冼康華 付傳明 何金祥 龔慶芳 蘇江 黃寧珍

摘要： 該研究以含有GFP和GUS基因的質(zhì)粒和農(nóng)桿菌為載體，采用花粉管通道法對鐵皮石斛進行轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究。結(jié)果表明：（1）鐵皮石斛種子萌發(fā)和原球莖生長對卡那霉素的最低致死濃度分別為90和150 mg·L1。進一步研究證實，在篩選轉(zhuǎn)化種子和原球莖時，可分別向培養(yǎng)基中添加100和150 mg·L1的卡那霉素進行選擇培養(yǎng)。（2）以攜帶GFP和GUS基因的質(zhì)粒（pSuper1300和pBI121）和農(nóng)桿菌為載體，用無菌去離子水重懸質(zhì)粒pSuper1300和pBI121至濃度為100 ng·μL1，用2%蔗糖+1/2MS+0.1% silwet77+0.1% AS或5%蔗糖+0.1% silwet77+0.1 mmol·L1 AS重懸攜帶質(zhì)粒pSuper1300和pBI121的農(nóng)桿菌至菌液濃度為OD600=0.7～0.8；在授粉后0.5～2.5 h內(nèi)使用柱頭滴加法導(dǎo)入攜帶外源基因的質(zhì)?；蜣r(nóng)桿菌溶液，收集成熟的轉(zhuǎn)化種子，經(jīng)選擇培養(yǎng)及PCR檢測發(fā)現(xiàn)，幾乎所有處理的轉(zhuǎn)化材料均能檢測出外源GFP和GUS基因片段。另外，與農(nóng)桿菌相比，以質(zhì)粒為載體進行轉(zhuǎn)化，可獲得更高的結(jié)實率。該研究結(jié)果為鐵皮石斛的基因工程育種提供了參考。

關(guān)鍵詞： 鐵皮石斛， 花粉管通道法， 質(zhì)粒， 農(nóng)桿菌， 轉(zhuǎn)基因

中圖分類號： Q943.2， Q785文獻標(biāo)識碼： A文章編號： 10003142（2017）09110110

Abstract： The transgenic technology of Dendrobium officinale was studied by using pollentube pathway with plasmid and agrobacterium vectors as target genes delivery. The main results were summarized as follows： （1） The minimum lethal concentration of kanamycin to seed germination and protocorm growth were 90 and 150 mg·L1 respectively. Further study showed that 100 and 150 mg·L1 kanamycin could be added for selecting transgenic seeds and protocorms during selective culture in vitro respectively. （2） Plasmid and agrobacterium contained GFP or GUS gene was transferred into D. officinale via pollentube pathway. The technology and method were summarized as follows： Collected target plasmid （pSuper1300 and pBI121） and agrobacterium which contained GFP or GUS gene； resuspended the plasmid pSuper1300 and pBI121 to concentration of 100 ng·μL1 with thrice distilled water， while resuspended the agrobacteria which carried plasmid pSuper1300 and pBI121 to OD600=0.7-0.8 with the solution of 2% sucrose+1/2MS+0.1% silwet77+0.1% AS or 5% sucrose+0.1% silwet77+0.1 mmol·L1 AS respectively； during 0.5-2.5 h after artificial pollination， used stigma dripping method to transfer into plasmids and agrobacteria which contained target genes； collect the mature seeds； selective culture and PCR certificated that the resistant materials of almost all treatments were integrated GFP and GUS genes. Moreover， compared with agrobacterium as target gene delivery， the plasmid gene delivery could harvest more fruits.

