楚德軍 劉建平

摘要：在體外培養(yǎng)的過(guò)程中，細(xì)胞系是影響球蟲(chóng)發(fā)育的主要因素。本研究主要對(duì)比不同細(xì)胞系對(duì)于毒害艾美耳球蟲(chóng)發(fā)育的影響。5種不同的細(xì)胞系在37℃，5% CO2在6孔板中培養(yǎng)至細(xì)胞融合。將純化好的子孢子在分別37℃和 41℃入侵細(xì)胞。利用HE 染色地方法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)毒害艾美耳球蟲(chóng)的發(fā)育程度。所有的細(xì)胞系均有球蟲(chóng)入侵。VERO細(xì)胞中，毒害艾美耳球蟲(chóng)的發(fā)育最好。在VERO細(xì)胞培養(yǎng)基中加入不同濃度血清和葉酸，觀察球蟲(chóng)發(fā)育情況，確定最佳實(shí)驗(yàn)條件，為下一步研究做好準(zhǔn)備。

關(guān)鍵詞：毒害艾美耳球蟲(chóng)；細(xì)胞培養(yǎng)；VERO細(xì)胞

中圖分類號(hào)：S858.3 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B 文章編號(hào)：2096-3637（2017）04-0001-03

1 概述

毒害艾美耳球蟲(chóng)是一種危害養(yǎng)雞業(yè)的重要胞內(nèi)寄生蟲(chóng)，在研究球蟲(chóng)分子生物學(xué)、免疫學(xué)、生物化學(xué)、細(xì)胞培養(yǎng)學(xué)和抗藥性研究中，體外細(xì)胞培養(yǎng)顯然起到至關(guān)重要的作用。在體外培養(yǎng)過(guò)程中，對(duì)球蟲(chóng)的生長(zhǎng)的影響較大的因素包括細(xì)胞系的選擇、環(huán)境溫度以及培養(yǎng)基。本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)比不同細(xì)胞系的子孢子入侵時(shí)間

2 方法

2.1 子孢子純化

2.1.1 卵囊破壁

卵囊計(jì)數(shù)后，3000 r/min，離心10 min棄上清，將沉淀加到組織研磨器中并在冰水中研磨。不斷在顯微鏡下觀察，直至90%左右的球蟲(chóng)卵囊破壁即可，3000 r/min，離心10 min棄去上清。

2.1.2子孢子脫囊

將含有孢子囊的溶液分別加入到A，B，C，D 4種不同配方的脫囊液中，40 ℃水浴，邊消化邊鏡檢，在顯微鏡下，不斷觀察脫囊情況，30 min后停止消化。

2.1.3子孢子的純化

配制 20%，30%，65%，70%，75%，80%的蔗糖溶液。先將65%，70%，75%，80%的蔗糖分別加到不同離心管中，再用滴管分別將20%，30%蔗糖溶液依次加到離心管中，并做好標(biāo)記。并將含有子孢子的脫囊液滴入，1 500 r/min，離心10 min，吸取2種濃度溶液間的白色條帶。加入PBS液3 000 r/min離心15 min洗滌蔗糖溶液，計(jì)算回收率（純化后子孢子數(shù)/脫囊后計(jì)數(shù)）。

2.1.4子孢子活性檢測(cè)

用不同的脫囊液脫囊的子孢子經(jīng)過(guò)同樣的方法純化后，將純化好的子孢子用PBS定容到2 mL，吸取一滴子孢子液滴在載玻片上再加入兩滴伊紅Y染液。2 min后在顯微鏡下觀察。計(jì)算子孢子的存活率（染色后未見(jiàn)伊紅顏色子孢子數(shù)/總子孢子數(shù)）。

