陳 田, 周 佳, 汪依萍, 耿寧雨, 屈建航, 趙 帥, 谷 燮

(河南工業(yè)大學生物工程學院, 鄭州 450000)

氯霉素是一種具有旋光活性的酰胺醇類廣譜抗生素,可以有效抑制革蘭氏陽性菌和陰性菌[1],因其抗菌能力高效和價格低廉等特點而被廣泛用于家禽和牲畜的疾病預防和治療等[2]。但是,殘留的氯霉素會隨著畜禽糞便的排放進入環(huán)境中,對人體的造血系統(tǒng)和消化系統(tǒng)造成嚴重的毒性反應[3],具有潛在的致癌性和遺傳毒性[4],威脅人類健康?？股貜U水的無效處理導致抗生素抗性細菌的增殖和抗生素抗性基因的傳播,威脅人類健康和生態(tài)安全[5]。因此,如何處理環(huán)境中殘留的氯霉素,已成為當下亟待解決的環(huán)境問題之一[6]。目前,國內(nèi)外主要采用物理法和化學法,如萃取法、氧化法、還原法等去除水體中的氯霉素[7-9],但采用單一的物理或化學法難以將性質(zhì)穩(wěn)定的氯霉素完全去除。生物法對環(huán)境的干擾較少,具有高效、運行成本低、環(huán)境友好等優(yōu)勢,是一種具有廣闊應用前景的氯霉素降解方法[10]。

生物法主要利用微生物的代謝活動降解氯霉素,因此,高效氯霉素降解菌的獲得成了關(guān)鍵[11]。趙夢君[12]從安徽某制藥廠排水口污泥中分離篩選到一株氯霉素高效降解菌株LMS-CY,能以氯霉素為唯一碳源生長,且其降解氯霉素的速率與菌體接種量呈正相關(guān)。史可等[13]從長期受抗生素毒性選擇的活性污泥中分離培養(yǎng)了一株氯霉素高效降解細菌CAP-2,24 h后對50 mg/L氯霉素降解率為36.3%。這些菌株為生物降解氯霉素提供了必要的前提條件,但是目前關(guān)于氯霉素降解的菌株資源仍十分稀缺[14]。因此,本研究從處理氯霉素廢水的生物接觸氧化反應器內(nèi)活性污泥中篩選到1株氯霉素降解菌CC18,對該菌株的生理生化特征、系統(tǒng)發(fā)育類型、生長與降解特性進行研究,以期為生物降解氯霉素提供微生物資源。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來源

處理氯霉素廢水的生物接觸氧化反應器內(nèi)的活性污泥。

1.1.2 培養(yǎng)基

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基:牛肉膏3 g/L,蛋白胨5 g/L,NaCl 2.5 g/L,瓊脂7.5 g/L,H2O 1 L,pH值為7.0,121 ℃滅菌20 min。

氯霉素培養(yǎng)基:氯霉素10 mg/L(根據(jù)具體試驗調(diào)整),無水乙酸鈉1.154 g/L,葡萄糖0.281 g/L,NH4Cl 0.229 g/L,K2HPO40.067 g/L,MgSO4·7H2O 0.049 g/L,CaCl20.023 g/L,1 mL/L微量元素(0.03 g/L CuSO4·5H2O,1.5 g/L FeCl3·6H2O,0.03 g/L KI,0.15 g/L H3BO3,0.12 g/L MnCl4·H2O,0.12 g/L ZnSO4·7H2O,0.06 g/L NaMoO4·2H2O,0.15 g/L CoCl2·6H2O),H2O 1 L,pH值為7.5,115 ℃滅菌20 min。

1.1.3 儀器

島津LC-2030C-1260型高效液相色譜儀;INSPECT S50型掃描電鏡(美國FEI)。

1.2 方法

1.2.1 CC18的分離與篩選

稱取1 g活性污泥于9 mL的無菌水中,依次梯度稀釋成10-1～10-9的菌懸液。分別吸取不同濃度的菌懸液0.2 mL涂布于牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基上(每組3個平行),在28 ℃條件下培養(yǎng)2～3 d。觀察菌落的生長情況,菌落大小合適時利用三區(qū)劃線法進行純化,直至出現(xiàn)單菌落,命名為CC18。