Key words： Dendrobium officinale， pollentube pathway， plasmid， agrobacterium， transgene

鐵皮石斛（Dendrobium officinale）為蘭科（Orchidaceae）石斛屬（Dendrobium）多年生草本植物（張啟香和方炎明，2005），是《中華人民共和國藥典》中收載的5種石斛屬植物之一，被稱為石斛中的極品（邵華等，2004），有“中華九仙草”之首的美譽，是我國傳統(tǒng)的名貴中藥材，具有抗腫瘤、提高免疫力、降血糖、抗衰老等作用。由于鐵皮石斛生長速度緩慢，對生長環(huán)境要求又十分苛刻，自然產(chǎn)量極為稀少，加上長期無節(jié)制的采集，致使天然的鐵皮石斛瀕臨滅絕。利用生物技術(shù)進行人工繁殖和種質(zhì)改良是解決這一問題的有效途徑。目前，鐵皮石斛組織培養(yǎng)技術(shù)已日趨成熟，但由于鐵皮石斛野生資源繁多、品質(zhì)良莠不齊，加之育種盲目、育種技術(shù)研究滯后，導(dǎo)致市場缺乏優(yōu)良、富有特色的鐵皮石斛新品種，鐵皮石斛產(chǎn)業(yè)發(fā)展緩慢（鄭希龍等，2011）。為了適應(yīng)鐵皮石斛規(guī)?；耘嗟纳a(chǎn)需要，保障鐵皮石斛產(chǎn)業(yè)的持續(xù)發(fā)展，開展加強鐵皮石斛抗病抗逆能力及藥用成分含量高的優(yōu)良品種的育種研究工作，迫在眉睫。常用的鐵皮石斛育種方法有雜交育種、誘變育種、倍性育種及基因工程育種。其中，基因工程育種以其目的明確而受到青睞。

目前，植物遺傳轉(zhuǎn)化方法常用的有農(nóng)桿菌侵染法、基因槍法及花粉管通道法等（胡峰等，2015）。由于鐵皮石斛屬于單子葉植物，對農(nóng)桿菌不敏感，近年來利用一些添加物如AS雖然獲得不少成功例子（石彩娟，2013）。但是，轉(zhuǎn)化率普遍不高，獲得的轉(zhuǎn)化植株少，且使用農(nóng)桿菌侵染法對植株損害大；基因槍法受體雖來源廣泛，但易形成嵌合體，多基因拷貝的整合易出現(xiàn)共抑制和基因沉默現(xiàn)象，加之所用的儀器設(shè)備昂貴，限制其廣泛應(yīng)用?；ǚ酃芡ǖ婪夹g(shù)簡單，不需要裝備精良的實驗室，常規(guī)育種易于掌握，在應(yīng)用時較為麻煩的是授粉前需要去雄套袋，而鐵皮石斛花結(jié)構(gòu)特殊，自然傳粉困難，在采用花粉管通道法時無需套袋去雄，且人工授粉操作方便，易于控制；鐵皮石斛種子和球莖小，可充分接觸篩選抗生素，利于轉(zhuǎn)化植株的篩選?；ǚ酃芡ǖ兰夹g(shù)由我國生物化學(xué)家周光宇等（1979）首次創(chuàng)立，指利用植物授粉后所形成的天然花粉管通道（花粉引導(dǎo)組織）經(jīng)珠心通道將外源DNA攜帶進入胚囊，轉(zhuǎn)化受精卵或其前后的生殖細胞（精子、卵子），由于它們?nèi)蕴幱谖葱纬杉毎诘念愃啤霸|(zhì)體”狀態(tài)，且正在進行活躍的DNA復(fù)制、分離和重組，所以很容易將外源DNA片段整合到受體基因組中，以達到遺傳轉(zhuǎn)化目的（崔紅等，2003）?；ǚ酃芡ǖ婪ㄊ且灾参镒陨砩诚到y(tǒng)為載體，直接將外源基因?qū)胫参?，克服了遠緣雜交的一些障礙，是一種簡便有效快速的育種途徑。自創(chuàng)立以來，花粉管通道法在水稻（張德建，2015）、玉米（孟憲玉等，2014）、西瓜（許珺然等，2014）等多種植物的轉(zhuǎn)基因育種中獲得成功，且被國內(nèi)近百家實驗室應(yīng)用（劉芳等，2007）。本研究旨在運用花粉管通道法將含有GFP及GUS基因片段的質(zhì)粒pSuper1300、pBI 121以及相應(yīng)的根癌農(nóng)桿菌導(dǎo)入鐵皮石斛，獲得轉(zhuǎn)化植株。目前，國內(nèi)外尚未見到相關(guān)報道。因此，可為鐵皮石斛的基因工程育種提供參考。