2.2 雞胚成纖維細(xì)胞的制備

A 取9～11日齡雞胚，取出胚體置于滅菌平皿中，去掉內(nèi)臟、頭、四肢，PBS洗2次。

B 將胚體轉(zhuǎn)移至小燒杯中，充分剪碎，PBS洗2次，吸棄PBS。

C 加入2mL0.25%胰蛋白酶，37℃消化15min左右。

D 輕輕吸棄胰酶，PBS洗2次，吸棄PBS。

E 加少量生長(zhǎng)液輕輕吹打，將上清細(xì)胞篩過(guò)濾；再用生長(zhǎng)液將剩余組織塊吹開(kāi)，過(guò)濾。

F 過(guò)濾后的細(xì)胞懸液稀釋10倍，進(jìn)行計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度為40～60萬(wàn)/mL。

G 加入50mL細(xì)胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。

H 37℃培養(yǎng)，24～28h形成致密單層。

2.3 雞腎原代細(xì)胞培養(yǎng)

A 取9～11日齡雞，無(wú)菌環(huán)境中取腎。

B 將腎轉(zhuǎn)移至小燒杯中，充分剪碎，PBS洗2次，吸棄PBS。

C 加入5倍體積0.25%胰蛋白酶，37℃消化30min左右。

D 輕輕吸棄胰酶，PBS洗2次，吸棄PBS。

E 加少量生長(zhǎng)液輕輕吹打，將上清細(xì)胞篩過(guò)濾；再用生長(zhǎng)液將剩余組織塊吹開(kāi)，過(guò)濾。

F 過(guò)濾后的細(xì)胞懸液稀釋10倍，進(jìn)行計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度為40～60萬(wàn)/mL。

G 加入50mL細(xì)胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。

H 37℃培養(yǎng)，24～28h形成致密單層。

2.4 傳代細(xì)胞系細(xì)胞代培養(yǎng)

2.4.1凍存細(xì)胞復(fù)蘇：液氮中凍存的MDBK細(xì)胞在37℃水浴中迅速溶解（1min之內(nèi)）。加入細(xì)胞瓶中，再加入含有血清、雙抗的培養(yǎng)基，37℃，5%CO2培養(yǎng)12h后，倒掉培養(yǎng)基，換入新的含有雙抗、血清的培養(yǎng)基。

2.4.2細(xì)胞傳代：待細(xì)胞瓶底的細(xì)胞鋪滿80%后，將培養(yǎng)基倒掉，用D-Hanks清洗3次，加入少量胰酶，37℃，5%CO2消化3min，待細(xì)胞在顯微鏡下的形態(tài)為圓形后，加入培養(yǎng)基小心吹打均勻，再放入37℃，5%CO2中培養(yǎng)。

2.5 入侵時(shí)間比對(duì)試驗(yàn)

A 用胰酶37℃，5%CO2消化3min消化下所需細(xì)胞，進(jìn)行計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度為50萬(wàn)/mL。

B將泡過(guò)酸，洗凈高壓好的蓋玻片加入6孔板中，每孔加入細(xì)胞懸液2mL，分別在37℃，5%CO2和41℃，5%CO2培養(yǎng)2h。

C將純化好的子孢子計(jì)數(shù)，每孔接入10萬(wàn)卵囊。

D分別在37℃，5%CO2和41℃，5%CO2培養(yǎng)每隔0.5h進(jìn)行HE染色觀察入侵時(shí)間。

2.6 入侵率比對(duì)試驗(yàn)

A 用胰酶37℃，5%CO2消化3min消化下所需細(xì)胞，進(jìn)行計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度為50萬(wàn)/mL。

B將泡過(guò)酸，洗凈高壓好的蓋玻片加入6孔板中，每孔加入細(xì)胞懸液2mL，分別在37℃，5%CO2和41℃，5%CO2培養(yǎng)2h。

C將純化好的子孢子計(jì)數(shù)，每孔接入10萬(wàn)卵囊。

D分別在37℃，5%CO2和41℃，5%CO2培養(yǎng)24h進(jìn)行HE染色觀察入侵率。

2.7 HE染色

A 用胰酶37℃，5%CO2消化3min消化下所需細(xì)胞，進(jìn)行計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度為50萬(wàn)/mL。