1.2.2 CC18的鑒定

使用堿裂解法提取CC18的DNA,采用細菌通用引物27F/1492R進行PCR擴增。PCR擴增反應體系25 μL:模版 DNA 1.5 μL,通用引物 27F 和 1429R各 0.5 μL,2×TaqMaster Mix 12.5 μL,ddH2O 10 μL。PCR反應條件:94 ℃預變性 3 min;94 ℃變性45 s,58 ℃退火45 s,72 ℃延伸2 min,共30個循環(huán);最后72 ℃再延伸10 min。將PCR產(chǎn)物送至生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序,并在NCBI與已有序列進行 Blast 比對,選取相似度高的序列,利用MEGA 11軟件構(gòu)建CC18系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.3 CC18的生理生化特性

分別采用革蘭氏染色試驗、氧化酶試驗、淀粉水解試驗、甲基紅試驗、熒光色素試驗、耐鹽性試驗、硝酸鹽還原試驗分析菌株CC18主要的生理生化特征[12],并進行掃描電鏡[15]觀察。

1.2.4 CC18的生長曲線

將新鮮的CC18接種至100 mL牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中,置于28 ℃、150 r/min的恒溫搖床培養(yǎng),每隔4 h測量一次OD600值。

1.2.5 CC18的生長與降解特性

挑取適量新鮮CC18菌落接種于牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中,置于28 ℃、150 r/min的恒溫搖床培養(yǎng)24 h,使用無菌水將其OD600值調(diào)整至1,接入到氯霉素培養(yǎng)基中,置于28 ℃、150 r/min的恒溫搖床中振蕩培養(yǎng)。分別以氯霉素質(zhì)量濃度(10、20、30、40、50 mg/L)、接種量(2%、4%、6%、8%、10%)、氯霉素培養(yǎng)基的pH值(5、6、7、8、9)、培養(yǎng)溫度(22、28、32、37 ℃)為研究對象,考察其對CC18降解氯霉素的影響。每個處理組設3個重復樣,并設空白對照。培養(yǎng)24 h后取樣,以8 000 r/min轉(zhuǎn)速離心10 min后,用0.22 μm的濾膜抽濾兩次,利用高效液相色譜法測定上清液中的氯霉素濃度。

1.2.6 高效液相色譜法測定氯霉素含量

用高效液相色譜儀測定氯霉素濃度,色譜柱為Agilent ZORBAX SB-C18(150 mm×4.6 mm,5 μm),流動相為甲醇∶水=65∶35,流速1 mL/min,采用等梯度洗脫,柱溫為30 ℃,進樣量為10 μL,紫外檢測器檢測波長為278 nm。

1.2.7 響應面法驗證多因素作用下降解菌CC18的最佳降解條件

根據(jù)上述試驗的結(jié)果,利用SPSS軟件對上述4個因素進行顯著性分析,選取對CC18降解氯霉素影響最顯著的3個因素,以氯霉素降解率為響應值,應用Design-Expert 12軟件進行分析,利用Box-Behnken設計3因素3水平試驗,如表1。

表1 因素與水平表Table 1 Factor and level table

2 結(jié)果與分析

2.1 CC18的形態(tài)特征和生理生化特性

從處理氯霉素廢水的生物接觸氧化反應器內(nèi)活性污泥中分離篩選到的降解菌CC18的菌落呈圓形,淺黃色,邊緣整齊,中部凸起,較濕潤,半透明,易挑取,其菌體呈桿狀(圖1)。CC18為革蘭氏陰性菌,氧化酶試驗陽性,接觸酶試驗陽性,甲基紅試驗陰性,淀粉水解試驗陰性,熒光色素試驗陰性,可耐受5%的NaCl,硝酸鹽還原試驗陽性。

圖1 CC18菌體形態(tài)電鏡圖Figure 1 Electronmicrograph of strain CC18

2.2 CC18的系統(tǒng)發(fā)育分析

經(jīng)PCR擴增后,CC18的序列長度為1 445 bp,在NCBI中進行Blast比對,菌株CC18與墨西哥假黃單胞菌Pseudoxanthomonasmexicana(AF273082)的同源性最高,為99.79%(圖2)。結(jié)合其形態(tài)觀察和生理生化鑒定結(jié)果,參考《伯杰氏細菌鑒定手冊》,初步鑒定菌株CC18為墨西哥假黃單胞菌。

2.3 CC18的生長和降解特性

CC18的生長曲線如圖3所示,該菌在牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中生長約12 h后進入對數(shù)生長期,約52 h后到達穩(wěn)定期,約72 h后進入衰退期。