1材料與方法

1.1 材料

以廣西植物研究所生物技術(shù)與野生珍稀植物保育中心引種的鐵皮石斛浙江種群為轉(zhuǎn)基因受體材料。所用的根癌農(nóng)桿菌及質(zhì)粒表達載體均由中國農(nóng)大提供，抗性是利福平+慶大+卡那霉素，根癌農(nóng)桿菌菌型為GV3101，GFP表達載體為pSuper1300（圖1），GUS表達載體為pBI121（圖2）。

1.2 鐵皮石斛對卡那霉素的敏感性

1.2.1 原球莖對卡那霉素的敏感性配制培養(yǎng)基1/2 MS+NAA 0.2 mg·L1+香蕉 6%+AC 0.1%（pH6.0），高壓滅菌后冷卻至60 ℃左右，加入不同濃度梯度的硫酸卡那霉素（表1）；每個處理3瓶，搖勻冷卻后，接入浙江種群的鐵皮石斛原球莖，每瓶接種原球莖20粒；暗培養(yǎng)3 d后，轉(zhuǎn)到溫度（28±3）℃、光照時間10～12 h·d1、光照強度30～40 μmol·m-2·s1的條件下培養(yǎng)，每隔一段時間觀測成活率，以不含抗生素的處理為對照。

1.2.2 種子萌發(fā)對卡那霉素的敏感性將成熟的鐵皮石斛種子，無菌播種于含0、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100 mg·L1卡那霉素的萌發(fā)培養(yǎng)基1/2 MS+NAA 0.2 mg·L1+香蕉 6%+AC 0.1%（pH6.0）上，每個濃度各3瓶，暗培養(yǎng)2～3 d后，轉(zhuǎn)到溫度（28 ± 3）℃、光照時間10～12 h·d1、光照強度30～40 μmol·m2·s1的條件下培養(yǎng)，定期觀測種子的萌發(fā)情況，確定致死和半致死濃度。

1.3 轉(zhuǎn)導(dǎo)目標(biāo)物及制備方法

本研究使用的目標(biāo)轉(zhuǎn)導(dǎo)物：（1）攜帶GFP和GUS基因片段的質(zhì)粒pSuper1300和PbI 121；（2）含有質(zhì)粒pSuper1300或PbI121的根癌農(nóng)桿菌。

1.3.1 根癌農(nóng)桿菌活化及培養(yǎng)在加有kan 50 mg·L1，rif 25 mg·L1的LB（pH7.4）平板上劃線，28 ℃恒溫培養(yǎng)。48 h后，挑取農(nóng)桿菌單菌落接種于LB（pH7.4）液體培養(yǎng)基中（含卡那霉素和利福平各50 mg·L1），于28 ℃、200 r·min1振蕩培養(yǎng)。

1.3.2 大量質(zhì)粒的制備將含目的基因片段GFP、GUS的質(zhì)粒pSuper1300和PbI121轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞（購自天根生物公司）中，制備大腸桿菌轉(zhuǎn)化細胞。具體操作方法按照產(chǎn)品說明書進行（操作均按無菌條件的標(biāo)準(zhǔn)進行）。挑取轉(zhuǎn)化得到的大腸桿菌菌落接種于LB（pH7.4）液體培養(yǎng)基中（含100 mg·L1卡那霉素和25 mg·L1利福平），于28 ℃、200 r·min1振蕩培養(yǎng)至OD600值為1.0時，離心收集菌體。質(zhì)粒提取使用天根質(zhì)粒小提中量試劑盒（TIANprep Midi Plasmid Kit離心柱型）進行，具體操作方法按照產(chǎn)品說明書進行。