B將泡過(guò)酸，洗凈高壓好的蓋玻片加入6孔板中，每孔加入細(xì)胞懸液2mL，分別在37℃，5%CO2和41℃，5%CO2培養(yǎng)2h。

C將純化好的子孢子計(jì)數(shù)，每孔接入10萬(wàn)卵囊。

D分別在37℃，5%CO2和41℃，5%CO2培養(yǎng)培養(yǎng)每隔0.5h進(jìn)行HE染色觀察入侵時(shí)間。

2.8 培養(yǎng)基成分對(duì)比試驗(yàn)

A將VERO細(xì)胞在兩塊6孔板中培養(yǎng)至融合。

B將純化好的子孢子計(jì)數(shù)，每孔接入10萬(wàn)卵囊。

C六個(gè)孔中加入不同的培養(yǎng)基，并將每塊板的PH值分別調(diào)整為7和7.6

D如上圖所示，分別在不同培養(yǎng)中培養(yǎng)每隔0.5h進(jìn)行HE染色觀察入侵情況。

3 結(jié)果

3.1 不同細(xì)胞系入侵時(shí)間

從結(jié)果可以看出，細(xì)胞系在入侵時(shí)間上對(duì)子孢子的影響沒(méi)有顯著性差異，但是明顯溫度可以影響子孢子的入侵時(shí)間。在41℃下，子孢子能夠更快的入侵細(xì)胞。

3.2 不同細(xì)胞系不同溫度入侵率

從試驗(yàn)結(jié)果可以看出在37℃時(shí)，VERO細(xì)胞的入侵率是最高的，其次就是PK-15細(xì)胞，其他3種細(xì)胞差異不是很顯著。（見(jiàn)表2-4）

從試驗(yàn)結(jié)果可以看出在41℃時(shí)，PK15和VERO的入侵率最高，雞胚成纖維細(xì)胞和PK細(xì)胞入侵率較高，雞腎細(xì)胞的入侵率最低。（見(jiàn)表2-5）

從圖中可以看到除PK，MDBK細(xì)胞外其他3種細(xì)胞在41℃時(shí)的入侵率較高，但總體比較VERO細(xì)胞的入侵率無(wú)論是在41℃還是在37℃下培養(yǎng)入侵率都是較高的。（見(jiàn)圖2-2）

3.3 培養(yǎng)基中添加不同成分的入侵率

4 討論

柔嫩艾美爾球蟲(chóng)體外培養(yǎng)技術(shù)中， MDBK是較為良好的上皮細(xì)胞系[1]，但卻是布氏艾美爾球蟲(chóng)在MDBK細(xì)胞中發(fā)育不是十分良好[2]，而且小隱孢子蟲(chóng)在MDBK中無(wú)法發(fā)育。BHK被廣泛用于培養(yǎng)艾美爾，并且認(rèn)為是優(yōu)于雞腎細(xì)胞和火雞腎細(xì)胞。Tierney 認(rèn)為BHK，MDBK，RK-13明顯適合球蟲(chóng)生長(zhǎng)，較適宜用來(lái)體外培養(yǎng)柔嫩艾美爾球蟲(chóng)。有證據(jù)表明MDBK和Hep2細(xì)胞較適合體外培養(yǎng)弓形蟲(chóng)，VERO，BHK，RK13，RDA，CER對(duì)于弓形蟲(chóng)的體外培養(yǎng)不是很好。HCT-8細(xì)胞被認(rèn)為是最適合體外培養(yǎng)小隱孢子蟲(chóng)，但有人比對(duì)小隱孢子蟲(chóng)入侵MDCK， MA-104， Hep-2 和Vero后MDCK最易于感染，在MA-104細(xì)胞中小隱孢子蟲(chóng)無(wú)法進(jìn)行有性生殖，VERO細(xì)胞入侵最少而且無(wú)法形成滋養(yǎng)體。也有研究認(rèn)為VELI細(xì)胞在體外培養(yǎng)小隱孢子蟲(chóng)得到的卵囊在感染小鼠時(shí)的感染力更強(qiáng)，更適于體外培養(yǎng)小隱孢子蟲(chóng)。弓形蟲(chóng)在Hela細(xì)胞中培養(yǎng)可以產(chǎn)生大量的速殖子。從實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可以看出雖然子孢子在入侵時(shí)間上VERO時(shí)間都較短，但差異并不是十分顯著，可見(jiàn)在毒害艾美爾球蟲(chóng)體外培養(yǎng)中細(xì)胞系的影響不是很大。

