倪曉霞，鄭紹忠

解放軍第一七五醫(yī)院藥劑科，福建漳州 363000

氯霉素滴眼液是一種臨場(chǎng)常用的廣譜抗生素類眼用制劑，其主要成分氯霉素易水解，產(chǎn)生1-（4-硝基苯基）-2-氨基-1，3-丙二醇（簡(jiǎn)稱氯霉素二醇物），致使抗菌活性降低。2010年版《中國(guó)藥典》采用HPLC法測(cè)定氯霉素含量，但方法復(fù)雜，重現(xiàn)性不理想。筆者根據(jù)文獻(xiàn)[1-3]，采用RP-HPLC法測(cè)定氯霉素滴眼液中氯霉素的含量并檢查氯霉素二醇物雜質(zhì)的限量，操作簡(jiǎn)便，重現(xiàn)性好，結(jié)果準(zhǔn)確。

1 儀器與試藥

Agilent 1200 Series高效液相色譜儀；分析天平BT214S（德國(guó)賽多利斯公司）；實(shí)驗(yàn)室超純水系統(tǒng)U-S15；超聲波清洗機(jī)（北京天鵬新技術(shù)有限公司）；乙腈（HPLC/spectro，TEDIA COMPANY，批號(hào)：909910）；氯霉素對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品鑒定所提供，批號(hào)：130555-200602）；氯霉素二醇物（中國(guó)藥品生物制品鑒定所提供，批號(hào)：130436-200704）；氯霉素滴眼液（本院制劑室配制）；其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

Eclipse XDB-C18柱（5 μm，4.6 mm×150 mm）；流動(dòng)相為乙腈-水-冰醋酸（40.0∶60.0∶0.5）[1]；流速為 1.0 ml/min；柱溫為30℃；進(jìn)樣量為 10 μl；檢測(cè)波長(zhǎng)為 272 nm。

2.2 溶液的配制

2.2.1 氯霉素對(duì)照品溶液配制 精密稱取氯霉素對(duì)照品54.8 mg，置100 ml容量瓶中，加流動(dòng)相定容、搖勻，即得濃度為548.0 μg/ml的氯霉素對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密量取儲(chǔ)備液5.0 ml，流動(dòng)相稀釋至50.0 ml，即得濃度為54.8 μg/ml的氯霉素對(duì)照液。

2.2.2 氯霉素二醇物對(duì)照品溶液配制 精密稱取氯霉素二醇物對(duì)照品3.9 mg，置100 ml容量瓶中，加流動(dòng)相定容、搖勻，即得濃度為39.0 μg/ml的氯霉素二醇物對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密量取儲(chǔ)備液1.0 ml，加流動(dòng)相稀釋至10.0 ml，即得濃度為3.90 μg/ml的氯霉素二醇物對(duì)照液。

2.2.3 樣品供試液配制 精密量取樣品溶液5.0 ml，置250 ml容量瓶中，加流動(dòng)相定容，搖勻，即得。

2.3 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)

在上述色譜條件下，取混合對(duì)照液（分別精密量取氯霉素對(duì)照品儲(chǔ)備液1.0 ml與氯霉素二醇物儲(chǔ)備液5.0 ml，置于潔凈的10 ml容量瓶中，混勻，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，為對(duì)照品混合液）、氯霉素對(duì)照液、氯霉素二醇物對(duì)照液、樣品溶液分別進(jìn)樣10 μl，記錄色譜圖。結(jié)果表明，氯霉素與氯霉素二醇物的保留時(shí)間分別為：2.48 min、1.16 min；理論塔板數(shù)分別為7655、3353；分離度為11.015。見圖1。

圖1 氯霉素滴眼液高效液相色譜圖

2.4 線性關(guān)系考察

精密量取氯霉素儲(chǔ)備液 0.5、1.0、2.0、2.5、3.5、4.0、5.0 ml置25 ml容量瓶中；精密量取氯霉素二醇物儲(chǔ)備液0.5、1.0、3.0、5.0、6.0、8.0、10.0 ml置 10 ml容量瓶中，分別加流動(dòng)相定容，搖勻。按上述色譜條件分別進(jìn)樣，記錄色譜圖。以對(duì)照品質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)，峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，結(jié)果得氯霉素的線性回歸方程為 Y＝15.34X－4.35（r＝0.9999）；氯霉素二醇物的線性回歸方程為 Y＝24.25X－5.03（r＝0.9995）。提示氯霉素的質(zhì)量濃度在10.96～109.60 μg/ml范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好；氯霉素二醇物的的質(zhì)量濃度在1.95～39.00 μg/ml范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好，方法可行。