1.4 轉(zhuǎn)化方法

花粉管通道法導(dǎo)入外源基因的主要技術(shù)方法：（1）柱頭滴加導(dǎo)入法；（2）子房注射法；（3）花粉粒攜帶法；（4）柱頭涂抹法。由于鐵皮石斛花較小，使用子房注射法操作比較困難，且易造成花朵的損傷，本研究主要使用的是柱頭滴加導(dǎo)入法。授粉方式：本研究采取種群間雜交的方法進行授粉，母本為鐵皮石斛浙江種群，父本為形態(tài)上與浙江種群差異較大的其它種群。人工授粉后0.5～2.5 h內(nèi)導(dǎo)入目標(biāo)物，定期觀測結(jié)實情況，統(tǒng)計結(jié)實數(shù)。

1.5 轉(zhuǎn)化植株的檢測

1.5.1轉(zhuǎn)化植株的篩選 將花粉管通道法導(dǎo)入外源基因后得到的種子，播種于含卡那霉素100 mg·L1（致死濃度）的萌發(fā)培養(yǎng)基中，暗培養(yǎng)2～3 d后，轉(zhuǎn)到溫度（28 ± 3）℃、光照時間10～12 h·d1、光照強度30～40 μmol·m2·s1的條件下培養(yǎng)，觀察種子萌發(fā)情況。45 d后，將已經(jīng)萌發(fā)的原球莖轉(zhuǎn)接到含150 mg·L1（致死濃度）卡那霉素的分化培養(yǎng)基中，進一步篩選轉(zhuǎn)化材料。

1.5.2 轉(zhuǎn)化植株的PCR檢測采用CTAB改良法（Doyle JJ & Doyle JL，1987）提取經(jīng)過兩次卡那霉素篩選存活的鐵皮石斛DNA，進行PCR檢測。

含GFP基因質(zhì)粒或農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化植株的PCR檢測引物序列為P2：ACAAGCTGGAGTACAACTACAA； P3：TACGAATTCCCGATCTAGTAAC。含GUS基因質(zhì)?；蜣r(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化植株P(guān)CR檢測引物序列為P2：TCGTCGGTGAACAGGTATGGAA；P3：AGTGAATTCCCGATCTAGTAAC。

PCR反應(yīng)總體系20 μL，使用GENEray即用型Taq酶PCR試劑盒。PCR擴增反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性1 min，94 ℃變性45 s，54 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，共35個循環(huán)后，72 ℃延伸7 min，4 ℃保存，PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增效果。

2結(jié)果與分析

2.1 鐵皮石斛對卡那霉素的敏感性

2.1.1 種子萌發(fā)對卡那霉素的敏感性培養(yǎng)基中添加卡那霉素，種子萌發(fā)明顯受到抑制，而且隨著濃度的增加，萌發(fā)所需要的時間越長。對照組（0 mg·L1）1周左右種子開始萌發(fā)；添加卡那霉素10～50 mg·L1的處理，30 d后才觀測到淺黃色的胚狀體長出；添加90 mg·L1以上的處理組，種子發(fā)白。60 d后觀測，對照組均長出了嫩葉；添加60 mg·L1卡那霉素以下的處理組， 球莖膨大、 部分長出了小葉；添加70～80 mg·L1的處理組，極少數(shù)能發(fā)育為淺綠色球莖；添加90 mg·L1以上的處理組，種子基本全部死亡（圖3）。根據(jù)這一結(jié)果，在篩選轉(zhuǎn)化種子時，可添加100 mg·L1的卡那霉素到種子萌發(fā)培養(yǎng)基中進行選擇培養(yǎng)。