溫度對(duì)球蟲(chóng)的生長(zhǎng)也有很大影響以LMH，BHK ，MDBK，HCT-8，VERO，CRFK， PK-15，RK-13，IEC-6 為載體時(shí)，41℃比較適宜球蟲(chóng)生長(zhǎng)，而以Caco-2和MDCK為載體時(shí)37℃時(shí)比較適宜球蟲(chóng)生長(zhǎng)。因?yàn)榍蛳x(chóng)的自然宿主的體溫是41℃。有研究證明在室溫和37℃時(shí)體外培養(yǎng)弓形蟲(chóng)明顯影響弓形蟲(chóng)的感染率，而且有研究認(rèn)為29℃體外培養(yǎng)弓形蟲(chóng)能夠產(chǎn)生更多的速殖子。但是在體外培養(yǎng)肉孢子蟲(chóng)時(shí)溫度對(duì)于體外培養(yǎng)的影響并不是很大，起到主要作用的是細(xì)胞的種類。然而目前沒(méi)有對(duì)毒害艾美耳球蟲(chóng)體外培養(yǎng)細(xì)胞系的相關(guān)報(bào)道。從本實(shí)驗(yàn)的研究成果可見(jiàn)，毒害艾美爾球蟲(chóng)在37℃時(shí)的入侵時(shí)間明顯比41℃時(shí)間要長(zhǎng)，這可能是由于雞的體溫為41℃，雖然37℃更適宜細(xì)胞生長(zhǎng)，但如果需要進(jìn)行毒害艾美爾球蟲(chóng)體外培養(yǎng)試驗(yàn)建議在子孢子入侵和后續(xù)培養(yǎng)過(guò)程中進(jìn)行溫度調(diào)節(jié)，更加接近自然狀態(tài)。

培養(yǎng)基也是影響球蟲(chóng)生長(zhǎng)的一個(gè)重要因素。有研究證明添加有5%水解乳蛋白的MEM細(xì)胞維持培養(yǎng)液被認(rèn)為是適宜柔嫩艾美耳球蟲(chóng)在體外培養(yǎng)細(xì)胞上發(fā)育的培養(yǎng)系統(tǒng)。在THP-1體外培養(yǎng)小隱孢子蟲(chóng)時(shí)在培養(yǎng)基中加入腺苷或是肌苷培養(yǎng)72h可以提高卵囊的產(chǎn)出，在MDBK細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)加入肌苷培養(yǎng)24h也有同樣效果。用有報(bào)道認(rèn)為培養(yǎng)基中加入葉酸可以提高球蟲(chóng)的表達(dá)量。而且pH值也可以影響球蟲(chóng)的產(chǎn)量，一般認(rèn)為pH7.4最適宜球蟲(chóng)生長(zhǎng)。血清的含量明顯影響了弓形細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中的增殖率。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出在培養(yǎng)基中添加肌苷可以提高子孢子的入侵率，且與其他各種添加成分比效果顯著。

綜上所述，筆者認(rèn)為在體外培養(yǎng)毒害艾美爾球蟲(chóng)過(guò)程中，采用VERO細(xì)胞在41℃環(huán)境中，培養(yǎng)基中添加葉酸對(duì)下一步的試驗(yàn)更為有利。

參考文獻(xiàn)

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[2] Girouard， D，Gallant， J，Akiyoshi， D. Eet Failure to propagate Cryptosporidium spp. in cell-free culture [J] J Parasitol 2006，92（2）：399-400.