2.5 精密度試驗(yàn)

分別取氯霉素及其氯霉素二醇物對(duì)照品液，按上述色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖。結(jié)果得氯霉素峰面積RSD為0.055%；氯霉素二醇物峰面積RSD為0.058%。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批號(hào)（批號(hào)：101024）的樣品 1 份，按“2.2.3”項(xiàng)下樣品供試液的制備方法制備供試品溶液，按色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖。結(jié)果得氯霉素峰面積RSD為0.045%；氯霉素二醇物峰面積RSD為0.038%。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一批號(hào)（批號(hào)：101024）樣品的供試品溶液，分別于0、1、4、8、12、24 h 時(shí)，按色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖。 結(jié)果得氯霉素峰面積RSD為0.36%（n=6）；氯霉素二醇物峰面積RSD為0.42%（n=6）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明樣品的穩(wěn)定性良好。

2.8 回收率試驗(yàn)

2.8.1 氯霉素回收率試驗(yàn) 精密量取氯霉素滴眼液 （批號(hào)：101024；氯霉素含量：99.86%）1.0 ml，共 9 份，分別置 100 ml容量瓶中，精密加入低、中、高不同量的氯霉素對(duì)照品，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，按上述色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖。見表1。

表1 氯霉素加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.8.2 氯霉素二醇物回收率試驗(yàn) 于潔凈10 ml容量瓶中，精密加入低、中、高不同量的氯霉素二醇物對(duì)照品，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，按上述色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖。見表2。

2.9 氯霉素含量測(cè)定

取 3 批次氯霉素滴眼液（批號(hào)：101024、110212、110308），分別精密量取5.0 ml，置250 ml容量瓶中，加流動(dòng)相定容，搖勻，按上述色譜條件分別進(jìn)樣，記錄色譜圖，按外標(biāo)法計(jì)算含量。見表3。

表2 氯霉素二醇物加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

表3 氯霉素含量測(cè)定與氯霉素二醇物檢查結(jié)果（%）

2.10 氯霉素二醇物檢查

按上述色譜條件進(jìn)樣10 μl 氯霉素二醇物對(duì)照液，調(diào)節(jié)檢測(cè)靈敏度，使氯霉素二醇物峰的峰高約為滿量程的64%；取 3 批次氯霉素滴眼液（批號(hào)：101024、110212、110308）的樣品供試液與氯霉素二醇物對(duì)照液，按上述色譜條件依次進(jìn)樣，記錄色譜圖，供試品溶液中氯霉素二醇物的峰面積應(yīng)不得大對(duì)照品溶液的主峰面積（規(guī)定<8.0%）。見表3。

3 討論

光譜圖提示：氯霉素滴眼液中氯霉素在278、272 nm處均有強(qiáng)吸收，氯霉素二醇物在272 nm有最大吸收，本院處方中未添加羥苯乙酯，不存在干擾吸收，故選用272 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。筆者曾比較在本實(shí)驗(yàn)室條件下以下幾種流動(dòng)相的分離效果：乙腈-水-冰醋酸（40.0∶60.0∶0.5）、0.01 mol/L 庚烷磺酸鈉緩沖溶液-甲醇梯度洗脫[4]、甲醇-水-10%四丁基氫氧化銨溶液（350∶635∶15）、水-甲醇-冰醋酸（55.0∶45.0∶0.1），結(jié)果以乙腈-水-冰醋酸（40.0∶60.0∶0.5）為流動(dòng)相時(shí)，氯霉素與氯霉素二醇物有較好的分離度、精密度、重現(xiàn)性和線性回歸，故采用乙腈-水-冰醋酸（40.0∶60.0∶0.5）為流動(dòng)相。

[1]謝楠,何曉英,張曉明,等.HPLC測(cè)定氯霉素滴眼液中氯霉素及氯霉素二醇物的含量[J].華西藥學(xué)雜志,2006,21(1):93-95.

[2]張雁,孫映求,王蘭.RP-HPLC法測(cè)定氯霉素滴眼液中氯霉素及氯霉素二醇物的含量[J].中國(guó)藥品標(biāo)準(zhǔn),2005,6(2):11-13.

[3]易文琳.反相高效液相色譜法測(cè)定氯霉素滴眼液中氯霉素及有關(guān)物質(zhì)的含量[J].中國(guó)藥業(yè),2007,16(17):25-26.

[4]國(guó)家藥典委員會(huì).中國(guó)藥典[M].二部.北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社,2010:1031-1032.