圖3 CC18生長曲線Figure 3 Growth curve of CC18

2.3.1 氯霉素質(zhì)量濃度對氯霉素降解率的影響

圖4為CC18在不同氯霉素質(zhì)量濃度下的降解率和生長情況,當氯霉素質(zhì)量濃度為20 mg/L時,其降解效果最佳,為9.2%。當氯霉素質(zhì)量濃度在10～20 mg/L時,該菌生長情況較好。因此,CC18生長和降解氯霉素的最佳質(zhì)量濃度為20 mg/L。

圖4 不同氯霉素質(zhì)量濃度下CC18對氯霉素的降解效果(a)和生長情況(b)Figure 4 Effect of different chloramphenicol mass concentrations on the degradation efficiency (a) and growth (b) of CC18

2.3.2 接種量對氯霉素降解率的影響

圖5為不同接種量下CC18對氯霉素的去除效果和生長情況。當接種量為4%時,該菌對20 mg/L氯霉素的降解效果最佳,去除率為15.5%。

圖5 不同接種量下CC18對氯霉素的降解效果(a)和生長情況(b)Figure 5 Effect of different inoculations on the degradation efficiency (a) and growth (b) of CC18

2.3.3 pH值對氯霉素降解率的影響

圖6為CC18的接種量為4%,不同pH值下其對20 mg/L氯霉素的降解效果和生長情況。當pH值為7時,該菌對氯霉素的降解效果和生長情況均最佳。因此,CC18生長和降解氯霉素的最佳pH值為7。

圖6 不同pH值下CC18對氯霉素的降解率(a)和生長情況(b)Figure 6 Effect of different pH values on the degradation efficiency(a) and growth (b) of CC18

2.3.4 溫度對氯霉素降解率的影響

圖7為CC18的接種量為4%,培養(yǎng)基的pH值為7,不同培養(yǎng)溫度下CC18對20 mg/L氯霉素的降解率。當溫度為28 ℃時,該菌的生長情況和對氯霉素的降解效果最佳,去除率為22.9%。因此,CC18生長和降解氯霉素的最佳溫度為28 ℃。

圖7 不同培養(yǎng)溫度下CC18對氯霉素的降解率(a)和生長情況(b)Figure 7 Effect of different temperatures on the degradation efficiency (a) and growth (b) of CC18

2.4 響應面法優(yōu)化CC18降解氯霉素的效果

2.4.1 回歸方程擬合及方差分析

采用 Design-Expert 12 軟件對所得數(shù)據(jù)進行二次回歸分析,回歸模型方差分析結(jié)果見表2,對各因素回歸擬合后,得到二次回歸方程如下:

表2 回歸模型方差分析Table 2 Analysis of variance of regression model

Y=26.27-1.75A+3.88B+3.08C-2.75AB-2.42AC+0.394 4BC-7.62A2-6.27B2-1.52C2,R2=0.922 3,由方差分析回歸方程模型高度顯著(P<0.01),失擬項的P=0.174 6>0.05,失擬項差異不顯著,一次項、平方項均對響應值有顯著性影響,因此,模型選擇正確。根據(jù)F值可以判斷3種影響因素的強弱,依次是B>C>A。其中,一次項B,二次項A2和B2的P<0.01,達到高度顯著水平;一次項C的P<0.05,達到顯著水平。

2.4.2 響應曲面和等高線

接種量、pH值和溫度這3個因素交互作用對CC18降解氯霉素效果的影響見圖8～圖10。結(jié)果表明:在一定溫度條件下,隨著接種量不斷提高,CC18降解氯霉素的效率呈先升高后降低的趨勢;接種量與pH值對CC18降解氯霉素效率具有較大的影響,呈拋物線式的變化;在溫度一定的情況下,隨著pH值的增加,CC18降解氯霉素的效率呈先升高后降低的趨勢。

圖8 接種量與溫度對氯霉素降解率的三維曲面圖(a)與等高線圖(b)Figure 8 Three dimensional curved surface diagram (a) and contour diagram (b) of the effect of inoculation amount and temperature on the degradation rate of chloramphenicol

圖9 接種量與pH值對氯霉素降解率的三維曲面圖(a)與等高線圖(b)Figure 9 Three dimensional curved surface diagram (a) and contour diagram (b) of inoculation amount and pH value on chloramphenicol degradation rate