2.1.2 原球莖對卡那霉素的敏感性低濃度（10～50 mg·L1）處理組中，原球莖生長受到抑制，但仍有生長現(xiàn)象，顏色淺綠色；中等濃度60～80 mg·L1處理組中，原球莖能存活，但幾乎不生長，顏色淺黃綠色；高濃度的處理組（100 mg·L1以上）中，原球莖生長受到明顯抑制，絕大部分發(fā)白死亡；當(dāng)卡那霉素濃度達到150 mg·L1時，原球莖幾乎全部變白死亡，如圖4所示。根據(jù)這一結(jié)果，在第二次篩選轉(zhuǎn)化球莖時，可添加濃度為150 mg·L1的卡那霉素到培養(yǎng)基中進行選擇培養(yǎng)。

2.2 轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌和質(zhì)粒的制備

2.2.1 攜帶目的基因農(nóng)桿菌的制備通過活化及富集培養(yǎng)至菌液OD600值為0.4～0.6時，離心收集菌體，以2% 蔗糖+1/2 MS+0.1% silwet77+0.1% AS或5% 蔗糖+0.1% silwet77+0.1 mmol·L1 AS為懸浮液重懸至OD值0.5～1.0，直接滴加于柱頭。

2.2.2 攜帶目的基因質(zhì)粒的制備將質(zhì)粒pSuper1300、質(zhì)粒pBI121分別導(dǎo)入大腸桿菌感受態(tài)細胞，取100 μL菌液均勻涂布于含卡那霉素和利福平各50 mg·L1的LB培養(yǎng)基中，28 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，培養(yǎng)基中長出明顯菌落，初步認(rèn)定目標(biāo)質(zhì)粒成功導(dǎo)入大腸桿菌感受態(tài)細胞并且能夠很好的表達。對轉(zhuǎn)化的大腸桿菌進行富集培養(yǎng)，離心收集菌體，提取質(zhì)粒DNA并PCR，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，證明質(zhì)粒pSuper1300及質(zhì)粒pBI121已整合到大腸桿菌感受態(tài)細胞中（圖5，圖6）。NanoDrop 2000/2000c微量紫外分光光度計測定質(zhì)粒DNA濃度，用無菌去離子水調(diào)整至所需濃度，直接滴加于柱頭。

2.3 花粉管通道介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法人工授粉

2.3.1 以農(nóng)桿菌為轉(zhuǎn)導(dǎo)物的人工授粉以含silwet77和AS、OD600為0.5～1.0農(nóng)桿菌重懸液，在人工授粉后0.5～2.5 h內(nèi)，使用柱頭滴加法導(dǎo)入攜帶目的基因的根癌農(nóng)桿菌，無需套袋，定時觀察授粉結(jié)實情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在用農(nóng)桿菌處理的360朵花中（花粉來源均為廣西玉林種鐵皮石斛），得到211顆果實，結(jié)實率為58.6%（表2）。

2.3.2 以質(zhì)粒為轉(zhuǎn)導(dǎo)物的人工授粉在導(dǎo)入質(zhì)粒pBI121時發(fā)現(xiàn)，隨著質(zhì)粒濃度的增加，授粉后得到的果實數(shù)隨之減少，說明高濃度的質(zhì)?？赡苡绊懯诜酆蟮木呀Y(jié)合。本實驗所導(dǎo)入質(zhì)粒的花朵數(shù)共480朵（花粉來源均為廣西玉林種鐵皮石斛），結(jié)實299顆，結(jié)實率為62.3%（表3）。

