觀察到大型溞死亡的現(xiàn)象，且在恢復(fù)條件下1.304 mg/L最低濃度組的死亡率甚至與染毒條件下的35.200 mg/L最高濃度組相同，表明F0代大型溞暴露于不同濃度氯霉素后，會對F1代大型溞的行為造成不同影響。氯霉素暴露雖然對F0大型溞的首次產(chǎn)溞時間、首次產(chǎn)溞數(shù)、產(chǎn)胎數(shù)和蛻殼數(shù)影響不顯著，但能影響F0代大型溞的體長。F1代染毒和恢復(fù)試驗(yàn)中均出現(xiàn)個體死亡，說明氯霉素染毒后產(chǎn)生的F1代溞對環(huán)境的適應(yīng)力有所下降。此外，氯霉素暴露可顯著減少F1代染毒和恢復(fù)條件下母溞產(chǎn)溞數(shù)量，一定濃度的氯霉素可影響F1代生長。綜上所述，氯霉素不僅會影響F0代大型溞的正常繁殖和生長，還會影響F1代的溞生長和繁殖，導(dǎo)致F1代溞對氯霉素更為敏感。

（2）根據(jù)毒性分級標(biāo)準(zhǔn)，氯霉素對大型溞屬于低毒，但慢性毒性試驗(yàn)中，雖然各處理母溞無死亡現(xiàn)象，但是母溞在產(chǎn)溞過程中，幾個處理均有幼溞死亡或畸形現(xiàn)象，故可推測氯霉素長期暴露會對大型溞產(chǎn)生不可逆的傷害。

（3）在自然環(huán)境中，大型溞是魚類和大型無脊椎動物的餌料，以浮游植物為食，在水生態(tài)系統(tǒng)起著重要作用，而污染物在高營養(yǎng)級生物體內(nèi)會隨食物鏈的富集而濃度升高，這會對處在食物鏈最高等級的人類健康將會構(gòu)成威脅。因此，要全面評價(jià)氯霉素對水生態(tài)系的安全，還必須結(jié)合其對食物鏈中不同等級生物的生態(tài)毒性進(jìn)行綜合評價(jià)。

參考文獻(xiàn)

[1] KUMAR K，GUPTA SC，BAIDOO S K，et al.Antibiotic uptake by plants from soil fertilized with animal manure [J].Journal of environmental quality，2005，34（6）：2082-2085.

[2] 徐永剛，宇萬太，馬強(qiáng)，等.環(huán)境中抗生素及其生態(tài)毒性效應(yīng)研究進(jìn)展 [J].生態(tài)毒理學(xué)報(bào)，2015，10（3）：11-27.

[3] MARTNEZ J L.Antibiotics and antibiotic resistance genes in natural environments[J].Science，2008，321（5887）：365-367.

[4] KMMERER K.Antibiotics in the aquatic environment：A review.Part I[J].Chemosphere，2009，75（4）：417-434.

[5] MELLON M，BENBROOK K L.Hogging it：Estimates of antimicrobial abuse in livestock [M].Washington DC：Union of Concerned Scientists Publications，2001：7-9.

[6] 章強(qiáng)，辛琦，朱靜敏，等.中國主要水域抗生素污染現(xiàn)狀及其生態(tài)環(huán)境效應(yīng)研究進(jìn)展[J].環(huán)境化學(xué)，2014，33（7）：1075-1083.

[7] SAMUELSEN O B，LUNESTAD B T，HUSEVAG B，et al.Residues of oxolinic acid in wild fauna following medication in fish farms[J].Diseases of aquatic organisms，1992，12（2）：111-119.

[8] ROBBANABARNAT S，DECLOTRE F，F(xiàn)RAYSSINET C，et al.Use of human lymphoblastoid cells to detect the toxic effect of chloramphenicol and metabolites possibly involved in aplastic anemia in man[J].Drug & chemical toxicology，1997，20（3）：239-253.

[9] 徐維海，張干，鄒世春，等.香港維多利亞港和珠江廣州河段水體中抗生素的含量特征及其季節(jié)變化[J].環(huán)境科學(xué)，2006，27（12）：2458-2462.

[10] ISO.Water quality.Water quality.Determination of the inhibition mobility of Daphnia magna Strus（Cladocera，Crustacea）：ISO 6341—1982[S].Geneva，Switzerland：International Organization for Standardization，1982.

[11] YIM J H，KIM K W，KIM S D.Effect of hardness on acute toxicity of metal mixtures using Daphnia magna：Prediction of acid mine drainage toxicity[J].Journal of hazardous materials，2006，138（1）：16-21.

[12] YOKOTA K，STERNER R W.Tradeoffs limiting the evolution of coloniality：Ecological displacement rates used to measure small costs[J].Proceedings of the royal society B：Biological sciences，2011，278（1704）：458-463.

[13] Organisation for Economic Cooperation and Development.Method 202 guideline for testing of chemicals，Daphnia sp.acute immobilisation test[S].Paris：Environment Health and Safety Publications，2004.

[14] Organisation for Economic Cooperation and Development.Method 211 guideline for testing of chemicals，Daphnia magna reproduction test[S].Paris：Environment Health and Safety Publications，2004.

[15] WOLLENBERGER L，HALLINGSRENSEN B，KUSK K O.Acute and chronic toxicity of veterinary antibiotics to Daphnia magna[J].Chemosphere，2000，40（7）：723-730.

[16] 王慧珠，羅義，徐文青，等.四環(huán)素和金霉素對水生生物的生態(tài)毒性效應(yīng)[J].農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào)，2008，27（4）：1536-1539.

[17] 國家環(huán)保局.新化學(xué)物質(zhì)危害評估準(zhǔn)則[M].北京：中國環(huán)境科學(xué)出版社，1996.

[18] 劉曦薇，吳玲玲.氯霉素對斑馬魚早期發(fā)育的毒性效應(yīng)[J].環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào)，2010，30（8）：1649-1657.

[19] 劉臻，施華宏，黃宏，等.3種抗生素對熱帶爪蟾胚胎發(fā)育的毒性影響[J].安全與環(huán)境學(xué)報(bào)，2011，11（5）：1-6.