圖10 溫度與pH值對氯霉素降解率的三維曲面圖(a)與等高線圖(b)Figure 10 Three dimensional curved surface diagram (a) and contour diagram (b) of temperature and pH value on chloramphenicol degradation rate

2.4.3 驗證試驗

根據(jù) Design-Expert 12 軟件的分析結(jié)果,得到CC18降解20 mg/L氯霉素的最優(yōu)條件:接種量3.6%,pH 7.6,溫度30 ℃,理論降解率28.2%。經(jīng)試驗驗證后,其實際降解率為30.6%。與理論值接近,表明該模型能很好地優(yōu)化CC18降解氯霉素的條件。

3 討論

盡管抗生素的抑菌作用會增加生物處理的難度,然而生物強化因其經(jīng)濟、高效、環(huán)保等優(yōu)勢逐漸成為治理環(huán)境中抗生素污染的重要手段之一。目前,已有一些能夠降解氯霉素的微生物(表3)。如從魚塘沉積物中馴化、篩選出氯霉素降解菌PseudomonasmigulaCSFO-3,7 d時對100 mg/L氯霉素的降解率為29.0%[16];從被氯霉素污染的南明河水中篩選到 2 株氯霉素降解菌:嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)和惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida),14 d時惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida)對50 μg/L氯霉素去除率為89.5%,而嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)對50 μg/L氯霉素去除率僅為13.8%;從水產(chǎn)養(yǎng)殖池塘沉積物中分離出的銅綠假單胞菌,7 d時對60 mg/L氯霉素的降解率為29.0%[17]。本研究從處理氯霉素廢水的生物接觸氧化反應器內(nèi)活性污泥中篩選到的墨西哥假單胞菌PseudoxanthomonasmexicanaCC18,1 d時對20 mg/L氯霉素去除率為30.6%。這些氯霉素的降解菌大多歸屬于假單胞菌屬,但是墨西哥假單胞菌在氯霉素降解中的作用尚未見報道。

表3 部分氯霉素降解菌的降解效果Table 3 The degradation effect of some chloramphenicol degrading bacteria

雖然本研究篩選的墨西哥假單胞菌CC18對氯霉素的降解效果不如已報道的菌株LMS-CY[12]和CSFO-3[16],這可能與菌屬、篩選條件和實驗方法等因素有關(guān),但是墨西哥假單胞菌CC18對20 mg/L氯霉素的降解速度較快,24 h能達到30.6%的降解率,明顯短于嗜水氣單胞菌和惡臭假單胞菌所需的14 d。Lin等[18]從活性污泥中分離出的假單胞菌CE21和CE22,24 h時CE21對100 mg/L頭孢氨芐的降解率為46.7%,而假單胞菌CE22的降解率高達90%,進一步表明假單胞菌屬在抗生素的降解方面具有重要作用。綜上所述,這些氯霉素降解菌為解決氯霉素濫用后污染水體的生物處理提供了菌種基礎,但氯霉素的降解機制以及實際應用等方面仍需要大量研究。本研究首次發(fā)現(xiàn)墨西哥假單胞菌CC18具有降解氯霉素的作用,有望制備成微生物菌劑應用于氯霉素污染水體的生物修復[19],不僅可有效減少環(huán)境中殘留的氯霉素,也為污染水體的環(huán)境生物治理打下基礎,具有很大的潛在應用價值[20]。

4 結(jié)論

本研究從處理氯霉素廢水的生物接觸氧化反應器內(nèi)活性污泥中分離出一株氯霉素降解菌CC18,結(jié)合其形態(tài)觀察、生理生化特性和16S rRNA基因序列分析,CC18歸屬于墨西哥假單胞菌(Pseudoxanthomonasmexicana)。當其接種量為4%,pH值為7,溫度為28 ℃時,24 h該菌株對20 mg/L氯霉素的降解率為22.9%。通過響應面試驗進一步優(yōu)化,當接種量3.6%,pH值為7.6,溫度30 ℃時,24 h時其對20 mg/L氯霉素的降解率為30.6%。本研究首次發(fā)現(xiàn)墨西哥假單胞菌屬具有降解氯霉素的功能,不僅豐富了氯霉素降解微生物菌種庫,也為微生物治理復雜環(huán)境的抗生素污染提供更多選擇。