2.4 轉(zhuǎn)化植株的篩選及檢測

2.4.1 轉(zhuǎn)化植株的篩選（1）種子萌發(fā)過程的篩選（第一次篩選）：將經(jīng)轉(zhuǎn)化處理的成熟鐵皮石斛種子，無菌播種于含卡那霉素100 mg·L1的篩選培養(yǎng)基中培養(yǎng)，1周后發(fā)現(xiàn)幾乎全部處理都有淺黃色的胚狀體長出；4周后觀測發(fā)現(xiàn)，低濃度pSuper1300（10～20 ng·μL1）和pBI121（10～20 ng·μL1）質(zhì)粒轉(zhuǎn)化處理的類原球莖大部分生長停滯，顏色變黃；另外，OD600值為1、含質(zhì)粒pSuper1300農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化處理的部分球莖顏色也出現(xiàn)類似情況。余下的其它處理類原球莖逐漸膨大成淺綠色的原球莖?？梢姡蜐舛荣|(zhì)粒和高濃度農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化效果較差。根據(jù)上述結(jié)果初步判斷，以質(zhì)粒pSuper1300和pBI121為載體進行轉(zhuǎn)化，其適合的轉(zhuǎn)化濃度分別為40～600 ng·μL1和40～100 ng·μL1；以含pSuper1300和pBI121質(zhì)粒的農(nóng)桿菌為載體進行轉(zhuǎn)化，其適合的轉(zhuǎn)化濃度分別為OD600=0.5～0.9和OD600=0.5～1.0。

（2）原球莖培養(yǎng)過程的篩選（第二次篩選）：播種45 d后，將各處理萌發(fā)長出的原球莖轉(zhuǎn)接到添加150 mg·L1卡那霉素的培養(yǎng)基中，進一步篩選轉(zhuǎn)化植株。培養(yǎng)一段時間后發(fā)現(xiàn)，各處理組經(jīng)第一次篩選出來的球莖均能繼續(xù)存活，大部分能繼續(xù)發(fā)育（圖7）。假設(shè)每個處理存活的原球莖均為轉(zhuǎn)化成功材料，每顆果實內(nèi)含10 000粒種子（金銀兵，2009）。各處理的轉(zhuǎn)化率如表2、表3所示，結(jié)果顯示，當(dāng)菌液OD600=0.7～0.8、質(zhì)粒濃度為100 ng·μL1時，轉(zhuǎn)化率最高，其中含質(zhì)粒pSuper1300（GFP基因）的農(nóng)桿菌菌液OD600=0.7～0.8處理時轉(zhuǎn)化率最高為5.0%，而含質(zhì)粒pBI121（GUS基因）的農(nóng)桿菌處理轉(zhuǎn)化率最高為1.52%；導(dǎo)入質(zhì)粒pSuper1300處理，轉(zhuǎn)化率最高為7.84%，而導(dǎo)入質(zhì)粒pBI121后，轉(zhuǎn)化率最高為6.0%。

2.4.2 轉(zhuǎn)化材料的PCR檢測外源GFP和GUS基因的轉(zhuǎn)化： 提取經(jīng)兩次卡那霉素選擇培養(yǎng)仍存活的植物材料的總DNA，以未經(jīng)轉(zhuǎn)化處理植株DNA為對照，進行PCR擴增，結(jié)果如圖8所示。從圖8可以看出，在600 bp處，對照未能擴增出相應(yīng)的條帶；而轉(zhuǎn)入GFP和GUS基因的各個處理均能擴增出明顯清晰的條帶，表明GFP和GUS基因片段已整合到鐵皮石斛基因組中。

2.5 花粉管介導(dǎo)的鐵皮石斛轉(zhuǎn)基因技術(shù)小結(jié)

收集攜帶GFP和GUS基因的質(zhì)粒（pSuper1300和pBI121）和農(nóng)桿菌；用無菌去離子水重懸質(zhì)粒pSuper1300和pBI121至濃度為100 ng·μL1，用2%蔗糖+1/2 MS+0.1% silwet77+0.1% AS或5% 蔗糖+0.1% silwet77+0.1 mmol·L1 AS重懸攜帶質(zhì)粒pSuper1300和pBI121的農(nóng)桿菌至菌液濃度為OD600=0.7～0.8；在授粉后0.5～2.5 h內(nèi)使用柱頭滴加法導(dǎo)入攜帶外源基因的質(zhì)?；蜣r(nóng)桿菌溶液，收集成熟的轉(zhuǎn)化種子，經(jīng)選擇培養(yǎng)及PCR檢測發(fā)現(xiàn)，幾乎所有處理的轉(zhuǎn)化材料均能檢測出外源GFP和GUS基因片段。另外，與農(nóng)桿菌相比，以質(zhì)粒為載體進行轉(zhuǎn)化，可獲得更高結(jié)實率。

3討論

花粉管通道技術(shù)可用于任何開花植物，不受受體物種、基因型和目的基因來源等因素的限制，無需組織培養(yǎng)、誘導(dǎo)再生等人工培養(yǎng)過程（侯麗霞等，2007），與目前使用較多的基因槍法和農(nóng)桿菌介導(dǎo)法相比，其技術(shù)操作簡單，普及和推廣容易，契合現(xiàn)代農(nóng)業(yè)日益追求的高效率要求，是一種行之有效的轉(zhuǎn)基因育種方法。自創(chuàng)立以來，花粉管通道技術(shù)在多種植物尤其是農(nóng)作物的轉(zhuǎn)基因育種中獲得了成功。本研究將花粉管通道技術(shù)運用于鐵皮石斛遺傳轉(zhuǎn)化中，在國內(nèi)外尚屬首例。

花粉管通道法進行遺傳轉(zhuǎn)化時，多數(shù)以攜帶外源基因質(zhì)粒為載體進行轉(zhuǎn)化（劉芳等，2007），而本研究發(fā)現(xiàn)攜帶外源基因的質(zhì)粒和農(nóng)桿菌，均可作為載體通過花粉管介導(dǎo)法對鐵皮石斛進行遺傳轉(zhuǎn)化。其中，與農(nóng)桿菌相比，以質(zhì)粒為載體獲得了更高的結(jié)實率，這與李卉和武天龍（2007）的研究結(jié)論一致。不同的植物導(dǎo)入外源基因的時間不同，選擇最佳的導(dǎo)入時間能有效地提高轉(zhuǎn)化效率。孟憲玉等（2014）在研究玉米花粉管通道法轉(zhuǎn)化外源基因時發(fā)現(xiàn)，在授粉18 h后進行轉(zhuǎn)化操作，易于外源DNA的進入和整合，從而完成轉(zhuǎn)化，而通過此方法對西瓜進行基因轉(zhuǎn)化，最佳轉(zhuǎn)化時間為授粉后24～27 h（許珺然等，2014）。本研究則發(fā)現(xiàn)運用花粉管通道介導(dǎo)法對鐵皮石斛進行遺傳轉(zhuǎn)化時，導(dǎo)入外源基因的適合時間為授粉后0.5～2.5 h。

本研究使用花粉管通道技術(shù)達到的最高轉(zhuǎn)化效率為7.84%，比武榮花等（2015）運用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化外源基因進入鐵皮石斛的轉(zhuǎn)化率低；但鐵皮石斛果實內(nèi)種子數(shù)以萬計，成功轉(zhuǎn)化植株的絕對數(shù)量并不低，因此，花粉管通道轉(zhuǎn)化不失為鐵皮石斛外源基因?qū)氲囊粋€有效方法，而且花粉管通道法克服了遠緣雜交的一些障礙，打破了種、屬間的限制，可以在不同科、屬、種的植物中廣泛篩選育種資源，進行更為遠緣的雜交育種，培育新品種或創(chuàng)造新物種，這為鐵皮石斛產(chǎn)業(yè)的發(fā)展提供了新的道路。因此，本研究仍具有重要的科學(xué)和應(yīng)用價值，通過對本方法的進一步研究和優(yōu)化，將為最終實現(xiàn)高效穩(wěn)定的鐵皮石斛外源基因?qū)敕绞教峁┛茖W(xué)依據(jù)。

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